基于PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路探討自擬英黃湯對(duì)膿毒癥大鼠的保護(hù)作用

郭軍利,陶愚磊,鄭佳麗,梅建強(qiáng),陳分喬,許文忠

膿毒癥是感染引起宿主反應(yīng)失調(diào),導(dǎo)致危及生命的器官功能損害的一組癥候群,病死率很高[1],其往往發(fā)生于嚴(yán)重感染、燒傷或創(chuàng)傷,同時(shí)也是休克、外科大手術(shù)等疾病常見的并發(fā)癥[2]。膿毒癥早期常合并單一器官功能障礙,當(dāng)炎性反應(yīng)加重,機(jī)體出現(xiàn)炎性反應(yīng)失控、血管內(nèi)皮功能障礙、凝血功能障礙、循環(huán)代謝障礙,最終導(dǎo)致多器官功能障礙,其中炎性反應(yīng)、凝血功能障礙、器官損傷貫穿膿毒癥整個(gè)疾病階段[3-4]。目前,西醫(yī)治療多采用液體復(fù)蘇、抗感染治療、血管活性藥物治療、連續(xù)血液凈化及對(duì)癥支持治療等治療措施,取得了一定的效果[5]。然而,大量使用抗生素會(huì)增加細(xì)菌的耐藥性,增加救治的難度,同時(shí)以免疫細(xì)胞、炎性介質(zhì)、凝血系統(tǒng)為治療靶點(diǎn)的最新研究亦未達(dá)到降低膿毒癥病死率的預(yù)期效果。中醫(yī)藥具有幾千年治療感染性疾病的歷史,大量證據(jù)表明中醫(yī)藥在治療膿毒癥方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。

自擬英黃湯是由全國名中醫(yī)梅建強(qiáng)教授在中醫(yī)理論基礎(chǔ)上結(jié)合多年的急危重癥臨床救治經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)立,且已應(yīng)用于臨床中治療膿毒癥患者,并取得了一定的療效[6],然而其作用機(jī)制尚不明確。多項(xiàng)研究顯示,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)/核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路是膿毒癥發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵通路,通過藥物干預(yù)PI3K/AKT/NF-κB通路被認(rèn)為是降低膿毒癥病死率的關(guān)鍵措施之一[7-8]。因此本研究運(yùn)用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)建立膿毒癥大鼠模型,基于PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路探討英黃湯對(duì)膿毒癥大鼠保護(hù)作用,為英黃湯更好在臨床當(dāng)中發(fā)揮治療作用提供支持,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康雄性SD大鼠240只,體質(zhì)量(150±20)g ,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2021-0011。在安靜環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,飼養(yǎng)環(huán)境溫度25℃,濕度50%～60%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(DWLL2019004)。

1.1.2 英黃湯藥物制備:蒲公英20 g,生大黃9 g,赤芍12 g,白芍12 g,清半夏6 g,茯苓20 g,地榆20 g,當(dāng)歸15 g,青皮15 g,仙鶴草20 g,川芎9 g,水蛭9 g,加入8倍體積水煎煮40 min,濃縮成2 g生藥/ml備用。上述中藥材飲片經(jīng)由河北中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部提供,符合2015版《中國藥典》相關(guān)規(guī)定。

1.1.3 主要試劑與儀器:大鼠白介素6(IL-6,貨號(hào):ml102828)、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α,貨號(hào):ml002859)、大鼠白介素1β(IL-1β,貨號(hào):ml028514)ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào):A045-4-2)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT,貨號(hào):C009-1)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST,貨號(hào):C0101-2-1)、血肌酐(SCr,貨號(hào):CO11-2-1)、尿素氮(BUN,貨號(hào):C013-2-1)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所?？俁NA提取試劑盒(貨號(hào):DP419)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):KR116-02)、SYBR擴(kuò)增試劑盒(貨號(hào):P205-02)均購自天根生化科技(北京)有限公司。PI3K抗體(貨號(hào):bs-10657R)、p-PI3K抗體(貨號(hào):bs-6417R)、AKT抗體(貨號(hào):bsm-33278M)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;p-AKT抗體(貨號(hào):28731-1-AP)、P65抗體(貨號(hào):80979-1-RR)、β-actin(貨號(hào):20536-1-AP)均購自Proteintech公司;p-P65抗體(貨號(hào):3033S)購自Cell Signaling Technology公司。地塞米松(貨號(hào):D8040)購于北京索萊寶科技有限公司。全自動(dòng)血液分析儀(型號(hào):Sysmex XT-2000iv)、光學(xué)顯微鏡(型號(hào):ECLIPSE E100)均購自Nikon公司;冷凍切片機(jī)(型號(hào):CM3050S)購于Leica公司。

1.2 分組與造模方法

1.2.1 動(dòng)物分組:2022年8—12月于河北省中醫(yī)藥科學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將240只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、地塞米松組、英黃湯低劑量組、英黃湯中劑量組及英黃湯高劑量組。其中模型組、地塞米松組、英黃湯低劑量組、英黃湯中劑量組及英黃湯高劑量組運(yùn)用CLP法建立膿毒癥模型,假手術(shù)組大鼠只切開腹壁并縫合,不進(jìn)行CLP。

1.2.2 膿毒癥大鼠模型的建立:運(yùn)用CLP建立膿毒癥大鼠動(dòng)物模型。術(shù)前12 h禁食不禁水,異氟烷氣體麻醉后前腹正中備皮,消毒腹部皮膚,于腹部正中做2 cm切口,取出盲腸后,游離腸系膜和盲腸,運(yùn)用3-0手術(shù)縫合線在盲腸末端距離回盲部5 mm處進(jìn)行結(jié)扎,于距結(jié)扎處遠(yuǎn)端闌尾根部兩側(cè)腸壁0.8～1.0 cm處,運(yùn)用注射器針頭(20G)做2次貫通穿孔,并擠出少量腸內(nèi)容物,之后于盲腸貫穿孔中放置3 mm×0.5 mm×30 mm引流條,之后將盲腸放回腹腔,縫合切口。

1.2.3 干預(yù)方法:造模后假手術(shù)組與模型組灌胃生理鹽水2 ml,每12 h灌胃1次。地塞米松組腹腔注射地塞米松1 mg/kg,每日1次。英黃湯低、中、高劑量組分別灌胃英黃湯8.77 g生藥/kg、17.53 g生藥/kg、35.06 g生藥/kg,每12 h灌胃1次,各組均連續(xù)給藥3 d。英黃湯中劑量為人等效劑量,低劑量是中劑量的1/2,高劑量是中劑量的2倍,動(dòng)物劑量和人等效劑量均根據(jù)體表面積折算[9]。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 大鼠生存率統(tǒng)計(jì):每組大鼠分別選出20只進(jìn)行生存率統(tǒng)計(jì),大鼠在接受CLP后,每天統(tǒng)計(jì)各組大鼠存活的數(shù)量,連續(xù)觀察7 d,生存率=存活大鼠數(shù)量/20×100%,根據(jù)生存率繪制生存曲線。

1.3.2 血清PLT、PT、APTT、TT、Fib檢測(cè):造模給藥72 h后,大鼠麻醉后固定,剖開腹腔,腹主動(dòng)脈取血,EDTA-K2抗凝真空采血管收集血液200 μl,輕輕混勻,室溫靜置15 min,全自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)(PLT);再用枸櫞酸鈉抗凝真空采血管收集血液200 μl輕輕混勻,使用全自動(dòng)血凝分析儀測(cè)定血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血酶原時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原(Fib)水平。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗液(BALF)收集及總蛋白測(cè)定、肺組織濕重/干重(W/D)比值測(cè)定:造模給藥72 h后,將大鼠麻醉后固定,剪開喉嚨處皮膚,用鑷子分離周圍組織,暴露大鼠氣管。取1 ml注射器針頭,剪掉磨平針尖,在大鼠甲狀軟骨處插入針尖,絲線結(jié)扎固定。將1 ml PBS分2次注射肺內(nèi),每次均停留1 min后回收?；厥盏腂ALF于4℃,2 500 r/min離心10 min,回收上清液凍存于-80℃?zhèn)溆?使用BCA試劑盒檢測(cè)BALF總蛋白含量。取右肺組織,稱濕重后,置于60℃烘干箱烘干48 h,達(dá)到恒重,計(jì)算肺W/D比值。

1.3.4 血清ALT、AST、SCr、BUN測(cè)定:腹主動(dòng)脈取血,輕輕混勻,室溫靜置15 min,使用全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定ALT、AST、SCr、BUN水平。

1.3.5 肺、肝、腎組織形態(tài)學(xué)測(cè)定:造模給藥72 h后,收集肺、肝、腎組織,清洗后置于4%多聚甲醛固定,脫水后進(jìn)行石蠟包埋,切片機(jī)切成3 μm厚的切片,常規(guī)HE染色,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下顯像,觀察各組大鼠組織病理改變。

1.3.6 血清IL-6、IL-1β、TNF-α測(cè)定:將收集到的大鼠血液室溫靜置后離心10 min,轉(zhuǎn)速3 000 r/min,收集血清。按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α指標(biāo)。

1.3.7 qRT-PCR檢測(cè)大鼠肺組織IL-6、IL-1β、TNF-α基因水平:造模給藥72 h后,取各組大鼠肺組織,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA作為模板,按照試劑盒說明分別加入引物和SuperReal PreMix Plus,反應(yīng)條件:95℃15 min,95℃20 s,56℃20 s,40循環(huán)。使用2-△△CT進(jìn)行數(shù)據(jù)定量分析。PCR引物見表1。

表1 IL-6、IL-1β、TNF-α、PCR引物序列

1.3.8 Western-blot檢測(cè)各組大鼠PI3K/AKT /NF-κB P65信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá):稱取肺組織樣品20 mg加入RIPA裂解液,然后12 000 r/min離心10 min后吸取上清至新的EP管中。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定得到的細(xì)胞上清液中蛋白質(zhì)含量,確保各樣品蛋白質(zhì)含量一致。各取20 μg樣品在密度為10%的分離膠進(jìn)行電泳。從凝膠中分離的目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移到已被甲醇激發(fā)的PVDF膜上,使膜在5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h,之后加入PI3K(1∶1 000)、p-PI3K(1∶1 000)、AKT(1∶5 000)、p-AKT(1∶5 000)、P65(1∶5 000)、p-P65(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)4℃孵育過夜。第2 d使用1′TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min。加入相應(yīng)二抗(1∶8 000),室溫孵育2 h。膜用1′TBST洗膜3次,每次5 min。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法使條帶可視化,以β-actin為內(nèi)參,并通過凝膠成像分析系統(tǒng)成像,使用Image-J軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠生存率比較 造模給藥7 d后,假手術(shù)組大鼠生存率為100%,模型組大鼠生存率為30.0%(6/20),地塞米松組大鼠35.0%(7/20),英黃湯低劑量組生存率為30.0%(6/20),英黃湯中劑量組40.0%(8/20),英黃湯高劑量組生存率為45.0%(9/20)。

2.2 各組大鼠血清PLT、PT、APTT、TT、Fib比較 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠血清PLT、Fib含量顯著減少(P<0.05),PT、APTT、TT時(shí)間顯著延長(P<0.05);與模型組相比,地塞米松組血清PLT、Fib含量顯著增加(P<0.05),PT、APTT、TT時(shí)間顯著縮短(P<0.05),英黃湯高、中劑量組血清PLT、Fib含量顯著增加(P<0.05),PT、APTT顯著縮短(P<0.05),英黃湯低劑量組PT、Fib水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);英黃湯各劑量組TT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與地塞米松組相比,英黃湯中、高劑量組PLT含量顯著增加(P<0.05),英黃湯低劑量組PT、APTT顯著延長,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清PLT、PT、APTT、TT、Fib比較

2.3 各組大鼠BALF中總蛋白及肺組織W/D比值比較 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠BALF中總蛋白含量顯著增加(P<0.05)、W/D比值顯著增大(P<0.05);與模型組相比,地塞米松組和英黃湯高、中劑量組BALF中總蛋白顯著減少(P<0.05)、W/D比值顯著減小(P<0.05),英黃湯低劑量組W/D比值降低(P<0.05);與地塞米松組相比,英黃湯高劑量組BALF中總蛋白含量、W/D比值顯著降低(P<0.05),英黃湯低劑量組BALF中總蛋白含量、W/D比值均升高(P<0.05),見表3。

表3 各組大鼠BALF中總蛋白及肺組織W/D比值比較

2.4 各組大鼠血清ALT、AST、SCr、BUN比較 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠ALT、AST、SCr、BUN含量顯著增加(P<0.05);與模型組相比,地塞米松組及英黃湯中、高劑量組ALT、AST、SCr、BUN含量均顯著降低,英黃湯低劑量組SCr水平降低(P<0.05);與地塞米松組相比,英黃湯高劑量組ALT、BUN含量均降低(P<0.05),英黃湯低劑量組SCr升高(P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠血清ALT、AST、SCr、BUN比較

2.5 各組大鼠肺、肝、腎組織病理結(jié)構(gòu)比較 肺組織HE染色結(jié)果表明,模型組大鼠肺組織肺泡壁增厚,毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺間質(zhì)充血伴有細(xì)胞浸潤;與模型組相比,地塞米松組、英黃湯各劑量組炎性細(xì)胞減少,肺泡組織結(jié)構(gòu)趨于完整,病理損傷減輕。肝組織HE染色結(jié)果表明，模型組大鼠肝細(xì)胞排列散亂,肝索紊亂,肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死,同時(shí)可觀察到明顯的炎性細(xì)胞浸潤;與模型組相比,地塞米松組、英黃湯各劑量組大鼠肝細(xì)胞排列較整齊,肝組織中炎性細(xì)胞浸潤均有所緩解。腎組織HE染色結(jié)果表明,模型組大鼠腎小球基底膜增生,腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤明顯;與模型組相比,地塞米松組、英黃湯各劑量組腎臟組織炎性反應(yīng)程度明顯減輕,見圖1。

圖1 各組大鼠肺、肝、腎組織病理結(jié)構(gòu)比較(HE染色,×200)

2.6 各組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α比較 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量均顯著升高(P<0.05);與模型組相比,地塞米松組、英黃湯各劑量組IL-6、TNF-α含量及英黃湯中、高劑量組IL-1β含量均降低(P<0.05);與地塞米松組相比,英黃湯低、中劑量組IL-6表達(dá)及低劑量組IL-1β表達(dá)均升高(P<0.05),見表5。

表5 各組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α比較

2.7 各組大鼠肺組織IL-6、IL-1β、TNF-α基因表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠肺組織中IL-6、IL-1β、TNF-α基因表達(dá)顯著增高(P<0.05);與模型組相比,地塞米松組、英黃湯各劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α基因表達(dá)顯著降低(P<0.05);與地塞米松組相比,英黃湯各劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α基因表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖2。

注:與假手術(shù)組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05。

2.8 各組大鼠PI3K/AKT/NF-κBP65信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 Western-blot結(jié)果表明,與假手術(shù)相比,模型組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-P65/P65比值顯著上調(diào)(P<0.01);與模型組相比,地塞米松組及英黃湯中、高劑量組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-P65/P65比值均降低(P<0.05),英黃湯低劑量組p-PI3K/PI3K、p-P65/P65比值均降低(P<0.05);與地塞米松組相比,英黃湯各劑量組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-P65/P65比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表6、圖3。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.地塞米松組;D英黃湯低劑量組;E.英黃湯中劑量組;F.英黃湯高劑量組。

表6 各組大鼠PI3K/AKT/NF-κBP65信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

3 討 論

根據(jù)膿毒癥相關(guān)癥狀,可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“傷寒”“溫病”范疇[10]。多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為機(jī)體正氣不足,引起毒邪內(nèi)侵,導(dǎo)致毒熱、瘀血內(nèi)生,腑氣不通、脈絡(luò)瘀滯而發(fā)生本病[11]。膿毒癥期機(jī)體多表現(xiàn)出毒熱內(nèi)蘊(yùn),而通里攻下法是快速排出毒熱的有效方法[12]。同時(shí)毒熱久蘊(yùn),搏血為瘀,瘀阻脈絡(luò),一方面血脈瘀滯,導(dǎo)致毒熱難祛,另一方面血脈瘀滯,藥物難以快速直達(dá)病灶[13]。梅建強(qiáng)教授結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn),以通腹泄熱、活血解毒為大法,創(chuàng)立中藥“英黃湯”,方中大黃蕩滌胃腸毒熱積滯,給邪出路,同時(shí)走血分破瘀血;蒲公英既能清解火熱毒邪,又善泄降滯氣,與大黃相伍解毒之力更強(qiáng),二者共為君藥;青皮善走竄行氣,水蛭活血逐瘀,歸芍合川芎活血和血,仙鶴草通絡(luò)補(bǔ)虛,地榆涼血解毒,共為臣藥;茯苓健脾和胃,固護(hù)正氣;清半夏清熱祛痰、降逆,共為佐使之品。

本研究中,通過CLP方法構(gòu)建的膿毒癥大鼠生存率與真實(shí)世界數(shù)據(jù)相符,且與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[14],英黃湯可以有效改善膿毒癥大鼠生存率。凝血功能障礙是膿毒癥病情進(jìn)展和多器官功能障礙發(fā)生的重要因素[15]。CLP造模72 h后,模型組大鼠血清中PLT含量顯著降低,PT、APTT、TT時(shí)間明顯延長,Fib大量消耗;與模型組相比,英黃湯各劑量組大鼠血清中PLT含量顯著增加,PT、APTT時(shí)間明顯縮短,Fib含量增加,表明英黃湯能夠改善膿毒癥大鼠凝血功能。CLP造模72 h后,模型組大鼠肺組織BALF中蛋白含量顯著增加,W/D比值明顯增高, ALT、AST、SCr、BUN水平明顯增高,肺、肝、腎組織出現(xiàn)明顯損傷,經(jīng)英黃湯干預(yù),英黃湯各劑量組大鼠BALF中蛋白含量顯著減少、W/D比值明顯減小,ALT、AST、SCr、BUN水平明顯降低、肺、肝、腎組織損傷明顯減輕,表明英黃湯對(duì)膿毒癥大鼠肺肝腎組織具有明顯的保護(hù)作用。炎性因子是導(dǎo)致組織出現(xiàn)損傷的重要因素,過度活化的炎性反應(yīng)也是膿毒癥病情進(jìn)展的重要原因[16-19]。膿毒癥早期IL-6、TNF-α、IL-1β等炎性因子大量分泌,既可以早期診斷膿毒癥,對(duì)于膿毒癥預(yù)后也起到關(guān)鍵的作用[20-22]。造模給藥72 h后,模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高,肺組織中IL-6、IL-1β、TNF-α基因表達(dá)顯著增多,而經(jīng)英黃湯干預(yù),英黃湯各劑量組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著降低,肺組織中IL-6、IL-1β、TNF-α基因表達(dá)顯著減少,表明英黃湯能夠顯著減輕炎性反應(yīng),抑制炎性因子表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT通路是一條重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路,參與大多數(shù)的炎性反應(yīng)過程,AKT是PI3K的下游受體,在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移和轉(zhuǎn)錄等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用[23]。NF-κB家族成員眾多,其中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用的是p65,因此p65又被視為該通路活化的標(biāo)志[24]。 研究發(fā)現(xiàn)NF-κB 屬于炎性反應(yīng)的中心介質(zhì),膿毒癥發(fā)生時(shí),促進(jìn)炎性因子釋放的同時(shí),加重微血栓的形成,對(duì)于膿毒癥病情的發(fā)生及進(jìn)展起到重要的作用[25]。造模給藥72 h后,模型組肺組織中PI3K/AKT/NF-κB P65蛋白水平較假手術(shù)組顯著增高,提示PI3K/AKT/NF-κB P65信號(hào)通路在炎性因子的刺激下,顯著激活;英黃湯各組大鼠肺組織中PI3K/AKT/NF-κB P65蛋白水平較模型組顯著下降。由此認(rèn)為,英黃湯能夠抑制PI3K/AKT/NF-κB P65信號(hào)通路活化,減輕膿毒癥大鼠急性肺損傷,修復(fù)肺功能。

綜上所述,英黃湯可以改善CLP大鼠凝血功能障礙,保護(hù)肺、肝、腎功能,降低炎性反應(yīng)水平,這些變化可能與抑制PI3K/AKT /NF-κB信號(hào)通路活化有關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

郭軍利:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),搜集整理資料,論文撰寫;陶愚磊、鄭佳麗:參與實(shí)驗(yàn)過程,分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),搜集整理資料;梅建強(qiáng)、陳分喬:提出研究思路,指導(dǎo)實(shí)施研究;許文忠:提出研究思路,指導(dǎo)實(shí)施研究,論文審核