原位電離質(zhì)譜技術(shù)在微生物菌株篩選中的應(yīng)用進展

劉歡，崔球

（1 中國科學院青島生物能源與過程研究所，中國科學院生物燃料重點實驗室，山東省合成生物學重點實驗室，山東 青島 266101； 2 山東能源研究院，山東 青島 266101； 3 青島新能源山東省實驗室，山東 青島 266101）

微生物細胞工廠是綠色生物制造的重要基石，可助力實現(xiàn)“雙碳”目標。在微生物菌株開發(fā)過程中，合成生物學的“設(shè)計-構(gòu)建-測試-學習”循環(huán)已成為示范流程，可加速菌種進化工程?；诘妆P細胞的理性或半理性改造來獲取多樣性突變文庫的技術(shù)已經(jīng)得到了長足的發(fā)展［1］。然而，突變文庫中篩選目標菌株的高通量策略的發(fā)展進展緩慢，從而限制了其應(yīng)用。目前，通過檢測細胞代謝表型來篩選目標基因型菌株是篩選突變文庫的一種直接且精準的方法。但是，目前主流的細胞代謝表型篩選方法通常耗時耗力且效率低下，成為合成生物學發(fā)展中的“限速步驟”之一。

目前，基于細胞代謝表型的高通量篩選方法主要包括熒光標記、拉曼光譜和質(zhì)譜技術(shù)。熒光標記技術(shù)具有高靈敏度和特異性等優(yōu)勢，是目前應(yīng)用最為廣泛的細胞表型檢測技術(shù)之一［2］。它的通量可以高達107個/h［3］。然而，缺乏特異性熒光探針限制了該方法的使用范圍，此外，有些細胞可能會受到熒光標記的影響，影響其自身的生物學特性，對于原位檢測也會造成困擾。拉曼光譜技術(shù)是一種高效的細胞表型識別技術(shù)，具有無損、非標記、高通量和低成本等優(yōu)點［4］。然而，由于大多數(shù)細胞表型的拉曼信號較弱，拉曼檢測靈敏度較低，更難以進行低濃度細胞表型的分析。此外，利用拉曼光譜技術(shù)可獲得細胞代謝組表型的總體光譜特征，但難以從分子水平上獲取胞內(nèi)單一種類分子的完整拉曼光譜特征。

質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）是一種強大的分析技術(shù)，通過檢測氣相離子來鑒定和定量化合物，并提供化合物分子量和化學結(jié)構(gòu)信息［5］。質(zhì)譜具備高特異性、高靈敏度、普適性、快速、微量和非標記等優(yōu)點，因此在各個學科領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。其中，電離源作為質(zhì)譜的關(guān)鍵核心部分，能夠?qū)⒎肿与x子化。常用的電離源包括電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）源［6］、基質(zhì)輔助激光解吸/電離（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）源［7］、大氣壓化學電離源和大氣壓光電離源等，這些電離源往往需要在真空或負壓條件下分析較純凈的樣品。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography MS，GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography MS，LC-MS）技術(shù)已成為現(xiàn)代分析化學的“金標準”，可用于各種復(fù)雜樣品的分析［8］。例如，GC-MS可以用于靶向分析解脂耶氏酵母菌生物合成的終產(chǎn)物中鏈脂肪酸［9］。然而，細胞樣品的擴大培養(yǎng)、復(fù)雜樣品制備和較長時間的色譜分離使得這些技術(shù)的通量較低，限制了它們在菌株高通量篩選中的應(yīng)用。

原位電離質(zhì)譜（ambient ionization MS，AIMS）是一組新型的分析技術(shù)，它可以直接解吸和電離天然樣品中的待測分子，無需分離或樣品預(yù)處理。這種技術(shù)突破了經(jīng)典電離方法的束縛，可以在大氣壓條件下實現(xiàn)固體樣品的實時、表面和原位檢測［10］。在過去的二十年中，AI-MS已經(jīng)發(fā)展出多種在大氣壓下工作的技術(shù)，并廣泛應(yīng)用于多個科學領(lǐng)域，如生物醫(yī)學、制藥和法醫(yī)學、植物科學、微生物學、神經(jīng)科學以及癌癥病理學等［11］。

本文旨在探討MALDI-MS和AI-MS在微生物菌株高通量檢測和篩選中的應(yīng)用（圖1）。首先介紹了經(jīng)典MALDI-MS和基于電噴霧、激光和等離子體的AI-MS的工作機制，以及它們?nèi)绾螌崿F(xiàn)對完整微生物細胞的直接檢測。其次，詳細介紹了質(zhì)譜技術(shù)在微生物突變文庫的高通量篩選和活菌落成像中的研究進展。最后，探討了AI-MS在微生物菌株選育中的優(yōu)勢和不足，并展望了AI-MS在合成生物學領(lǐng)域未來的發(fā)展方向。

圖1 質(zhì)譜技術(shù)在微生物檢測中的應(yīng)用Fig. 1 Application of mass spectrometry in microbial detection

1 質(zhì)譜電離技術(shù)工作機制及表征完整微生物細胞

1.1 基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜

MALDI-MS已經(jīng)發(fā)展成為一種快速可靠的微生物細胞分析技術(shù)［12-13］。自20世紀90年代起，MALDI-MS用于直接識別菌落中的蛋白質(zhì)［14-15］。在該技術(shù)中，將菌樣品和基質(zhì)混合，在樣品靶板上形成共結(jié)晶，然后將其放置于MALDI源中，在高真空條件下進行檢測。這種方法能夠?qū)崿F(xiàn)約每秒1個樣品的分析通量?；|(zhì)的選擇直接影響到MALDI-MS的圖譜質(zhì)量。通常用于菌樣檢測的基質(zhì)包括α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）、2，5-二羥基苯甲酸（DHB）和3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸（芥子酸）［12］。基質(zhì)溶液通常由水、有機基質(zhì)和強酸組成，具有穿透微生物細胞壁和提取細胞表型分子的能力。MALDI-MS可以直接獲取菌樣細胞表型分子的指紋圖譜，包括脂質(zhì)譜和蛋白質(zhì)譜等。這些譜圖可用于在屬、物種或亞群水平上鑒定細菌［13］。目前已有許多文獻對于MALDI-MS在細菌鑒定方面進行了綜述［12-13，16-19］，因此此處不再贅述。

由于具有樣品制備簡單、耐高鹽、化學覆蓋廣和高通量等優(yōu)點，MALDI-MS已成為成熟的高通量分析平臺，非常適合進行大規(guī)模微生物樣品的快速篩選［20-22］。雖然MALDI-MS通量顯著提高，樣品處理步驟減少，但是目前基于真空采樣的MALDI技術(shù)可能受限于對不穩(wěn)定或揮發(fā)性小分子的檢測。此外，基質(zhì)的應(yīng)用和共結(jié)晶的異質(zhì)性可能會影響菌的表型定量，同時高豐度的背景峰可能會對小分子的檢測靈敏度產(chǎn)生影響［12］。此外，MALDI-MS適用于直接檢測革蘭氏陰性菌細胞，而對于革蘭氏陽性菌細胞的檢測通常需要先制備全細胞裂解液或粗細胞提取物，然后再進行質(zhì)譜檢測。

1.2 原位電離質(zhì)譜技術(shù)

AI-MS技術(shù)是由質(zhì)譜學家Cooks教授于2004年首次提出［10，23］。該技術(shù)在常壓條件下，無需或僅需極少樣品前處理過程，便可直接實現(xiàn)對樣品待測組分的質(zhì)譜分析。AI-MS已成為質(zhì)譜科學和儀器研究的焦點，同時也催生了基于不同電離機制的原位電離技術(shù)。無需或僅需極少樣品前處理，AI-MS即可在常壓敞開條件下直接對細胞進行分析，因此在完整微生物細胞的直接檢測中具有重要的應(yīng)用價值。本文將重點介紹基于電噴霧、激光和等離子體的AI技術(shù)（表1），并詳細描述它們在微生物細胞檢測中的應(yīng)用。

表1 原位電離技術(shù)及在微生物檢測中的應(yīng)用案例Table 1 AI techniques and their application examples in microbial detection

1.2.1 基于電噴霧的原位電離技術(shù)

解吸電噴霧電離（desorption electrospray ionization，DESI）技術(shù)首次由Cooks團隊提出，是一種基于電噴霧電離的AI技術(shù)。在DESI［圖2（a）］中，帶電溶劑在高速氣流的輔助下形成初級微滴，解吸和電離樣品表面的待測組分，隨后形成次級微滴，并在飛濺過程中被引入質(zhì)譜儀進行分析［10，23，51］。DESI技術(shù)具有實時、表面和原位檢測固體樣品表面痕量組分的能力［51］。隨著AI-MS技術(shù)的不斷發(fā)展，DESI技術(shù)也得到了持續(xù)改進和優(yōu)化，以適應(yīng)各種實際應(yīng)用領(lǐng)域［51-59］。本節(jié)將重點介紹DESI-MS在完整微生物細胞分析方面所取得的應(yīng)用進展。

第一個應(yīng)用案例是Cooks團隊［24］首次采用DESIMS技術(shù)對3種大腸桿菌菌株（DH10B，JM109和XL1-Blue）和2種鼠傷寒沙門氏菌菌株（TL212和LT1）的完整細胞進行了分析。在DESI-MS實驗中，首先將1 μL的新鮮細胞懸浮液均勻沉積（約0.5 cm2）在載玻片上。接下來，在室溫下將載玻片上的細胞懸浮液蒸干約1～2 min，以除去水分。然后，使用50%甲醇水溶液作為電噴霧試劑，對細胞中的分子進行解吸和電離。同一平板上培養(yǎng)的2個菌落的分析時間間隔設(shè)置為5 min。該研究成功獲取了5種革蘭氏陰性菌活細胞的脂質(zhì)（主要為磷脂）指紋圖譜。通過主成分分析，可以區(qū)分不同的菌種和菌株。除此之外，DESI-MS還被用于表征革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌菌株生物膜的指紋圖譜［25］。這些指紋圖譜主要包含了枯草芽孢桿菌外泌的表面活性脂肽（C13、C14、C15等）的信息，可用于微生物的鑒定和表征。

第二個應(yīng)用案例是McLean團隊［26-27］采用DESI-MS結(jié)合微孔膜支架方法，實現(xiàn)了對完整菌落細胞的分析。在實驗中，微生物菌落被培養(yǎng)在瓊脂基質(zhì)的膜支架上，然后將膜從瓊脂中取出并貼在載玻片上，直接進行DESI-MS檢測。DESIMS采樣和無監(jiān)督分割方法相結(jié)合，可以進行微生物相互作用的空間化學分析［26］，以及微生物菌落的非定向分析［27］。需要注意的是，DESI-MS技術(shù)本質(zhì)上是一種表面分析技術(shù)，主要用于測量細胞外泌代謝物和與細胞膜相關(guān)的分子，很難提供細胞內(nèi)代謝物分子信息。

納解吸電噴霧電離（nano-DESI）技術(shù)是由Laskin團隊首次提出的［圖2（b）］［28，30，60-61］。該技術(shù)利用初級熔融石英毛細管將溶液輸送到樣品表面，在距離質(zhì)譜口附近的自吸式納毛細管與樣品表面形成液橋（直徑為10～200 μm），溶解并提取樣品表面分析物，然后通過納毛細管將其輸送至質(zhì)譜口處進行電離。nano-DESI技術(shù)實現(xiàn)了高度局部化采樣，通過減小液橋與樣品接觸面積可以提高空間分辨率，而增大液橋與樣品接觸面積可以提高質(zhì)譜電離效率。DESI和nano-DESI都屬于常壓下的液體萃取電離技術(shù)，它們之間的區(qū)別在于：DESI利用高速氣流輔助溶液霧化形成帶電液滴，對樣品表面分子進行解吸和電離；而nano-DESI則通過每分鐘納升級的流速形成恒定液橋，無需氣流輔助，從而消除了樣品濺射現(xiàn)象，并提高了采樣效率。

使用nano-DESI技術(shù)可以溫和地對表面微生物進行提取和分析，從而直接分析活菌落，也可以用于表征和鑒定微生物相互作用的分子特征（表1）［28，30］。Laskin團隊［30］使用nano-DESI技術(shù)對瓊脂平板上共培養(yǎng)的2種細菌菌株鏈霉菌（Streptomyces coelicolorA3）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisPY79）進行分析，獲取它們的空間分子特征。通過利用nano-DESI-MS/MS數(shù)據(jù)建立細菌相互作用期間釋放的代謝物分子網(wǎng)絡(luò)，鑒定出1種新的枯草芽孢桿菌表面活性素類似物。同時，結(jié)合nano-DESI-MS與分子網(wǎng)絡(luò)分析，可以檢測到假單胞菌菌株（Pseudomonassp. SH-C52）中一種預(yù)測但尚未經(jīng)過實驗證實的脂肽thanamycin。此外，該團隊利用nano-DESI技術(shù)對瓊脂平板上的集球藻屬菌落（Synechococcussp. PCC 7002）進行快速分析［29］，發(fā)現(xiàn)幾種未曾報道的單半乳糖基二?；视秃投肴樘腔；视头肿印Ｍㄟ^使用一維掃描獲取瓊脂上代謝物的化學梯度，成功鑒定出菌落釋放到瓊脂上的糖基甘油和蔗糖兩種代謝物。此外，nano-DESI實驗進一步表明了代謝物擴散與菌落的年齡存在相關(guān)性。

紙噴霧電離（paper spray ionization，PSI）技術(shù)是由Cooks團隊首次提出的［圖2（c）］，不同DESI和nano-DESI技術(shù)，PSI技術(shù)是用紙作為樣品載體，具有電噴霧電離和原位電離的特點，可用于快速進行復(fù)雜混合物的定性和定量分析［62-66］。在PSI源中，使用一片三角紙作為紙基，位于質(zhì)譜口的前端。通過一個銅夾施加高電壓（3～5 kV）到紙基上，然后將含有分析物的溶劑添加到紙基上形成離子，進行質(zhì)譜檢測［62］。PSI技術(shù)集成了樣品的收集、分析物的分離和分析物的電離三個步驟，具有低成本、易制備和易于進行化學改性等優(yōu)點，在簡單樣品處理和電離方面具有廣闊應(yīng)用前景。作者開發(fā)了一種PSI-MS結(jié)合同位素內(nèi)標方法，用于快速分析土壤和沉積物中有機污染物四溴雙酚A［67］。在該方法中，將甲醇提取物和同位素內(nèi)標加載到紙基上，然后通過在紙基上施加高電壓的方式，使得分析物在紙基尖端處被電離并引入質(zhì)譜。PSI-MS能夠在1 min內(nèi)完成單個樣品的檢測，其線性范圍為0.1～100 μg/L，檢測限為0.039 μg/L，是一種快速和有效的分析方法。Cooks團隊［31］還利用PSI-MS技術(shù)，在無需樣品制備的情況下，快速區(qū)分了不同種類的細菌。在PSIMS中，將細菌菌落（約100 μg）涂抹在三角紙表面中間位置，滴加15 μL溶劑濕潤紙基，并施加高電壓。在電場作用下，帶電液滴被引入質(zhì)譜儀進行分析。每個樣品的采集時間為1～2 min。PSIMS技術(shù)通過獲取細菌細胞膜的磷脂特征質(zhì)譜圖譜，并結(jié)合主成分分析和線性判別分析，成功區(qū)分了革蘭氏陽性和陰性菌的8個不同屬，共計16種不同物種。此外，該團隊還使用PSI-MS技術(shù)直接對2種微藻菌株片劑Kyo-Chlorella和Nannochloropsisform中的極性脂質(zhì)進行了表征［32］。

微滴撞擊誘導(dǎo)噴霧電離（microdroplet impactinduced spray ionization，MISI）技術(shù)由Basuri團隊提出［圖2（d）］［33］，與PSI技術(shù)類似。在MISI技術(shù)中，通過在第一張紙基上施加高電壓，產(chǎn)生帶電微滴。這些帶電微滴沉積在第二張紙基上，該紙基含有流動的分析物溶液。通過電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在紙基尖端產(chǎn)生攜帶分析物的二次帶電微滴，然后將這些微滴引入質(zhì)譜進行檢測。MISI技術(shù)最多可以串聯(lián)三個級聯(lián)噴霧源。由于高電壓沒有直接施加在分析物的紙基上，MISI可以作為一種非入侵方法，用于原位檢測枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）和惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）中的脂質(zhì)分布，以區(qū)分不同種類的細菌。整個MISI分析過程可以在1～2 min內(nèi)完成，且細菌細胞在經(jīng)過多次MISI分析后仍保持89%的活力。與標準PSI相比，MISI在沒有直接施加高電壓到樣品上的方面更具優(yōu)勢，可以實現(xiàn)對活細菌樣本的無創(chuàng)原位檢測，并通過特征脂質(zhì)分布區(qū)分不同種類的細菌。

熱解吸-電噴霧電離（thermal desorptionelectrospray ionization，TD-ESI）質(zhì)譜由謝建臺團隊提出，是一種通過熱輔助解吸細菌細胞分析物的電噴霧質(zhì)譜技術(shù)［圖2（e）］［34］。該方法涉及使用金屬探針采集培養(yǎng)皿中的菌落樣品，進行溶劑提取。隨后，將探針插入到TD-ESI源中，進行熱解吸分析物，并在氮氣的輔助下將解吸的分析物輸送到ESI噴霧中進行電離。最后，進行質(zhì)譜檢測。整個過程在1 min內(nèi)完成。TD-ESI-MS技術(shù)能夠同時獲得5種革蘭氏陰性菌和5種革蘭氏陽性菌的脂質(zhì)譜圖，結(jié)合主成分分析（PCA）和層次聚類分析（HCA），通過脂質(zhì)譜圖差異性來區(qū)分不同細菌物種。該方法在細菌蛋白質(zhì)譜圖的MALDI-MS分析中也得到了驗證。

簡易環(huán)境聲波噴霧電離（easy ambient sonicspray ionization，EASI）技術(shù)由Eberlin團隊于2006年引入［圖2（f）］［68-69］。不同于以上AI技術(shù)，該技術(shù)不需要使用加熱、高壓、激光、電暈放電或輔助氣體，僅依靠聲波噴霧生成密集的帶電液滴云，用于分析物的收集和電離。EASI技術(shù)是一種最簡單、最容易實現(xiàn)的原位電離技術(shù)。在EASI技術(shù)中，通過聲速流動的氮氣機械破壞溶液中均勻分布陽離子和陰離子，將溶液均勻分解成非常小的液滴。然后，這些帶有正負電荷的液滴流束擊中沉積有分析物的表面，實現(xiàn)液滴的萃取和分析物的電離過程。這些產(chǎn)生的分析物離子隨后會從液滴中釋放到氣相中，并進入質(zhì)譜儀進行進一步分析［70］。EASI-MS已成功應(yīng)用于研究藍藻在不同生長條件下的脂質(zhì)變化［35-36］。例如，劉虎威團隊［36］利用EASI-MS研究了單細胞藍藻［聚囊藻（Synechocystis6803）和聚球藻（Synechococcus7002）］、絲狀藍藻［魚腥藻（Anabaena7120）］在不同生長階段中脂質(zhì)硫酸喹諾糖二酰甘油（SQDG）和磷脂酰甘油（PG）的變化情況。研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)成分可用于確定藍藻的生長狀態(tài)，進一步了解藍藻細胞的生理狀態(tài)。結(jié)果顯示，這3種藍藻在不同培養(yǎng)時間下的SQDG/PG比例顯著降低，脂質(zhì)的不飽和水平也發(fā)生顯著變化。

張新榮團隊開發(fā)了幾種微萃取結(jié)合電噴霧質(zhì)譜技術(shù)，用于單細胞中代謝物的分析，如探針電噴霧質(zhì)譜（probe ESI-MS，PESI-MS）［71］、尖端溶劑萃取質(zhì)譜（in-tip solvent microextraction MS，ITSME-MS）［37］、脈沖直流電噴霧電離質(zhì)譜（Pico-ESI-MS）［72］。其中，ITSME-MS是一種用于分析單個細胞脂滴中磷脂酰膽堿和甘油三酯分子的新方法［圖2（g）］［37］。該方法首先使用納米尖端吸入單個脂滴，然后在納米尖端內(nèi)注入脂質(zhì)提取溶劑，并進行nanoESI-MS分析。在尖端區(qū)域形成梯度溶液體系，從水性緩沖溶液到疏水性的有機溶劑，依次分離和分析磷脂酰膽堿和甘油三酯分子。這種方法已成功應(yīng)用于分析HepG2細胞中的脂滴，并比較了不同脂滴的脂質(zhì)譜。

Sciex Echo-MS和微流體質(zhì)譜是具有高通量分析潛力的重要平臺。Echo-MS平臺利用聲學液體處理機器人，將納升級別的液滴從微孔板中噴射到開放端口接口（open-port probe，OPP）中。OPP攜帶流動的溶劑流，在0.5～2 s的循環(huán)時間內(nèi)進入ESI源進行質(zhì)譜檢測［73］。多重反應(yīng)檢測（multiple reaction monitoring，MRM）作為Echo-MS檢測技術(shù)，用于分析物的定量檢測［38］。該平臺適用于高通量分析微孔板中的細胞外上清液或粗細胞提取液［38，73］。微流體平臺具有產(chǎn)生微升級別水滴的能力，這些水滴可以分散在不相容的流體中，用于捕獲和培養(yǎng)單個細胞［39］。在培養(yǎng)完成后，這些水滴中的內(nèi)容物能夠以30滴/s的速率直接進行在線ESI-MS檢測［74］，也可以將水滴點樣到樣品靶板上，以1個樣品/s的速率進行離線MALDI-MS檢測［40，75］。微流體質(zhì)譜平臺適用于檢測培養(yǎng)液中細胞外泌的代謝表型分子［39］。

1.2.2 基于激光的原位電離技術(shù)

基于激光的原位電離技術(shù)通常利用紫外（ultraviolet，UV）或紅外（infrared，IR）脈沖激光，以有效促進樣品燒蝕或解吸，然而激光光源的電離效率相對較低，導(dǎo)致在激光燒蝕或解吸過程中生成的大部分分子仍是中性的［76］。因此，大多數(shù)基于激光的AI-MS技術(shù)采用了耦合二次電離方法，如電噴霧輔助激光解吸/電離（electrospray assisted laser desorption/ionization，ELDI）、LAESI、MALDESI［76-82］。

激光燒蝕電噴霧電離（laser ablation electrospray ionization，LAESI）技術(shù)于2007年由Vertes團隊提出［圖3（a）］，并詳細闡述了該電離源的構(gòu)造、電離機理及其實際應(yīng)用［42-43，83-90］。LAESI源利用中紅外脈沖激光（例如Er：YAG固態(tài)激光器，波長2.94 μm）聚焦到樣品表面，通過燒蝕和解吸產(chǎn)生氣相分子羽流。隨后，在與正交電噴霧羽流相互作用的過程中，將這些分子電離并引入質(zhì)譜［76，91］。由于水分子中O—H鍵可強烈吸收中紅外光，因此，LAESI技術(shù)適用于在常壓下直接檢測含水樣品，例如細胞和組織［42，92］。與ESI相似，LAESI也適用于極性分子的分析。在LAESI的源構(gòu)造中，采用了類似于nanoESI源的配置，其中毛細管被用作噴霧發(fā)射器，無需氣動輔助電離。激光燒蝕具有在受限區(qū)域內(nèi)進行采樣的能力，同時具備高重復(fù)性和高通量性，因此適用于復(fù)雜樣品的質(zhì)譜成像研究［84］。在沒有對樣品進行預(yù)處理和不添加任何基質(zhì)的情況下，Vertes團隊［41］利用LAESI-MS對細菌菌落的生長、代謝和抗生素抑制進行了分子成像研究。他們使用單脈沖激光（0.9 mJ）聚焦在大腸桿菌菌落上，產(chǎn)生直徑為150 μm、深度為25 μm的燒蝕坑，然后對菌落及瓊脂進行分析，以獲取菌落內(nèi)源性代謝物和脂質(zhì)的分布情況。

圖3 基于等離子體和激光的原位電離技術(shù)示意圖Fig.3 Diagram of ambient ionization sources based on plasma and laser

激光輔助快速蒸發(fā)電離（laser-assisted rapid evaporative ionization，LA-REI）MS平臺由Takáts團隊提出［圖3（b）］［44］，同樣不需要添加基質(zhì)即可原位檢測菌樣品。該平臺利用二氧化碳激光器促使樣品進行熱解吸，并結(jié)合快速蒸發(fā)電離方法實現(xiàn)電離。LA-REI-MS可直接對瓊脂平板上菌落進行分析。激光產(chǎn)生約500 μm光斑照射在菌落上，產(chǎn)生的蒸氣流通過PTFE管道運輸?shù)劫|(zhì)譜口處進行電離。整個菌落分析過程只需約8 s即可完成。LA-REI-MS被用于對具有臨床意義的15種微生物中的25個分離株進行形態(tài)分析，使用隨機森林模型進行留一法交叉驗證，分類準確率達到了97.2%。

基質(zhì)輔助激光解吸電噴霧電離（matrix assisted laser desorption electrospray ionization，MALDESI）技術(shù)于2006年由Muddiman團隊引入［圖3（c）］［82，93］。該技術(shù)的解吸和電離機理與LAESI技術(shù)相似，使用337 nm UV或2.94 μm IR激光器蒸發(fā)樣品表面分子，形成氣相分子羽流，并與正交電噴霧羽流相互作用發(fā)生電離，引入質(zhì)譜。MALDESI使用內(nèi)源性水和外源冰作為基質(zhì)，以更好地從樣品表面解吸化合物［94-95］。MALDESI-MS可用于對單個細胞的脂質(zhì)進行快速靈敏分析［45］。在這項研究中，無需提取和/或富集分析物，而是直接將HeLa細胞分散在載玻片上，MALDESI源對細胞分子進行采樣和電離。該方法能夠檢測出45種主要為磷脂的脂質(zhì)物種。該研究結(jié)果證實了MALDESI-MS在快速脂質(zhì)組學分析中的可行性和有效性。

大氣壓激光電離質(zhì)譜（atmospheric pressure laserspray ionization mass spectrometry，AP-LSI mini MS）是由徐偉團隊提出，并成功應(yīng)用于直接細菌分析［圖3（d）］［46］。在該研究中，首先將瓊脂平板上的細菌懸浮在甲醇水溶液中，濃度為2×107cfu/mL。然后，將5 μL基質(zhì)溶液和細菌溶液分別加載到樣品板上，在質(zhì)譜入口處進行激光燒蝕解吸和電離，再引入質(zhì)譜儀進行檢測。該方法每次質(zhì)譜掃描可檢測到約1000 cfu的細菌。該工作無需復(fù)雜的提取和制備步驟，即可獲得細菌細胞壁和細胞膜中寡肽和脂質(zhì)等小分子的指紋譜，同時，結(jié)合監(jiān)督多變量統(tǒng)計方法正交偏最小二乘法，可在屬和種水平上區(qū)分出21種食源性細菌。

大氣壓基質(zhì)輔助激光解吸/電離（atmospheric pressure matrix-assisted laser desorption/ionization，AP-MALDI）技術(shù)由Laiko團隊首次引入［96］。APMALDI可與多種MS儀配合使用，只需進行少量改造，其小激光光斑尺寸使其具有更高的分辨率和更好的重復(fù)性。通過改善激光的聚焦直徑，可以在自然條件下實現(xiàn)1.4 μm的橫向分辨率［47］。Voorhees團隊使用AP-MALDI-MS對瓊脂培養(yǎng)基上生長的球狀芽孢桿菌（Bacillus globigii，BG）培養(yǎng)物進行了分析，它們使用脈沖紫外激光照射基質(zhì)CHCA與完整的BG細胞共結(jié)晶樣品，并成功檢測到生物標志物環(huán)狀脂肽［97］。

1.2.3 基于等離子體的原位電離技術(shù)

實時直接分析（direct analysis in real time，DART）技術(shù)于2005年由Cody團隊首次提出，是第一個基于等離子體的AI技術(shù)，并且仍然是目前最常用的技術(shù)之一［圖3（e）］［98］。在DART源中，載氣（通常為氦氣、氬氣和氮氣）暴露于電暈放電針中，通過電暈放電的方式使氣體分子激發(fā)到亞穩(wěn)態(tài)。然后，亞穩(wěn)態(tài)分子與空氣中的水分子發(fā)生反應(yīng)，形成質(zhì)子化的水簇，從而對質(zhì)譜口處的樣品進行解吸和電離。該方法通過加熱氣體來提高樣品表面分子的解吸效率，進而提高靈敏度。DART技術(shù)適用于分析分子質(zhì)量小于1000 Da的揮發(fā)性化合物。DART源能夠解吸和電離樣品表面分子，但無法直接分析完整的細胞。Pierce團隊［48］采用DART-MS分析細菌細胞中脂肪酸甲酯離子。他們將全細菌細胞懸浮液與甲基化試劑氫氧化四甲基銨混合，并沉積在毛細管底部。DART源提供500 ℃氦氣流與毛細管底部樣品接觸，使細菌細胞發(fā)生原位甲酯化和電離，并將離子引入質(zhì)譜儀進行分析。Cody團隊［99］采用DART-MS表征脂肪酸來鑒定細菌，而無需進行衍生化和樣品處理。DART源在進行脂質(zhì)分析時，通過在熔融棒上提供350 ℃的氦氣流，對細胞脂質(zhì)提取液進行處理，并鑒定其中的多種脂肪酸、甘油酯和磷脂。由于高溫氣流的作用，部分脂質(zhì)會發(fā)生熱分解反應(yīng)產(chǎn)生脂肪酸離子。因此，DART源并不適用于分析熱不穩(wěn)定的揮發(fā)性分子。

介質(zhì)阻擋放電電離（dielectric barrier discharge ionization，DBDI）和低溫等離子體（low-temperature plasma，LTP）是利用低溫等離子體進行樣品分析的AI技術(shù)。DBD是通過在由絕緣屏障隔開的兩個電極之間施加高壓交流電來產(chǎn)生放電的技術(shù)。DBDI是張新榮團隊在2007年首次提出的一種應(yīng)用該原理的離子化技術(shù)［100］。DBDI技術(shù)由針電極、銅電極和兩者之間裝有樣品的載玻片組成。針電極尖端產(chǎn)生等離子體會直接作用于載玻片上的樣品，引發(fā)其解吸和電離［圖3（f）］。Liu團隊［49］采用nanoESI-DBDI源在單個植物細胞（洋蔥）和人體細胞（PANC-1）中檢測極性和非極性化合物 。在該實驗中，他們使用內(nèi)徑為1 μm的毛細管插入細胞中進行采樣，并使用nanoESI源對細胞中極性代謝物進行直接電離；而DBDI則作為后電離源，用于電離細胞中的非極性代謝物。在nanoESI（3.5 kV）-DBDI（2.6 kV）模式下，他們成功檢測到洋蔥細胞中的49種化合物和PANC-1細胞中的73種化合物。這種串聯(lián)模式的應(yīng)用提高了細胞中不同極性代謝物的檢測范圍、電離效率和檢測限。通過結(jié)合nanoESI和DBDI技術(shù)，研究人員可以更全面地分析細胞中的代謝產(chǎn)物，提供了對細胞代謝的更深入了解。Liu團隊［101］提出了一種基于活性毛細管DBDI-MS的高通量和無標記單細胞分析方法。在該研究中，電離過程發(fā)生在與質(zhì)譜儀連通的毛細管內(nèi)，通過這種方式大大提高了穩(wěn)定性和離子傳輸效率。DBDI-MS平臺能夠同時分析單個細胞中多種代謝物，包括有機酸、羰基化合物、雜環(huán)化合物和脂質(zhì)等。通過該方法，研究人員能夠根據(jù)代謝譜中的特征，將不同的細胞類型進行區(qū)分，如293T、PANC-1、CFPAC-1、HeLa和iBAs。這種單細胞分析方法的檢測通量約為38個細胞/min，實現(xiàn)了高通量分析的目標。

LTP［圖3（g）］探針是DBDI技術(shù)的一種變體，利用DBD產(chǎn)生低溫等離子體［102］。LTP探針的結(jié)構(gòu)由一個玻璃管作為介電屏障，將內(nèi)部接地電極和外部帶電銅帶電極分隔開來。通過施加交流電壓，形成DBD等離子體，并直接與樣品相互作用，使樣品中的分子發(fā)生電離，并引入質(zhì)譜［102］。Zhang團隊［50］使用LTP-MS技術(shù)對來自細菌樣品中的脂肪酸乙酯（fatty acid ethyl esters，F(xiàn)AEE）進行了檢測。在實驗中，他們選取了16種不同細菌（約109cfu/mL）懸浮在70%乙醇中。不需要進行提取或其他樣品制備步驟，只需取1.5 μL樣品沉積在載玻片上，并等待其干燥后進行LTP-MS分析。通過這種方法，成功獲得了16種細菌的特征FAEE質(zhì)譜圖。在這種方法中，利用LTP-MS技術(shù)獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合主成分分析方法，可以對細菌進行區(qū)分和分類。然而，需要注意的是，作為表面分析技術(shù)，如DART、DBDI和LTP等，在對完整細胞進行分析時存在一定的挑戰(zhàn)。

2 微生物突變文庫高通量篩選應(yīng)用案例

2.1 基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜

MALDI-MS是一種成熟的高通量分析的平臺，非常適用于大規(guī)模微生物樣品的高通量篩選（表2）［21-22，103-104］。

表2 主要原位電離技術(shù)及在菌株篩選和成像中的應(yīng)用案例Table 2 Main AI techniques and their application examples in microbial strain screening and imaging

Zhao團隊［22，104］多年來一直致力于開發(fā)無標記的高通量細菌菌落MALDI-MS方法，用于酶突變文庫的高通量篩選。該團隊開發(fā)了一種圖像引導(dǎo)質(zhì)譜方法，能夠在菌落、液態(tài)微滴等多種樣品類型中，識別和分析所選定位置的目標，實現(xiàn)高通量分析［104］。這種方法在酵母脂肪酸合成酶突變體菌落的篩選中得到了應(yīng)用。通過該方法，發(fā)現(xiàn)了5個菌落的脂肪酸C16：1和C18：1比值的平均值為18.1±1.1，明顯高于其他菌落。進一步的DNA測序驗證了這5個菌株都是G1250S突變體。

此外，司同團隊［103］采用無標記質(zhì)譜的方法進行定向進化新酶的活性篩選。在這項研究中，他們通過位點飽和誘變和epPCR文庫在重組大腸桿菌中自動創(chuàng)建和培養(yǎng)表達環(huán)二肽合成酶（CDPS）突變體，并提取和準備樣品。采用MALDI-MS 對樣品進行檢測（每個樣品用時5 s），并通過自定義的計算方法處理獲取的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。使用多變量分析方法，對在115～373 Da范圍內(nèi)的190個可能的二酮類肽分子的108個理論質(zhì)荷比值進行分析。通過這種方法，該研究在一周內(nèi)對4500個epPCR文庫菌株進行了篩選，并成功鑒定出1個產(chǎn)生新環(huán)二肽產(chǎn)物（L-Phe-L-Val）的F186L CDPS突變體。這個發(fā)現(xiàn)揭示了先前未知的殘基F186在底物特異性上的顯著影響。此外，該團隊還報道了在深圳合成生物學基礎(chǔ)設(shè)施的集成機器人工作單元上，羊毛硫肽突變體庫的自動化高通量篩選流程［109］。該流程包括DNA文庫構(gòu)建、宿主轉(zhuǎn)化、肽生產(chǎn)、質(zhì)譜分析和瓊脂擴散測定的活性篩選。其中，在對重組生產(chǎn)的Halα肽進行的篩選中，該團隊在數(shù)周內(nèi)完成了微孔板中380個單殘基突變體和大于1300個三重殘基組合突變體的序列活性關(guān)系的快速分析，并發(fā)現(xiàn)1種Halα突變體，該突變體相對野生型具有增強的特異抗菌活性。這項工作展示了高通量和自動化篩選流程在羊毛硫肽突變體庫中的應(yīng)用，有助于發(fā)現(xiàn)具有改進特性的突變體。

2.2 原位電離質(zhì)譜

DESI-MS和LA-REI-MS是可通過原位檢測活菌落來實現(xiàn)突變文庫高通量篩選的兩種典型原位電離質(zhì)譜技術(shù)，下面重點介紹它們在菌株篩選中的應(yīng)用案例。

Barran團隊［107］開發(fā)一種無標記篩選平臺，利用DESI結(jié)合離子淌度質(zhì)譜成像（mass spectrometry imaging，MSI）技術(shù)，在活菌落中進行生物轉(zhuǎn)化的分析（表2）。該平臺的操作步驟如下：首先，在瓊脂平板的尼龍膜上接種含有所需質(zhì)粒/文庫的大腸桿菌細胞；其次，對菌落進行孵育、誘導(dǎo)表達和培養(yǎng)，在這個過程中，生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物被產(chǎn)生并積累在菌落中；最后，使用DESI-MSI技術(shù)，可以對菌落進行分析，每個樣品用時約10 s。通過將特定產(chǎn)物的m/z值的離子強度與平板表面上的x-y物理位置相關(guān)聯(lián)，可以將數(shù)據(jù)處理成可視化的分子圖像。這樣，可以檢測到每個菌落在平板上的具體物理位置，并獲得與之相關(guān)的質(zhì)譜信息。在該平臺中，首先使用DESI-MSI技術(shù)檢測苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）催化的苯丙酸氨加成反應(yīng)。該實驗使用攜帶活性PAL的大腸桿菌細胞菌落，將其培養(yǎng)在含有底物苯丙酸的氨基碳酸鹽緩沖液中。通過DESI-MSI監(jiān)測，可以檢測到L-苯丙氨酸（m/z164）及其他生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的生成。此外，該團隊還利用DESI-MSI技術(shù)研究了菌落中完整細胞表達的P450單加氧酶參與的二氯芬酸的羥基化反應(yīng)。DESI-MSI技術(shù)由于其原位直接取樣、標記自由和實時監(jiān)測等優(yōu)點，在生物催化領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。這項工作結(jié)合了DNA信息和DESI-MSI分析結(jié)果，發(fā)揮了重要作用，特別是在文庫篩選中。

McLean團隊［27］采用了微孔膜支架和非靶向DESI-MSI方法，對包括工程菌株及其生物合成產(chǎn)物在內(nèi)的細菌菌落進行了多重代謝組學分析。該方法具有直接采樣、高通量和空間分辨能力。為了進行這項工作，研究團隊首先利用基因工程手段將具有不同表達受控游離脂肪酸（FFA）組成和鏈長的硫酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶（TesA）轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中。然后，通過在瓊脂基質(zhì)的膜支架上培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)基因大腸桿菌，研究團隊可以根據(jù)需要的時間點將膜取出并固定在載玻片上。使用DESIMSI技術(shù)，無需對樣品進行預(yù)處理，可以直接采樣并分析膜上的大腸桿菌及其生物合成產(chǎn)物。在這些實驗中，典型的DESI-MSI像素尺寸為50 μm×250 μm，可以在42 min內(nèi)完成對356個菌落的采樣。該研究利用靶向檢測生物合成產(chǎn)物脂肪酸的離子圖像定位特定菌落，并結(jié)合基因編輯的預(yù)測結(jié)果，確定了具有高產(chǎn)脂肪酸C12：0的TY05菌株和高產(chǎn)脂肪酸C8：0的NHL17菌株的位置。此外，研究還采用非靶向采集和無監(jiān)督分割的方法，根據(jù)其測量的代謝組成功地鑒定了4種產(chǎn)脂肪酸的大腸桿菌菌株。通過分析所有測量特征，可以確定脂肪酸之外的樣品類型之間的分子差異，例如氨基酸、小肽、脂質(zhì)和其他小分子，這有助于深入研究代謝途徑和菌株的代謝特征。

Gowers團隊［108］利用自動LA-REI-MS技術(shù)對瓊脂平板上的釀酒酵母菌落進行了快速質(zhì)譜分析（表2）。在LA-REI-MS中，高功率CO2激光以0.8 cm2面積聚焦在菌落上，通過燒蝕細胞，產(chǎn)生含有代謝物、結(jié)構(gòu)性脂質(zhì)等生物分子的氣相離子氣溶膠。這些離子氣溶膠隨后被導(dǎo)入質(zhì)譜儀進行分析，提供即時的半定量代謝物數(shù)據(jù)。該工作流程首先對瓊脂平板上的菌落進行光學檢測，然后使用自動化算法選取菌落，并利用機器人輔助激光對菌落進行掃描，每個菌落的分析時間小于10 s，實現(xiàn)了數(shù)據(jù)的快速收集。為驗證LA-REI-MS技術(shù)的可靠性，該研究首先對產(chǎn)生紫色素的釀酒酵母菌落進行了檢測。研究團隊使用了模塊化DNA克隆技術(shù)將紫色素生物合成過程中的5個異源基因組裝到一個CEN/ARS質(zhì)粒中，并將其成功轉(zhuǎn)化到酵母菌中。為了構(gòu)建一個含有32個酵母菌株的組合庫，作者利用了不同強度的啟動子進行基因表達，并將這個組合庫涂于含有選擇性瓊脂的平板上，以形成單個菌落。作者利用LA-REIMS技術(shù)對這些菌落進行篩選，從中獲取分析數(shù)據(jù)，并與平板上菌落圖像進行比較以評價篩選方法的準確性。接下來，該研究利用LA-REI-MS技術(shù)對酵母生物合成的白樺酸進行檢測。為此，研究人員采用了模塊化組裝方法，將白樺酸合成酶基因（BPLO和AtLUS1）與提高甲烷基酮途徑通量的酶基因（tHMG1和ERG9）進行組合，并使用不同強度的啟動子構(gòu)建了一個組合質(zhì)粒庫。然后，將這個質(zhì)粒庫轉(zhuǎn)化到一個包含P450還原酶酵素AtATR1的單倍體酵母菌株中，共得到了36個不同的酵母菌株。作者利用LA-REI-MS和LC-MS技術(shù)獲取了這些酵母菌落中白樺酸含量的數(shù)據(jù)，并發(fā)現(xiàn)兩種分析方法之間存在顯著的相關(guān)性。最后，利用LA-REI-MS技術(shù)對上百個菌落進行了預(yù)篩選，成功地分離并驗證了1種白樺酸產(chǎn)量提高了2.5倍的菌株。這些結(jié)果表明，LA-REI-MS技術(shù)對于有效篩選和鑒定白樺酸產(chǎn)量高的酵母菌株具有重要意義。該研究為通過代謝工程改造酵母菌來提高白樺酸產(chǎn)量提供了有益的數(shù)據(jù)和方法。

3 質(zhì)譜成像

質(zhì)譜成像（MSI）是一種能夠在單個實驗中可視化復(fù)雜樣品表面大量化合物空間分布的分析方法［110］。MSI實驗首先需要制備樣品切片，然后通過各種解吸/電離方法進行掃描和電離，獲取每個樣品采樣點的質(zhì)譜圖。從每張質(zhì)譜圖中提取目標質(zhì)荷比（m/z）下每個化合物的離子強度，并將其組合成熱圖，以顯示該化合物在整個樣品表面的相對分布。與傳統(tǒng)的標簽探針光學成像方法相比，MSI無需標記即可對多種化合物進行非靶向成像。

3.1 基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜成像

MALDI-MSI是一種無標記新技術(shù)，可生成2D離子密度圖，能夠在單次成像運行中確定數(shù)百種分析物的空間分布［13，105-106，111-113］。

Dreisewerd團隊［105］通過UV-MALDI-MSI技術(shù)定位活菌落。與傳統(tǒng)基質(zhì)涂層方式不同，該研究使用2.94 μm波長的脈沖IR激光對細胞進行燒蝕，產(chǎn)生氣相分子/離子流。通過使用UV激光作為定位電離源，對這些氣相流進行電離，可將小分子代謝物、糖脂和磷脂的離子產(chǎn)量提高到幾個數(shù)量級。該工作以銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的單一和共培養(yǎng)菌落作為示范細菌系統(tǒng)，通過對細胞特異性分子進行質(zhì)譜成像，實現(xiàn)了定位菌株在菌落中的空間位置。

Sweedler團隊［106］采用了MALDI-MSI和熒光成像的多模態(tài)成像方法來檢測枯草芽孢桿菌菌落生物膜表面代謝物分布和基因表達模式。在該研究中，使用MALDI-MSI方法對在MSgg瓊脂培養(yǎng)基上生長的枯草芽孢桿菌菌落生物膜進行檢測，發(fā)現(xiàn)了2種同類相食的毒素，這些毒素在以前從未報道過。多模態(tài)成像方法對3種枯草芽孢桿菌菌株進行表征，分別為野生型分離株NCIB3610和2種突變株（Δspo0A和ΔabrB），這些菌株的生物膜分別具有缺陷和增強性。研究觀察到，在關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子缺失后，生物膜形態(tài)、信號傳導(dǎo)、同類相食因子分布及與基質(zhì)相關(guān)基因表達都發(fā)生了相應(yīng)的變化。

3.2 原位電離質(zhì)譜成像

AI-MS具有高靈敏度、快速和易操作的優(yōu)勢，因此在質(zhì)譜成像方面被廣泛應(yīng)用［114-121］。作為質(zhì)譜成像的一個重要分支，原位質(zhì)譜成像（ambient ionization mass spectrometry imaging，AI-MSI）技術(shù)已成為當前的研究熱點。在AI-MSI中，化合物在環(huán)境條件下從樣品表面解吸，并通過帶電微滴、光子或等離子體等電離方式引入質(zhì)譜儀。目前，基于不同電離方法的AI-MSI技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于微生物學、疾病診斷、藥物代謝等實際應(yīng)用領(lǐng)域［114-119， 121-124］。

DESI-MSI通過對菌落進行質(zhì)譜成像來篩選突變菌株的典型應(yīng)用案例已在文章2.2部分展現(xiàn)［36，107］，本章節(jié)不再詳述。

Laskin團隊［61］開發(fā)了一種結(jié)合剪切力顯微鏡的nano-DESI-MSI方法，可用于對復(fù)雜生物樣品進行化學和形貌成像。該方法利用剪切力探頭控制nano-DESI探針和樣品之間的距離，對瓊脂平板上枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisATCC 49760）菌落在不同生長時間下進行形貌和化學成分的成像分析。在菌落生長的1 d和7 d期間，平板上菌落的直徑范圍為10～13 mm，高度為0.2～0.8 mm。菌落表面特征脂肽的分布取決于菌落的年齡，其中在1 d菌落表面上分布均勻，而在7 d菌落上則主要分布菌落的“脊”區(qū)域上。

LAESI-MS是一種檢測、成像和深度剖析生物細胞和組織中代謝物的重要工具（表1）［41，125-126］。Vertes團隊利用LAESI-MSI與離子淌度相結(jié)合，直接在瓊脂平板上對細菌（枯草芽孢桿菌和大腸桿菌）進行2D和3D成像。通過脂質(zhì)分子的分布來區(qū)分瓊脂平板上生長的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的區(qū)域。在枯草芽孢桿菌生長區(qū)域，PE（16：0/17：1）和PE（16：0/17：1）的豐度更高，而在大腸桿菌覆蓋的區(qū)域，PE（31：1）、PE（18：1/18：1）和PG（34：1）的豐度更大。該研究還探討了抗生素（鏈霉素和青霉素）與細菌培養(yǎng)物的相互作用，通過將一維數(shù)學模型擬合到瓊脂平板上的抗生素和脂質(zhì)濃度，推斷抗生素的最小抑制濃度。

Anderton團隊［127］采用金屬輔助激光解吸/電離（metal-assisted laser desorption/ionization，MetALDI）MSI和MALDI-MSI對枯草芽孢桿菌菌落生物膜進行分析，并獲得不同的細胞分子物種的子集。MetA-LDI-MSI主要用于鑒定多種小分子和中性脂質(zhì)，而MALDI-MSI在檢測其他脂質(zhì)和表面活性蛋白質(zhì)方面更為容易。該研究表明MetA-LDIMSI能夠顯著提高微生物樣品成像的分子覆蓋范圍。

4 總結(jié)與展望

LC-MS和GC-MS已作為現(xiàn)代分析的“金標準”，廣泛應(yīng)用于各種實際應(yīng)用領(lǐng)域中復(fù)雜樣品的分析。在進行質(zhì)譜定性和定量分析之前，需要對復(fù)雜樣品進行提取、純化等前處理及色譜分離等步驟。在微生物菌株檢測和突變文庫篩選中，目前的主流實驗方法基于細胞代謝表型，包括搖瓶擴大培養(yǎng)、細胞破壁、分析物提取、純化、衍生化以及色譜分離等步驟。由于該過程耗時且效率低下，制約了微生物菌株的選育進程。MALDIMS是微生物突變文庫篩選的成熟平臺之一，具有高通量、非標記、高靈敏等優(yōu)點。該質(zhì)譜技術(shù)的樣品制備過程簡單，只需要將細菌樣品與基質(zhì)共同沉積在樣品靶板上進行共結(jié)晶。MALDI-MS需要在真空條件下完成細菌樣品的直接檢測，非常適合大分子量生物分子的分析。然而，MALDIMS仍有一些局限性。例如，在真空條件下采樣可能會限制不穩(wěn)定或揮發(fā)性小分子的檢測，同時基質(zhì)的應(yīng)用可能會破壞細胞結(jié)構(gòu)，這會影響表型分子的檢測。此外，MALDI-MS更適用于直接檢測革蘭氏陰性菌細胞膜或外泌代謝表型分子的分析。然而，對于直接檢測革蘭氏陽性菌，需要提前對細菌細胞樣品進行預(yù)處理，例如破壞細胞結(jié)構(gòu)或獲取全細胞裂解液。

AI-MS技術(shù)的發(fā)展突破了經(jīng)典電離方法中有關(guān)真空和負壓的限制。除了質(zhì)譜本身的優(yōu)點外，AI-MS在微生物菌株檢測和篩選中具有以下優(yōu)勢：①常壓敞開源，與真空電離源和常壓封閉源不同，AI-MS可在敞開的大氣壓環(huán)境中進行原位、表面和實時采樣分析活菌落，并可現(xiàn)場提取DNA；②高通量性，無復(fù)雜樣品前處理和色譜分離，單個樣品分析時間短，分析過程快速直接；③非標記的活體檢測，可作為通用工作流程，滿足許多不同生物催化反應(yīng)的篩選需求；④質(zhì)譜成像，可視化菌落細胞表型分子的空間分布，以有效確認微生物菌株的身份。因此，AI-MS在合成生物學微生物菌株檢測和突變文庫篩選研究中具有重要作用。然而，AI-MS技術(shù)在微生物完整細胞分析方面存在一些局限性，這些局限性與AI源構(gòu)造和電離機制相關(guān)?；陔妵婌F的AI-MS技術(shù)本身是一種表面分析技術(shù)，適合直接檢測微生物細胞表面分子，如外泌分子、細胞壁或細胞膜上分子。然而，AI源的電離能不足以直接解吸和電離胞內(nèi)分子，這使得利用此技術(shù)難以進行胞內(nèi)分子的直接檢測。同樣，基于等離子體的AI-MS技術(shù)由于電離能的限制也無法直接檢測微生物細胞?；诩す獾腁I-MS技術(shù)利用激光的能量來解吸細胞分子，并通過二次電離實現(xiàn)分子的電離。例如，LAREI-MS通過直接檢測細胞脂質(zhì)來篩選菌株，這些脂質(zhì)主要為磷脂，是細胞膜的主要成分之一。然而，基于激光的AI-MS技術(shù)在檢測微生物完整細胞時尚未能直接檢測胞內(nèi)代謝表型分子。因此，為了解決微生物突變文庫篩選中的共性技術(shù)問題，需要通過提高細胞解吸和電離效率來改進AI-MS技術(shù)，例如使用強有機試劑或高能量脈沖激光來高效釋放胞內(nèi)表型分子，并使用改進的AI源來提高細胞表型的電離效率。這些改進是AI-MS技術(shù)的發(fā)展方向。

目前，AI-MS技術(shù)已經(jīng)成為一種成熟的技術(shù)，在完整微生物細胞分析中具有重要的應(yīng)用價值。然而，在微生物突變文庫高通量篩選研究領(lǐng)域，AI-MS仍處于發(fā)展階段，并且要實現(xiàn)高通量篩選的標準化、自動化還需要進一步的努力。為了實現(xiàn)這一目標，需要打破專業(yè)技術(shù)壁壘，融合生物、化學、機械、計算機、信息學等多種學科，建設(shè)通用高通量篩選質(zhì)譜設(shè)備和方法體系，為微生物細胞工廠開發(fā)提供共性技術(shù)平臺?；贏I-MS的高通量篩選策略在未來的合成生物學研究中將發(fā)揮重要作用。