慢性乙型病毒性肝炎病人血漿中LncRNA PVT1、微RNA-31-5p表達(dá)水平與炎癥損傷程度的相關(guān)性分析

黎紹球，殷思純，林沛基

作者單位：東莞市人民醫(yī)院感染科，廣東 東莞523000

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球公共衛(wèi)生關(guān)注的主要問題之一，可導(dǎo)致急性或慢性乙型肝炎（CHB）［1-2］。據(jù)估計(jì)，中國每年約有7 000萬慢性乙肝表面抗原攜帶者（流行率5%～6%）［3］。為減輕HBV感染的負(fù)擔(dān)，肝臟炎癥和纖維化的早期準(zhǔn)確診斷至關(guān)重要。人漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1（PVT1）是近年發(fā)現(xiàn)的和炎癥相關(guān)的長鏈非編碼RNA。研究表明長鏈非編碼RNA（LncRNA） PVT1在膿毒癥及肺損傷發(fā)生的炎癥反應(yīng)中起重要作用［4-5］。朱怡卿［6］研究表明LncRNA PVT1高表達(dá)可能是診斷肝癌的潛在生物指標(biāo)。推測LncRNA PVT1的表達(dá)異常可能也與CHB有關(guān)。研究表明循環(huán)miRNA的水平與包括病毒性肝炎在內(nèi)的多種疾病有關(guān)［7］。微RNA-31-5p（miR-31-5p）在多種組織和細(xì)胞中表達(dá)，已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)其在不同類型的腫瘤中發(fā)揮不同作用［8］，但與乙型肝炎病毒的關(guān)系還未見報(bào)道。有研究表明，LncRNA PVT1存在可與miR-31靶向結(jié)合的位點(diǎn)［9］?；诖?，本研究旨在通過檢測CHB病人血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p的表達(dá)情況，探討其在CHB中的作用及與炎癥損傷程度的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取東莞市人民醫(yī)院2019年12月至2020年12月確診為CHB病人180例為CHB組，所有病人均行肝穿刺活檢，年齡范圍24～65歲，其中男性101例，女性79例，年齡（42.33±10.62）歲。根據(jù)炎癥損傷程度［10］分為G1組（66例）、G2組（58例）、G3組（41例）、G4組（15例）。參照Scheuer分級標(biāo)準(zhǔn)對肝纖維化程度進(jìn)行分期，無明顯肝纖維化（S0，S1）組（64例），明顯肝纖維化組（S2，S3）（78例），早期肝硬化（S4）組（38例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《慢性乙型病毒性肝炎防治指南（2015年更新版）》中CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)［11］；②病人或其近親屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①在過去6個(gè)月內(nèi)使用過抗病毒或免疫調(diào)節(jié)劑治療；②女性妊娠試驗(yàn)陽性；③酒精性肝病；④有細(xì)菌感染的受試者；⑤有丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒合并感染者；⑥合并糖尿病、甲狀腺功能障礙、自身免疫性疾病和心理問題。同時(shí)選取55例健康者為對照組，年齡范圍28～55歲，其中男性30例，女性25例，年齡（43.24±10.35）歲。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 均采集空腹靜脈血5 mL，放入離心機(jī)，采用10 000 r/min離心處理15 min后取血清置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫法測定腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β、IL-10、超敏C反應(yīng)蛋白（Hs-CRP）等炎性因子濃度。采用生化分析儀器及配套試劑盒檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷氨?；D(zhuǎn)移酶（GGT）等生化指標(biāo)的表達(dá)水平。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p水平 使用TRIzol（Invitrogen）試劑提取總RNA并使用miRNeasy Mini Kit（Qiagen，美國）進(jìn)行純化。在NanoDrop2000分光光度計(jì)上檢測RNA的濃度。取1 μg總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得互補(bǔ)DNA（cDNA）。以cDNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測LncRNA PVT1、miR-31-5p的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系為：2 μL cDNA模板，miS-cript SYBR?Green Mix 10 μL，正反向引物各0.5 μL，無RNA酶的滅菌水3.0 μL。反應(yīng)條件：先預(yù)變性95 ℃，10 min；然后以95 ℃變性10 s；60 ℃退火20 s；70 ℃延伸10 s的條件進(jìn)行，共設(shè)40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對血清LncRNA PVT1、miR-31-5p表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，參見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)表示，行χ2檢驗(yàn)；若符合正態(tài)分布，采用進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，兩組數(shù)據(jù)的組間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，總體有差異進(jìn)一步通過LSD法進(jìn)行兩兩比較；采用Pearson法分析LncRNA PVT1、miR-31-5p表達(dá)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料 對照組和CHB組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CHB組病人TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、Hs-CRP、ALT、AST、GGT均顯著高于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 CHB病人180例與健康者55例一般資料比較

2.2 LncRNA PVT1、miR-31-5p表達(dá)水平 CHB病人血清中LncRNA PVT1表達(dá)水平高于對照組，且表達(dá)水平隨著炎癥損傷程度增加而升高（P＜0.05）。CHB病人血清中miR-31-5p表達(dá)水平低于對照組，且表達(dá)水平隨著炎癥損傷程度增加而降低（P＜0.05）。見表3。

表3 CHB病人180例與健康者55例血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表達(dá)水平比較/

表3 CHB病人180例與健康者55例血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表達(dá)水平比較/

注：CHB為慢性乙型病毒性肝炎，LncRNA PVT1為長鏈非編碼RNA人漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1，miR-31-5p為微RNA-31-5p。①與對照組比較，P＜0.05。②與G1組比較，P＜0.05。③與G2組比較，P＜0.05。④與G3組比較，P＜0.05。

例數(shù)55 66 58 41 15 LncRNA PVT1 0.68±0.23 1.52±0.31①1.93±0.47①②2.57±0.63①②③3.42±1.03①②③④166.14＜0.001組別對照組G1組G2組G3組G4組F值P值miR-31-5p 0.96±0.24 0.85±0.22①0.79±0.18①②0.63±0.14①②③0.50±0.11①②③④26.12＜0.001

2.3 不同纖維化程度病人血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表達(dá)水平 不同纖維化程度的CHB病人血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 不同纖維化程CHB度病人血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表達(dá)水平比較/

表4 不同纖維化程CHB度病人血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表達(dá)水平比較/

注：CHB為慢性乙型病毒性肝炎，LncRNA PVT1為長鏈非編碼RNA人漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1，miR-31-5p為微RNA-31-5p。

組別無明顯肝纖維化組明顯肝纖維化組早期肝硬化組F值P值例數(shù)64 78 38 LncRNA PVT1 1.99±0.65 2.04±0.68 2.16±0.72 0.76 0.47 miR-31-5p 0.79±0.23 0.74±0.19 0.70±0.18 2.48 0.086

2.4 LncRNA PVT1與miR-31-5p的相關(guān)性分析本研究中LncRNA PVT1、miR-31-5p數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)顯著性均大于0.05，可直接進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。分析結(jié)果顯示，CHB病人血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.36，P＜0.05），見圖1。

圖1 慢性乙型病毒性肝炎病人血清中LncRNA PVT1與miR-31-5p表達(dá)的相關(guān)性分析

2.5 血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表達(dá)水平與炎性因子的相關(guān)性分析 本研究中CHB病人血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p及炎性因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、Hs-CRP、ALT、AST、GGT、IL-10）數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)顯著性均大于0.05，可直接進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果表明miR-31-5p與TNF-α、IL-6、IL-1β、Hs-CRP、ALT、AST、GGT、IL-10呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），LncRNA PVT1與TNF-α、IL-6、IL-1β、Hs-CRP、ALT、AST、GGT、IL-10均呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表5。

表5 LncRNA PVT1、miR-31-5p表達(dá)水平與炎性因子的相關(guān)性

3 討論

CHB病毒感染是一種可能危及生命的肝臟疾病，具有嚴(yán)重的并發(fā)癥，如肝硬化和肝細(xì)胞癌，嚴(yán)重威脅著病人的健康［12］。一般來說CHB的病變與炎癥和纖維化有關(guān)。肝組織的炎癥等級反映了肝損傷和肝炎激活的現(xiàn)狀［13］。

LncRNA是一種大于200個(gè)核苷酸的RNA分子，不編碼蛋白質(zhì)，在細(xì)胞增殖、凋亡以及癌癥進(jìn)展過程等各個(gè)方面具有重要作用。據(jù)報(bào)道，位于8q24.21的LncRNA PVT1具有致炎和致癌的作用［14］。周芳等［15］研究表明LncRNA PVT1可通過上調(diào)miR-423-5p減輕支氣管上皮細(xì)胞凋亡，抑制哮喘相關(guān)炎性因子分泌。在本研究中CHB病人血清中LncRNA PVT1表達(dá)水平高于對照組，且隨著炎癥損傷程度加重而升高，表明LncRNA PVT1與病人的炎癥損傷程度密切相關(guān)，其表達(dá)上調(diào)可能加重炎癥反應(yīng)，可能作為預(yù)測CHB病人炎癥損傷程度的血清學(xué)指標(biāo)。進(jìn)一步研究顯示血清中LncRNA PVT1與TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、Hs-CRP、ALT、AST、GGT均呈正相關(guān)，表明發(fā)病過程中機(jī)體內(nèi)發(fā)生劇烈的炎癥反應(yīng)，釋放大量炎性因子，LncRNA PVT1可能通過影響或調(diào)節(jié)炎性因子的產(chǎn)生，并影響病人的肝功能，進(jìn)而參與CHB的發(fā)生、發(fā)展過程，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

miRNAs是小的非編碼RNA，通過與細(xì)胞信使RNA的相互作用在調(diào)節(jié)各種生物過程中發(fā)揮重要作用［16］。據(jù)報(bào)道，miRNAs已被應(yīng)用于感染性疾病的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，如人類結(jié)核病、膿毒癥和病毒性肝炎［17］。CHBmiR-31是一種炎性相關(guān)微RNA，它的特異性表達(dá)與脊髓損傷、糖尿病腎病等疾病有關(guān)［18］。miR-31-5p是miR-31成員之一，研究表明miR-31-5p在結(jié)腸癌、口腔鱗癌以及前列腺癌等腫瘤中呈高表達(dá)［19］。Zhao等［20］發(fā)現(xiàn)，與正常肝細(xì)胞相比，miR-31-5p在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系中下調(diào)。在本研究中CHB病人血清中miR-31-5p表達(dá)水平低于對照組，且隨著炎癥損傷程度加重而降低，表明miR-31-5p表達(dá)異常與CHB疾病的發(fā)生及體內(nèi)炎癥損傷程度密切相關(guān)。本研究通過Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示CHB病人血清中miR-31-5p表達(dá)水平和TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、Hs-CRP、ALT、AST、GGT均呈負(fù)相關(guān)，提示miR-31-5p可能通過影響機(jī)體內(nèi)炎性因子指標(biāo)及肝功能指標(biāo)水平，影響炎癥損傷程度，進(jìn)一步影響疾病的發(fā)展進(jìn)程。劉晶晶等［21］研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-31表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這與本研究結(jié)果相符。本研究CHB病人血清中LncRNA PVT1與miR-31-5p表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)，提示二者之間存在某種負(fù)反饋機(jī)制，共同作用于疾病的發(fā)生發(fā)展，二者之間的具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，LncRNA PVT1、miR-31-5p與CHB病人炎癥損傷程度密切相關(guān)，LncRNA PVT1、miR-31-5p二者聯(lián)合檢測可能作為CHB病人病情評估的生物學(xué)指標(biāo)，具有重要的臨床意義。但本研究尚存在不足之處，結(jié)果可能存在一定偏倚，有待后續(xù)進(jìn)行研究完善。