基于p-Akt/p-GSK3β/GSK3β通路靈芝多糖對糖尿病大鼠心肌重構(gòu)及保護作用研究

牛尚梅，王麗萍，楊英燾，宋瀟萌，胡新磊

作者單位：邯鄲市第一醫(yī)院，a內(nèi)分泌二科，b心內(nèi)四科，河北 邯鄲056002

糖尿病心肌?。―CM）是由糖尿病引起的嚴重心肌病變，主要表現(xiàn)為心臟結(jié)構(gòu)和功能異常，最終引發(fā)心力衰竭或心源性猝死，也是糖尿病病人的重要致死原因之一［1］?，F(xiàn)階段認為，DCM的主要發(fā)病機制為心肌纖維化、心臟自主神經(jīng)病變、心肌代謝紊亂及心肌細胞凋亡［2］。靈芝多糖（GLP）是靈芝的主要活性組分，具有多種藥理作用，如抗腫瘤、增強免疫功能、降血糖、抗衰老、抗炎等［3］?，F(xiàn)代藥理研究表明，GLP降血糖作用靶點多且效果顯著［4］?；诖?，本研究于2020年12月至2021年12月采用鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射法制作糖尿病動物模型，評估GLP對糖尿病大鼠心肌重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 90只SPF級雄性SD大鼠，10周齡，體質(zhì)量（210±20）g，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供，許可證號SCXK（滬）2017-0010，室溫飼養(yǎng)。本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。

1.2 藥物、主要試劑和儀器 GLP（濃度99%，武漢普洛夫生物科技有限公司），STZ（上海寶曼生物科技有限公司），60%高脂高糖飼料（脂肪熱量60%、蔗糖熱量22%，南通特洛菲飼料科技有限公司），長效胰島素（丹麥諾和諾德公司）。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國Abcam公司），BCA蛋白定量分析試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司），AccuCheck血糖檢測儀（德國羅氏公司），絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）抗體、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶（p-Akt）抗體、糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）抗體、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（p-GSK3β）抗體（美國Cell signaling technology公司），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ig G（英國Abcam公司），RM2235徠卡切片機（德國Leica公司），PowerPac電泳儀、iBright CL750成像系統(tǒng)（美國ThermoFisher Scientific公司）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠模型建立 將90只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、GLP低、中、高劑量組，各18只。參照文獻［5］方法，采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射小劑量STZ的方法建立2型糖尿病大鼠模型：模型組、GLP低、中、高劑量組大鼠連續(xù)給予高脂高糖飼料飼喂4周后，檢測空腹葡萄糖耐量，72只大鼠均出現(xiàn)胰島素抵抗，第5周禁食12 h，制備1%STZ溶液（溶于pH4.2的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液中），一次性腹腔注射30 mg/kg 1%STZ溶液，建立2型糖尿病大鼠模型，在注射STZ 3 d后，大鼠禁食12 h，采集大鼠尾靜脈血0.5 mL，檢測空腹血糖，非同日連續(xù)3次測定血糖均＞11.1 mmol/L為造模成功，繼續(xù)使用高糖高脂飼料飼養(yǎng)8周，維持血糖＞11.1 mmol/L。其間血糖過高大鼠皮下注射胰島素（10 U/kg）治療，使血糖維持在11.1 mmol/L以上［6］。對照組腹腔注射檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，以普通飼料喂養(yǎng)。造模期間，模型組死亡3只，GLP低劑量組死亡2只，對照組、GLP中、高劑量組各隨機剔除3只、1只、3只，各組均保留15只建模成功大鼠用于實驗。

1.3.2 干預(yù)方法 GLP低、中、高劑量組均按照10 mL/kg體質(zhì)量，灌胃濃度25、50、100 mg/kg的GLP［7］，對照組和模型組給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。

1.3.3 一般指標觀察 在給藥前及給藥4周后，各組大鼠禁食12 h，稱取大鼠體質(zhì)量，并通過尾靜脈采血，檢測各組大鼠血糖變化。采血完畢后，斷頸處死，打開胸腔取出心臟并除去周圍組織，預(yù)冷生理鹽水沖洗，吸干水分，取左心室（含室間隔部分）在天平上準確稱質(zhì)量。左心室指數(shù)=左心室質(zhì)量/體質(zhì)量（mg/g）。

1.3.4 組織學(xué)觀察 各組取10只大鼠的一部分心肌組織10%多聚甲醛中固定1 h后，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗3次×5 min，加入0.1% Trition X-100冰浴孵化2 min，再用PBS漂洗2次×5 min，蛋白酶K常溫孵育20 min；PBS漂洗3次后加入TUNEL反應(yīng)液37 ℃避光孵育60 min；PBS清洗5 min，加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，PBS清洗5 min×3次，防熒光淬滅封片劑封片。隨機計算5個高倍（×400）視野下的紅褐色細胞即陽性細胞數(shù)。凋亡指數(shù)=各視野陽性細胞數(shù)/視野所有細胞總數(shù)×100%。

一部分含心尖部左心室心肌用10%多聚甲醛中固定24 h后，石蠟包埋制成厚度為4 μm的切片，進行Masson染色，心肌膠原纖維呈藍色。觀察各組大鼠心肌病理變化，用Image J軟件分析Masson染色后心肌組織膠原容積分數(shù)（CVF）=膠原面積/總面積×100%。

1.3.5 TGF-β1、MMP-2、MMP-9水平檢測 取各組剩余5只大鼠心肌組織50 mg，加入1 mL PBS進行勻漿，3 000 r/min離心10 min（離心半徑為10 cm），取上清，按照ELISA試劑盒執(zhí)行各流程，酶標儀450 nm處測定OD值，根據(jù)樣品吸光度值計算樣品TGF-β1、MMP-2、MMP-9濃度。

1.3.6 心肌組織中p-Akt、Akt、p-GSK3β和GSK3β蛋白表達水平 無菌取左心室心肌組織100 mg，加裂解液后充分剪碎，勻漿，離心機離心30 min（4 ℃、12 000 r/mim），蛋白定量后取20 μg樣品與等量上樣緩沖液混勻，進行SDS-PAGE電泳，100 V電轉(zhuǎn)30 min，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，加入適量封閉液封閉2 h（室溫），將膜放入1∶1 000稀釋的一抗（p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β）中，搖床孵育過夜（4 ℃），TBST洗膜5 min/次，共2次，再放入1∶10 000稀釋的二抗，搖床孵育1 h（室溫），TBST洗膜每次5 min，共3次，將PVDF膜正面朝上置于凝膠成像儀的顯影區(qū)，均勻滴加顯影液，用濾紙去除PVDF膜周邊多余的顯影液，避光顯色，暗室中進行曝光、顯影，采用Image J軟件分析，目的蛋白相對表達水平以目的蛋白條帶/內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件處理，采用KS檢驗計量資料正態(tài)分布特性，均符合正態(tài)分布，以表示，多組間比較采用單因素方差分析，給藥前后血糖和體質(zhì)量比較采用重復(fù)測量資料的協(xié)方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般指標比較 給藥前，各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。給藥后，模型組大鼠體質(zhì)量較對照組降低，血糖、左心室質(zhì)量和心室指數(shù)均較對照組升高（P＜0.05）；GLP不同劑量組大鼠體質(zhì)量較模型組增加，血糖、左心室質(zhì)量和心室指數(shù)均較模型組降低（P＜0.05）；給藥后GLP不同劑量組大鼠體質(zhì)量呈劑量依賴性增加，血糖、左心室質(zhì)量和心室指數(shù)與GLP呈劑量依賴性降低（P＜0.05）。見表1，2。

表1 各組大鼠血糖比較/（mmol/L，）

表1 各組大鼠血糖比較/（mmol/L，）

注：GLP為靈芝多糖。①與對照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。③與GLP低劑量組比較，P＜0.05。④與GLP中劑量組比較，P＜0.05。

給藥后4.45±0.38 20.34±2.78①16.36±1.12①②13.23±0.97①②③9.84±1.01①②③④250.58＜0.001組別對照組模型組GLP低劑量組GLP中劑量組GLP高劑量組F值P值鼠數(shù)15 15 15 15 15給藥前4.34±0.46 20.18±2.34①20.29±2.18①20.46±1.87①19.97±1.94①213.98＜0.001

表2 各組大鼠體質(zhì)量和心室指數(shù)比較/

表2 各組大鼠體質(zhì)量和心室指數(shù)比較/

注：GLP為靈芝多糖。①與對照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。③與GLP低劑量組比較，P＜0.05。④與GLP中劑量組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組GLP低劑量組GLP中劑量組GLP高劑量組F值P值給藥后心室指數(shù)/（mg/g）2.21±0.18 3.46±0.23①3.17±0.21①②2.84±0.18①②③2.57±0.16①②③④96.31＜0.001鼠數(shù)15 15 15 15 15給藥前體質(zhì)量/g 238.45±6.23 239.12±7.25 240.36±6.84 239.65±8.12 239.71±7.36 0.15 0.963體質(zhì)量/g 297.64±3.56 248.17±4.37①256.21±4.61①②263.76±5.12①②③272.34±4.78①②③④265.75＜0.001左心室質(zhì)量/mg 657.58±21.46 858.67±29.45①811.52±23.12①②749.08±36.18①②③699.91±39.24①②③④105.48＜0.001

2.2 各組大鼠心肌組織CVF比較 對照組大鼠心肌組織存在少許纖維組織且均勻分布，CVF為（2.59±0.27）%；模型組大鼠心肌組織存在大量纖維組織，有大量束狀的藍色膠原纖維聚集于血管和心肌細胞周圍，CVF為（16.12±1.43）%，較對照組心肌組織纖維化嚴重；GLP各劑量組大鼠心肌組織存在纖維組織，GLP低、中、高劑量組CVF分別為（13.17±1.27）%、（10.41±0.96）%、（7.36±0.62）%，隨GLP濃度增加CVF逐漸減少（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)比較 對照組大鼠心肌組織僅有少量凋亡細胞，凋亡指數(shù)為（2.17±0.24）%，模型組凋亡指數(shù)為（20.32±1.78）%，較對照組增加（P＜0.05）；GLP低、中、高劑量組凋亡指數(shù)分別為（15.31±1.15）%、（12.18±1.02）%、（9.66±0.74）%，較模型組減少（P＜0.05）；心肌細胞凋亡指數(shù)與GLP呈劑量依賴性降低（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠心肌組織TGF-β1、MMP-2、MMP-9水平比較 模型組心肌組織TGF-β1、MMP-2、MMP-9水平均較對照組升高（P＜0.05）；GLP不同劑量組TGF-β1、MMP-2、MMP-9水平均較模型組降低（P＜0.05）；TGF-β1、MMP-2、MMP-9水平與GLP呈劑量依賴性降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織TGF-β1、MMP-2、MMP-9水平比較/（μg/L，）

表3 各組大鼠心肌組織TGF-β1、MMP-2、MMP-9水平比較/（μg/L，）

注：TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長因子β1，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶-9，GLP為靈芝多糖。①與對照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。③與GLP低劑量組比較，P＜0.05。④與GLP中劑量組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組GLP低劑量組GLP中劑量組GLP高劑量組F值P值MMP-9 126.34±10.23 347.65±23.15①302.46±23.48①②257.44±19.77①②③176.17±12.45①②③④117.85＜0.001鼠數(shù)5 5 5 5 5 TGF-β1 126.34±10.43 257.65±18.15①214.46±17.44①②184.44±14.37①②③163.17±11.54①②③④57.62＜0.001 MMP-2 141.23±12.12 268.43±19.35①227.18±17.36①②189.68.±16.89①②③152.74±15.23①②③④51.91＜0.001

2.5 各組大鼠心肌組織p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β蛋白水平比較 模型組p-Akt、p-GSK3β蛋白表達水平較對照組顯著降低（P＜0.05）；GLP不同劑量組p-Akt、p-GSK3β蛋白表達水平較模型組顯著增加（P＜0.05）；p-Akt、p-GSK3β蛋白表達水平與GLP呈劑量依賴性增加（P＜0.05）。見圖1，表4。

表4 各組大鼠心肌組織p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β蛋白水平比較/

表4 各組大鼠心肌組織p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β蛋白水平比較/

注：p-Akt為磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶，Akt為絲氨酸/蘇氨酸激酶，p-GSK3β為磷酸化糖原合成酶激酶-3β，GSK3β為糖原合成酶激酶-3β，GLP為靈芝多糖。①與對照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。③與GLP低劑量組比較，P＜0.05。④與GLP中劑量組比較，P＜0.05。

p-GSK3β/GSK3β 0.78±0.06 0.39±0.04①0.47±0.03①②0.54±0.04①②③0.64±0.05①②③④56.45＜0.001組別對照組模型組GLP低劑量組GLP中劑量組GLP高劑量組F值P值鼠數(shù)5 5 5 5 5 p-Akt/Akt 0.93±0.08 0.42±0.03①0.54±0.04①②0.66±0.06①②③0.78±0.05①②③④66.30＜0.001

3 討論

DCM時心肌細胞凋亡增加、心肌間質(zhì)纖維化。左室舒張功能受損，后期收縮功能亦受損，最終導(dǎo)致心力衰竭［8］。持續(xù)高血糖、高血壓、脂代謝紊亂、血液黏稠度增加、中心性肥胖、高胰島素血癥、胰島素抵抗是導(dǎo)致DCM心臟病變的重要原因［9］。該病的早期表現(xiàn)為左心室舒張功能不全，隨著病情的進展，逐步出現(xiàn)心肌細胞肥大、心肌纖維化甚至心肌細胞凋亡［10］。有研究［11］表明，GLP可以增強過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性從而有效降低血糖水平，對糖尿病小鼠的心肌組織起到保護作用。本研究基于Akt/GSK-3β通路對DCM大鼠心肌組織炎性因子、纖維化因子的水平和心肌組織凋亡水平，進一步研究GLP對DCM大鼠心肌重構(gòu)及保護作用。

古書記載靈芝具有養(yǎng)心安神、補氣益血、滋補強壯、扶正固本的功效，GLP可雙向調(diào)節(jié)人體機能平衡，調(diào)動機體內(nèi)部力，改善新陳代謝機能，提高自身免疫能力，促使全部的內(nèi)臟或器官機能正常。GLP對血糖、胰島素敏感性、炎性因子及其血脂水平具有調(diào)控作用，但具體調(diào)控機制尚需進一步探究。本研究給藥后GLP不同劑量組大鼠體質(zhì)量較模型組顯著增加，血糖、左心室質(zhì)量和左心室指數(shù)均較模型組顯著降低，提示GLP可以顯著降低DCM大鼠血糖和心室指數(shù)，改善DCM大鼠心肌重構(gòu)。有研究［12］表明，GLP顯著減少心肌組織丙二醛的產(chǎn)生、增加血清抗氧化酶的活性，降低心肌纖維化程度，延緩糖尿病心肌纖維化并發(fā)癥的進程。本研究中Masson染色和TUNEL染色可見GLP不同劑量組大鼠心肌組織纖維化區(qū)域和凋亡指數(shù)均較模型組顯著降低，提示GLP有效改善了DCM引起的心肌纖維化與心肌細胞凋亡，改善了心室結(jié)構(gòu)的異常。

TGF-β1是參與心肌膠原重構(gòu)發(fā)生的關(guān)鍵細胞因子，可以促進心肌纖維化形成，是心肌纖維化重要的標志物［13］。TGF-β1對細胞生長分化、細胞外基質(zhì)沉積也具有潛在作用［14］。MMPs是降解細胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶，心肌中的MMPs能夠降解除多糖以外的所有基質(zhì)成分［15］。MMP2的過度升高會引起成纖維細胞的增生以及促進炎癥細胞向炎癥部位趨化、聚集［16］。MMP9能激活生長因子，促進成纖維細胞增殖和活化，導(dǎo)致膠原纖維大量增生［17］。本研究中GLP不同劑量組TGF-β1、MMP-2和MMP-9水平均較模型組降低，提示GLP顯著降低心肌組織中TGF-β1、MMP-2、MMP-9水平，抑制心肌組織纖維化，改善心室肌組織異常。

Akt是磷脂酸肌醇-3-激酶下游的重要信號分子，參與調(diào)節(jié)細胞的分裂、分化、生長、代謝以及凋亡等一系列生理及病理過程，GSK-3β是Akt重要的下游底物之一，活化的Akt能與GSK-3β結(jié)合，誘導(dǎo)GSK-3β向細胞膜轉(zhuǎn)位，磷酸化其N端的Ser9活性位點，并使之失活［18］。Akt/GSK-3β通路受損與胰島素抵抗相關(guān)性疾病，如2型DCM［17］、糖尿病腎?。?9］、心血管疾病［20］等密切相關(guān)。本研究中GLP不同劑量組p-Akt、p-GSK3β蛋白表達水平較模型組顯著增加，提示GLP激活了p-Akt/p-GSK3β/GSK3β通路，增強DCM大鼠心肌組織p-Akt和p-GSK3β的表達，表明DCM的保護及治療作用與Akt/GSK-3β信號通路關(guān)系密切。

綜上所述，GLP可降低DCM大鼠血糖，改善心臟重構(gòu)并保護DCM大鼠心肌組織，其機制可能與GLP調(diào)節(jié)Akt/GSK-3β通路，抑制心肌細胞凋亡和心肌組織纖維化有關(guān)，為GLP應(yīng)用于DCM的臨床治療提供理論支持。但本研究還存在一定局限性，GLP對Akt/GSK-3β通路調(diào)控作用，尚需進一步采用特異性激活劑/抑制劑進行驗證。