高效液相色譜法測定飼料中泰萬菌素含量

馬瑛潔，王淑婷，周蘭蘭，牛蓉，孫志文

（1.河南宏信檢測技術有限公司農產食品檢測中心，河南南陽 473000； 2.牧原食品股份有限公司品控部，河南南陽 473000； 3.北京市農產品質量安全中心，北京 102629）

乙酰異戊酰泰樂菌素（泰萬菌素）屬于第3 代大環(huán)內酯類動物專用抗生素，是泰樂菌素經化學改造而生成的一種衍生物[1]，在泰樂菌素的羥基位置乙?；?-羥基位置異戊?；?， 由英國伊科動物保健品有限公司開發(fā)，其藥效是紅霉素、泰樂菌素的5～10 倍，是替米考星、阿奇霉素的2～5 倍[2-5]。 目前制劑常使用的是酒石酸鹽。 泰萬菌素對比泰樂菌素等大環(huán)內酯類藥物而言，對豬痢疾、豬氣喘病、豬增生性腸炎和雞支原體感染等疾病具有很好的防治效果[6-9]。 泰萬菌素也具有高效、低毒、低殘留、與其他大環(huán)內酯類抗生素不存在交叉耐藥現象及對畜禽支原體病有治療作用等優(yōu)點，是一種優(yōu)良的大環(huán)內酯類抗生素和飼料添加劑[10-14]。

由于目前抗生素在養(yǎng)殖企業(yè)常存在超劑量使用、不該用時亂用或者無規(guī)律服用抗生素等抗生素濫用現象， 導致抗生素耐藥性以及環(huán)境污染問題日益嚴重，致使人們越來越重視抗生素的使用問題[15-16]。2019年7 月，中華人民共和國農業(yè)農村部發(fā)布194 號公告要求飼料生產企業(yè)停止生產含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料。該公告自2020 年7月1 日起開始執(zhí)行[17-19]。政府加強對飼料加藥的管控，減抗、禁抗已是大勢所趨。 這就需要我們盡快建立飼料中的抗生素質量檢測標準，為企業(yè)、政府的管控提供檢測方法。

目前， 泰萬菌素制劑產品在 《獸藥質量標準》2017 年版中使用的檢測方法是抗生素微生物鑒定法，但該方法存在前處理復雜、靈敏度低、準確度低及檢測種類受限等缺點，且飼料中泰萬菌素的檢測方法仍是空白[20-21]。 本文研究了用高效液相色譜法測定飼料中泰萬菌素含量的方法，參考獸藥典中對泰萬菌素組分的檢查方法，以泰萬菌素組分A 外標法定量。 該方法重復性好，靈敏度高，檢測速度快，可以為飼料中泰萬菌素含量的檢測提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泰萬菌素標準品（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所購置批號，K0692108，含量80.0%，CAS 號：63409-12-1，分子式：C53H87NO19）；甲醇、乙腈（美國天地有限公司；4 L）；醋酸銨（分析純；國藥集團化學技術有限公司）；醋酸（色譜純；國藥集團化學技術有限公司）；C18 色譜柱（安捷倫）；試驗用水為超純水；0.22 μm 微孔濾膜：通用型。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀配紫外檢測器（Alliance E2695-2489）， 美國Waters 公司； 電子天平（MS105DU），Mettler-Toledo；離心機（DD5000），四川蜀科儀器有限公司；多管混勻儀（MVM-200），南京祥中生物科技有限公司；超聲波清洗器（UC-4480），深圳市朗杰超聲電器有限公司。

1.3 泰萬菌素標準儲備液（1 000 μg/mL）

取泰萬菌素對照品適量（相當于泰萬菌素10 mg）于10 mL 容量瓶中，精密測定。 用乙腈溶解并稀釋成濃度為1 000 μg/mL 的溶液，作為標準儲備液。 置于-20 ℃冰箱中避光保存，有效期為12 個月。

1.4 泰萬菌素標準中間液（100 μg/mL）

精密量取標準儲備液1.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用70%甲醇水稀釋并定容，混勻。置于4 ℃冰箱中避光保存，有效期為3 個月。

1.5 標準曲線的制備

準確移取適量泰萬菌素標準中間液， 用0.15 mol/L醋酸銨溶液∶乙腈∶醋酸（45∶45∶10，V∶V∶V）稀釋定容，配制標準系列溶液， 濃度為1、5、10、20、50 及100 μg/mL，上機前過濾，待測。

1.6 試驗方法

1.6.1 樣品制備。 取無藥物添加的豬用配合飼料樣品500 g 左右， 粉碎至可通過1 mm 孔徑篩后， 充分混勻，存儲于廣口瓶內密封備用。

1.6.2 樣品提取。 稱取試樣約5 g（精確至0.01 g）于50 mL 容量瓶內中， 加0.15 mol/L 醋酸銨溶液∶乙腈∶醋酸（45∶45∶10，V∶V∶V）20 mL，多管混勻儀2 500 r/min混合1 min，超聲提取15 min，4 000 r/min 離心5 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜后作為試樣溶液，供上機使用。

1.6.3 色譜條件。色譜柱：250 mm×4.6 mm，5-Micron，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。流速：1.2 mL/min。 檢測波長：280 nm。進樣量：10 μL。流動相：0.15 mol/L。醋酸銨溶液∶乙腈∶醋酸（45∶45∶10，V∶V∶V）。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品提取溶劑選擇。 泰萬菌素分子式是C53H87H9·x（C4H6O6），分子量1 192.343 7，易溶于甲醇，可溶于水、丙酮或氯仿，微溶于乙酸乙酯和乙醚，幾乎不溶于乙烷。2017 版《獸藥質量標準》中對泰萬菌素相關制劑檢查組分時選擇的稀釋溶液是流動相0.15 M 醋酸銨溶液∶乙腈∶醋酸（45∶45∶10，V∶V∶V）。本研究選取超純水、70%甲醇、 醋酸銨-醋酸-乙腈溶液3 種提取液，取空白飼料樣品5 g，加標至100 mg/kg，分別加入以上3 種不同提取液20 mL，振蕩混勻1 min，超聲提取20 min，4 000 r/min 離心5 min，每種提取液重復試驗3 次， 取上清液過0.22 μm 微孔濾膜后上機。 結果顯示，當提取液為0.15 M 醋酸銨溶液∶乙腈∶醋酸（45∶45∶10，V∶V∶V）時，平均回收率最高，為112.9%（表1），最終選取醋酸銨-醋酸-乙腈溶液為提取溶液。

表1 不同提取溶劑對泰萬菌素提取率的影響

2.1.2 樣品提取方式、提取時間選擇。 使用同一份制備好的樣品，稱取5 g，分別使用振蕩提取法和超聲提取法2 種提取方式，每種提取方式提取時間分別為5、10、20 及30 min，4 000 r/min 離心5 min， 每種提取液重復試驗3 次，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜后上機。 結果顯示，振蕩和超聲2 種方式對泰萬菌素的提取無明顯影響，當提取時間超過10 min 后，回收率有所下降（表2）。為保證提取效果，本文選擇提取方式為超聲提取，提取時間為10 min。

表2 提取方式、提取時間對泰萬菌素提取率的影響

2.1.3 提取溫度、提取次數選擇。 本方法考查了不同提取溫度（25、40 及60 ℃），使用醋酸銨-醋酸-乙腈溶液為提取液，加入20 mL 提取1 次、每次加入10 mL提取2 次、每次分別加入7、7 和6 mL 提取3 次，確定提取次數對提取效果的影響，每組重復3 次。 結果顯示，提取溫度為25 ℃、提取1 次，即可達到提取效果（表3）。 隨著提取溫度的升高，回收率逐漸降低，且回收率不會隨著提取次數的增加而升高。 綜合提取效率和時間成本，最終選擇提取溫度為25 ℃，提取次數為1 次（20 mL）。

表3 提取溫度、提取次數對泰萬菌素提取率的影響

2.2 色譜條件選擇

2.2.1 柱溫及流速的選擇。 本方法考查了不同柱溫（25、35 和45 ℃），不同流速（1.0、1.2 和2.0 mL/min）對泰萬菌素的分離情況、保留時間和峰型的影響。 結果顯示，柱溫升高泰萬菌素保留時間逐漸縮短，但無明顯變化；流速增大時泰萬菌素峰形逐漸變窄，但同時儀器系統(tǒng)壓力逐漸增高，綜合考慮最終選擇色譜柱柱溫為25 ℃、流速為1.2 mL/min，在該條件下泰萬菌素的保留時間為10.9 min（圖1）。

圖1 泰萬菌素標準溶液色譜圖（280 nm）

2.2.2 檢測波長的選擇。2017 年版《獸藥質量標準》中泰萬菌素檢測波長是280 nm， 為驗證該波長是否為最佳檢測波長，本研究配制了100 μg/mL 泰萬菌素標準溶液，測試其在260～300 nm 的響應值，發(fā)現泰萬菌素在280 nm 處響應最大（圖2），因此確定280 nm 為最佳檢測波長。

圖2 泰萬菌素標準溶液50 μg/mL 在不同波長下的響應值

2.3 方法學考查

2.3.1 方法的線性范圍。 配制的1、5、10、20、50 和100 μg/mL 系列標準溶液，在上述色譜條件下，從低濃度到高濃度分別進樣，重復進樣2 針，按其所得峰面積的平均值與對應的標準溶液濃度作標準曲線，同時計算標準曲線的回歸方程和相關系數。 結果表明，泰萬菌素標準溶液濃度為1～100 μg/mL 時呈良好線性關系，其回歸方程為y=7 917.8x-478.68，相關系數R2=0.999 9（圖3）。

圖3 泰萬菌素標準曲線圖

2.3.2 方法的穩(wěn)定性。 將同一飼料樣品提取液混合均勻后分成兩份分別于室溫和4 ℃密閉冷藏放置24、48 和72 h，每種方案做3 個平行，取以上時間點的提取液，試驗泰萬菌素色譜峰面積及RSD 均沒有明顯變化（表4），說明該方法的穩(wěn)定性良好。

表4 穩(wěn)定性測定結果（n=3）

2.3.3 方法的檢出限和定量限。 根據2017 年版《獸藥質量標準》規(guī)定的允許用量折算泰萬菌素制劑在飼料匯總的最低允許用量，其中酒石酸泰萬菌素預混劑最低允許用量為50 mg/kg。選擇無藥物添加的豬混合飼料為基質進行加標，加標范圍為0.05～50 mg/kg，在上述色譜條件下每個樣品重復進樣2 次，按3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）確定方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結果顯示，泰萬菌素檢出限為2 mg/kg，定量限為4 mg/kg。

2.3.4 方法的精密度及回收率。 利用本研究建立的方法，對空白飼料進行加標試驗，5 g 空白飼料中分別添加不同濃度的泰萬菌素標準溶液，使加標水平為4、10、20、50 和100 mg/kg，每個加標水平做6 個平行樣品，進行回收率測定試驗。 結果顯示，平均回收率為94.6%～101.3%，相對標準偏差（RSD）為1.3%～6.0%（表5）。結果表明，該方法的準確性和精密度均較為理想，滿足飼料中泰萬菌素定量分析要求。

表5 泰萬菌素的平均回收率（n=6）

2.4 實際應用

本研究從市場上購買了5 種共20 批次飼料，其中豬用配合飼料2 種、禽用配合飼料3 種，不同種類飼料各4 批，使用上述方法進行檢測。 結果顯示，僅有1 批次禽用配合飼料中檢出泰萬菌素。 含量為2.318 mg/kg，低于本方法定量限，剩余樣品均無檢出。

3 結論

綜上所述，本研究建立了用高效液相色譜法測定飼料中泰萬菌素含量的方法， 該方法線性范圍廣、前處理簡單且檢測速度快，適用于測定飼料中泰萬菌素的含量，同時為飼料中泰萬菌素檢測提供了方法參考和借鑒。