特種沙棘酵素的制備及其體外降脂性能分析

商曰玲，王清，吳燕鈴，余曉紅

（鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051）

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）為胡頹子科沙棘屬的落葉性灌木或小喬木，又名沙棗、酸柳和黑刺等[1]。我國的沙棘面積占世界沙棘總面積的95%。研究表明，沙棘富含多種生理活性物質(zhì)和營養(yǎng)成分[2-3]，具有抗菌、抗病毒、抗?jié)?、抗衰老、抗輻射和增?qiáng)免疫力的作用[4]，在改善心腦血管系統(tǒng)和保護(hù)消化系統(tǒng)等方面均有較好的效果[5]。食用型酵素作為一種功能性食品，具有調(diào)節(jié)機(jī)體、預(yù)防疾病的作用，在良好的市場(chǎng)前景下，具有特殊保健功能的酵素產(chǎn)品研發(fā)潛力較大。故從食品安全性、功效以及經(jīng)濟(jì)效益綜合考慮，沙棘是開發(fā)食用型酵素的優(yōu)良植物資源之一[6-7]。目前，國內(nèi)關(guān)于食用沙棘酵素的研究相對(duì)較少，現(xiàn)有研究主要集中于其體外抗氧化性方面[8]，而在沙棘酵素降脂活性方面的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

本研究以沙棘果實(shí)為主要原料，經(jīng)過微生物自然發(fā)酵制備食用沙棘酵素，對(duì)得到的不同酵素產(chǎn)品與沙棘鮮果汁及市售沙棘原漿進(jìn)行理化指標(biāo)和抗氧化活性指標(biāo)比較分析，并通過測(cè)定其脂肪酶活性、膽固醇酯酶活性抑制率和膽固醇膠束溶解度抑制率研究特種沙棘酵素的降脂性能，以期為相關(guān)沙棘酵素產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘：甘肅省蘭州市新鮮漿果；橙子、紅糖、玫瑰：市售；沙棘原漿：新疆金之源生物科技有限公司。

蒽酮（分析純）：南京奧多福尼生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250、?；悄懰徕c（生化試劑）、膽固醇（分析純）、橄欖油（化學(xué)純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；對(duì)硝基苯基丁酸酯（生化試劑）：上海創(chuàng)賽科技有限公司；膽固醇酯酶（生物試劑）：南京都萊生物技術(shù)有限公司；總膽固醇試劑盒：廈門海菲生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

202-1A 型電熱恒溫干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；UV-2100 型紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；TGL-16G 型高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器有限公司；iMark 型酶標(biāo)儀：上海領(lǐng)成生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 沙棘酵素的制備

通過調(diào)整紅糖、沙棘與水的質(zhì)量比為1∶3∶10，利用微生物自然發(fā)酵6 個(gè)月，制備3 種不同配方的沙棘酵素。分別為純沙棘酵素：沙棘果360 g；沙棘橙肉酵素：沙棘果180 g、橙肉90 g；沙棘玫瑰酵素：沙棘果180 g、玫瑰花瓣90 g。

1.3.2 總糖含量的測(cè)定

采用蒽酮比色法[9]測(cè)定總糖含量。試管中分別加入濃度為8、16、24、32、40、48、56、64、72 μg/mL 的葡萄糖溶液，再加入3 mL 蒽酮試劑，振蕩搖勻后立刻沸水浴加熱5 min，取出后放入冰水中迅速冷卻（不斷晃動(dòng)），以1 mL 蒸餾水為空白重復(fù)上述操作。所得試管內(nèi)溶液在640 nm 波長下測(cè)定吸光度。以葡萄糖含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.007 4x+0.002 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 1。吸取酵素稀釋液1 mL 于試管中，按照上述方法進(jìn)行測(cè)定。將測(cè)得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，算出每毫升酵素所含葡萄糖含量。

1.3.3 總蛋白含量的測(cè)定

分別精密移取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1mg/mL）0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于試管中，補(bǔ)加蒸餾水至1.0mL 混勻，加入5.0 mL 考馬斯亮藍(lán)G250 溶液，搖勻后靜置5 min，595 nm 波長下測(cè)定吸光度，以蛋白溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.000 7x+0.011 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 7。吸取5 組酵素稀釋液1 mL，按照上述方法進(jìn)行測(cè)定。讀取吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出濃度。

1.3.4 總還原力的測(cè)定

分別吸取5 組樣品溶液1 mL 于試管中，加入1 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L、pH6.6）和1 mL 質(zhì)量濃度為1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后置于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，用1 mL質(zhì)量濃度為10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，3 000 r/min 離心10 min。取2 mL 上清液，加入2 mL 蒸餾水和0.4 mL FeCl3，混勻反應(yīng)10 min，紫外可見分光光度計(jì)700 nm 波長下檢測(cè)，平行3 次試驗(yàn)，取其平均值。吸光度越大，表示樣品還原能力越強(qiáng)。

1.3.5 DPPH·清除率的測(cè)定

于試管中分別加入1 mL 樣品溶液，2 mL DPPH 溶液（0.04 mg/mL），混勻，室溫靜置30 min 后，5 000 r/min離心10 min。取上清液于517 nm 波長下測(cè)吸光度。按式（1）計(jì)算DPPH·清除率。

式中：R 為DPPH·清除率，%；A0為1 mL 無水乙醇+2 mL DPPH 溶液的吸光度；A1為1 mL 樣品溶液+2 mL DPPH 溶液的吸光度；A2為1 mL 樣品溶液+2 mL無水乙醇的吸光度。

1.3.6 脂肪酶活性的測(cè)定

取若干個(gè)錐形瓶，加入1 mL 橄欖油與5 mL 磷酸緩沖液（0.025 mol/L、pH7.5），以不含橄欖油為空白，40 ℃水浴5 min。將1 mL 稀釋后的酵素加入錐形瓶中，搖勻計(jì)時(shí)5 min 后立即加入15 mL 95%乙醇，使酶反應(yīng)終止。在每個(gè)錐形瓶中加入2 滴酚酞指示劑，用0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液滴定，記錄消耗的NaOH 體積。按式（2）計(jì)算脂肪酶活性。

式中：P 為脂肪酶活性，U/mL；V 為滴定樣品時(shí)消耗NaOH 的體積，mL；V0為空白試驗(yàn)消耗NaOH 的體積，mL；50 為1 mL 0.05 mol/L NaOH 溶液相當(dāng)于脂肪酸50 μmol；n 為酵素稀釋倍數(shù)；15 為反應(yīng)時(shí)間15 min。

1.3.7 膽固醇酯酶活性抑制率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取2.77 g ?；悄懰徕c與5.844 g 氯化鈉，用磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L、pH7.0）定容至100 mL，作為整個(gè)反應(yīng)體系的緩沖液。對(duì)硝基苯基丁酸酯預(yù)先溶解在乙腈中，膽固醇酯酶預(yù)先溶解于無菌水中（1 U/μL）。膽固醇酯酶加入后反應(yīng)開始，室溫反應(yīng)5 min，于酶標(biāo)儀中415 nm 波長下測(cè)定吸光度。膽固醇酯酶活性測(cè)定反應(yīng)體系見表1。

表1 膽固醇酯酶活性測(cè)定反應(yīng)體系Table 1 Reaction system for determination of cholesterol esterase activity μL

按式（3）計(jì)算膽固醇酯酶活性抑制率。

式中：W 為膽固醇酯酶活性抑制率，%；A 為空白管溶液的吸光度；B 為空白對(duì)照管溶液的吸光度；C 為抑制管溶液的吸光度；D 為背景對(duì)照管溶液的吸光度。

1.3.8 膽固醇膠束溶解度抑制率的測(cè)定

分別準(zhǔn)確稱取0.537 g ?；悄懰徕c、0.077 g 膽固醇、0.141 g 油酸以及0.771 g 氯化鈉，用磷酸緩沖液（pH7.4）定容至100 mL，利用超聲波均質(zhì)，37 ℃靜置12 h。

將空白對(duì)照、100 μL 的酵素分別加入到4 mL 膠束溶液中，37 ℃培養(yǎng)2 h，并在16 000 r/min 下離心20 min，收集上清液用總膽固醇試劑盒測(cè)定膠束中膽固醇含量[10]。試驗(yàn)所用膽固醇酯酶活性為1 U/μL，抑制劑（酵素、果汁、原漿）稀釋10 倍進(jìn)行測(cè)定，即所得抑制率為不同樣品對(duì)10 U/μL 的膽固醇酯酶的抑制率。按式（4）計(jì)算膽固醇膠束溶解度抑制率。

式中：K 為膽固醇膠束溶解度抑制率，%；A 為空白溶液的膽固醇溶解度；B 為樣品溶液的膽固醇溶解度。

1.3.9 食用玫瑰沙棘酵素飲料指標(biāo)的測(cè)定

將制備的玫瑰沙棘酵素用純凈水稀釋10 倍，按常規(guī)飲料相關(guān)指標(biāo)送樣測(cè)定，由青島拜恩檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司實(shí)施。測(cè)定指標(biāo)及方法：感官（色澤、氣味）按照青島拜恩檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司實(shí)驗(yàn)室方法測(cè)定。能量、碳水化合物參照GB/Z 21922—2008《食品營養(yǎng)成分基本術(shù)語》[11]測(cè)定；蛋白質(zhì)參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[12]測(cè)定；脂肪參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》測(cè)定；維生素C 參照GB 5009.86—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中抗壞血酸的測(cè)定》測(cè)定；維生素E 參照GB 5009.82—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中維生素A、D、E 的測(cè)定》；鈉參照GB 5009.91—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉀、鈉的測(cè)定》[13]測(cè)定；微量元素鉀、鈣、鎂、鐵、銅、鋅、錳、硒參照GB 5009.268—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測(cè)定》[14]測(cè)定；菌落總數(shù)參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[15]測(cè)定；大腸菌群參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》測(cè)定；金黃色葡萄球菌參照GB 4789.10—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》測(cè)定；沙門氏菌參照GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)設(shè)定均為3 個(gè)平行，數(shù)據(jù)處理與作圖均采用Excel 2010。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘酵素與沙棘果汁、沙棘原漿產(chǎn)品的總糖含量、總蛋白含量及抗氧化能力對(duì)比分析

對(duì)純沙棘酵素、沙棘橙肉酵素、沙棘玫瑰酵素、沙棘果汁和市售沙棘原漿產(chǎn)品的總糖含量、總蛋白含量、總還原力及DPPH·清除率進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 不同沙棘酵素與沙棘果汁及市售沙棘原漿的總糖含量、總蛋白含量、總還原力、DPPH·清除率Fig.1 Comparison of total sugar，total protein content，total reducing power，and DPPH·scavenging rate of seabuckthorn Jiaosu products，seabuckthorn juice，and commercially available seabuckthorn raw pulp

沙棘經(jīng)發(fā)酵后，糖類被乳酸菌等微生物作為碳源利用，用于合成和分解代謝[16]，總糖濃度下降。由圖1a可知，純沙棘酵素、沙棘橙肉酵素、沙棘玫瑰酵素的總糖含量均低于沙棘果汁、市售沙棘原漿，沙棘玫瑰酵素的總糖含量最低，這可能是因?yàn)樯臣?、市售沙棘原漿制作時(shí)經(jīng)過了濃縮處理，去除水分，且未經(jīng)過發(fā)酵處理，因此糖分相對(duì)較高，而玫瑰中本身總糖含量就不高，占總物料的1/4，經(jīng)自然發(fā)酵后，可發(fā)酵性糖消耗殆盡，因此總糖含量最低。蛋白質(zhì)是維持人體正常機(jī)能的重要存在[17]，由圖1b 可知，沙棘果汁、市售沙棘原漿及沙棘橙肉的總蛋白含量低于純沙棘酵素和沙棘玫瑰酵素，可能與沙棘果及食用玫瑰中含有種類豐富的氨基酸有關(guān)[18]，同時(shí)經(jīng)過發(fā)酵的沙棘酵素增加了一些微生物酶的含量。蔣增良[19]通過研究樹莓發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的含量變化發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前期，蛋白質(zhì)含量一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。后期由于微生物對(duì)糖類物質(zhì)的利用和次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累導(dǎo)致部分微生物和細(xì)胞分解成小分子物質(zhì)，蛋白質(zhì)含量下降。110 d 后，發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量輕微上升，可能是微生物對(duì)原料本身進(jìn)行分解，導(dǎo)致原料蛋白質(zhì)逐漸溶出或菌體自溶所致[20]。

物質(zhì)的總還原力大小能夠反映其抗氧化活性[21]，且還原能力與吸光度呈正相關(guān)，吸光度越大即酵素還原力越強(qiáng)[22-23]。由圖1c 可知，沙棘玫瑰酵素的總還原力最高，這與玫瑰中含量豐富的槲皮素、原花青素等有關(guān)[24-25]。DPPH·清除率是一種常用于評(píng)估酵素體外抗氧化活性的另一指標(biāo)。由圖1d 可知，沙棘果汁和市售沙棘原漿的DPPH·清除率較高于純沙棘酵素、沙棘橙肉酵素及沙棘玫瑰酵素的DPPH·清除率，這可能是因?yàn)樯臣褪惺凵臣瓭{中含有更多的抗氧化活性物質(zhì)，如維生素C、多酚類化合物等。

由此可見，沙棘酵素中營養(yǎng)成分和生物活性成分的含量與發(fā)酵原料本身特性有關(guān)，經(jīng)發(fā)酵能夠較好地保留沙棘中的有益成分，甚至可以在一定程度上強(qiáng)化其生物活性。

2.2 特種沙棘酵素降脂試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 脂肪酶活性測(cè)定

不同樣品的脂肪酶活性對(duì)比見圖2。

圖2 不同樣品的脂肪酶活性對(duì)比Fig.2 Comparison of lipase activity among different samples

由圖2 可知，市售沙棘原漿中的脂肪酶活性最低，為26 U/mL；純沙棘酵素與沙棘橙肉酵素的脂肪酶活性相差不大，分別為67 U/mL 和63 U/mL，略高于沙棘果汁；沙棘玫瑰酵素脂肪酶活性最高，為147 U/mL。

脂肪酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，市售沙棘原漿中的脂肪酶活性低應(yīng)與其加工過程有關(guān)，市售產(chǎn)品要經(jīng)過高溫殺菌工藝，而脂肪酶的活性范圍一般在80 ℃以下，當(dāng)溫度在100 ℃以上時(shí)，脂肪酶結(jié)構(gòu)遭到不可逆的破壞，催化活性消失。另外，pH 值對(duì)脂肪酶活性產(chǎn)生重要影響，過酸或過堿的環(huán)境下酶易失活，酵素的pH 值普遍較低，這也可能是測(cè)得脂肪酶活性不高的原因。食用玫瑰中含量豐富的原花青素能夠提高脂肪酶活性，因此沙棘玫瑰酵素脂肪酶活性較為突出。

2.2.2 膽固醇酯酶活性抑制率測(cè)定分析

膽固醇酯酶是催化膽固醇酯水解成膽固醇和脂肪酸的一種酶，其抑制可以由多種物質(zhì)產(chǎn)生，包括蛋白質(zhì)、多糖和其他化合物。這些物質(zhì)可能通過多種機(jī)制（如競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和混合性抑制等）來抑制膽固醇酯酶的活性從而減少部分膽固醇的生成，降低其生物利用度。不同樣品的膽固醇酯酶活性抑制率對(duì)比結(jié)果見圖3。

圖3 不同樣品的膽固醇酯酶活性抑制率對(duì)比Fig.3 Comparison of cholesterol esterase inhibition rate among different samples

由圖3 可知，不同樣品的膽固醇酯酶活性抑制率排序?yàn)樯臣倒褰退兀炯兩臣退兀旧臣热饨退兀旧臣旧臣瓭{，分別為62%、60%、51%、49%、45%。沙棘玫瑰酵素具有更強(qiáng)的抑制膽固醇酯酶活性的能力，可能對(duì)降低血液中的膽固醇水平有益。文獻(xiàn)資料表明，沙棘中豐富的活性物質(zhì)具有一定的降脂效果。王文娟[26]用沙棘蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃處理4 周，2 型糖尿病小鼠的高血脂得到了顯著的改善，其血清總甘油三酯、總膽固醇顯著降低。另外沙棘花青素和沙棘多糖的效果也與沙棘蛋白的效果類似。本研究得出純沙棘酵素的膽固醇酯酶活性抑制率高于沙棘果汁和沙棘原漿，可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中，發(fā)酵基質(zhì)原有的能夠抑制膽固醇酯酶活性的物質(zhì)充分溶出，并產(chǎn)生了新的生物活性物質(zhì)，其對(duì)膽固醇酯酶具有一定的抑制作用。蘇建輝等[27]通過比較9 種功能因子對(duì)膽固醇酯酶活性的抑制效果，發(fā)現(xiàn)槲皮素具有最強(qiáng)抑制作用，而本試驗(yàn)所選用的食用玫瑰和橙子中槲皮素含量均較高，因此混合酵素的抑制率也較高[28-29]。

2.2.3 膽固醇膠束溶解度抑制率測(cè)定分析

進(jìn)入人體腸道內(nèi)的膽固醇需要溶解于膽固醇膠束內(nèi)才能被吸收，抑制膽固醇膠束溶解度就能有效抑制膽固醇的吸收、降低血液中膽固醇含量。不同樣品的膽固醇膠束溶解度抑制率測(cè)定結(jié)果見圖4。

圖4 不同樣品的膽固醇膠束溶解度抑制率對(duì)比Fig.4 Comparison of cholesterol micelle solubility inhibition rate among different samples

由圖4 可知，不同樣品的膽固醇膠束溶解度抑制率大小為沙棘玫瑰酵素＞沙棘果汁＞沙棘原漿＞純沙棘酵素＞沙棘橙肉酵素，分別為51%、43%、40%、38%、34%。

試驗(yàn)樣品測(cè)得的不同的膽固醇膠束溶解度抑制率，是多種物質(zhì)共同作用的結(jié)果，如植物甾醇能夠有效抑制膽固醇膠束溶解度，槲皮素也具有一定抑制作用。圖2～圖4 的測(cè)定結(jié)果均表明沙棘酵素具有一定的降脂效果，其中添加了食用玫瑰的混合酵素降脂性能優(yōu)于純沙棘酵素、沙棘橙肉酵素、沙棘果汁及市售沙棘原漿。

2.3 玫瑰沙棘酵素飲料測(cè)定結(jié)果分析

玫瑰沙棘酵素相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果為感官（色澤、氣味）淡黃色、半透明、無雜質(zhì)，有沙棘特有的果香；鉀、鈣、鎂、鐵、鋅、錳、硒含量分別為113.4、5.9、8.9、2.0、0.4、0.1、0.3 mg/kg，銅未檢出（＜0.1 mg/kg）；微生物中菌落總數(shù)＜10 CFU/mL，大腸菌群＜10 CFU/mL，金黃色葡萄球菌、沙門氏菌均未檢出；營養(yǎng)成分中能量及蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、鈉、維生素C、維生素E 含量均為0。

由上述檢測(cè)結(jié)果可看出，玫瑰沙棘酵素飲料中的鉀、鈣、鎂、鐵元素含量相對(duì)較高，還含有少量的鋅、錳、硒元素。有研究表明，玫瑰花的花瓣、枝條、葉片中均含有較大量的Ca、Mg、Fe 元素及少量的Cu、Mn 元素[30]，且沙棘果汁中也富含微量元素Fe、Zn、Mn、Cu。因此，玫瑰沙棘飲料中豐富的微量元素與原料本身的特性有關(guān)，該酵素飲料可以補(bǔ)充人體所缺乏的K、Ca、Mg、Fe、Zn 等元素。

3 結(jié)論

通過對(duì)特種沙棘酵素中的活性成分進(jìn)行測(cè)定與分析，發(fā)現(xiàn)沙棘酵素能夠較好地保留沙棘的營養(yǎng)成分和活性功能，甚至在降脂活性方面優(yōu)于沙棘；在發(fā)酵原料濃度幾乎一致的情況下，酵素中生物活性成分的含量與發(fā)酵原料本身的特性有關(guān)。降脂試驗(yàn)表明，混合沙棘酵素具有較好的降脂作用，尤其添加了食用玫瑰的混合酵素降脂效果更為明顯，其脂肪酶活性為147 U/mL，膽固醇酯酶活性抑制率為62%，膽固醇膠束溶解度抑制率為51%。進(jìn)一步對(duì)玫瑰沙棘酵素飲料測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其含有較多的鉀、鈣、鎂、鐵元素，還含有少量的鋅、錳、硒元素，表明該酵素除了具有較好的降脂作用，還可適當(dāng)補(bǔ)充人體所缺乏的一些元素。本研究為玫瑰沙棘酵素的制備提供了理論基礎(chǔ)，為相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供可行性方案。