脆紅李葉斑病病原菌的鑒定及抑菌藥劑的篩選

陳娜，喬興華，張嘉，周慧珍，王武，胡軍華*

脆紅李葉斑病病原菌的鑒定及抑菌藥劑的篩選

陳娜1，喬興華2，張嘉1，周慧珍1，王武3，胡軍華1*

(1.西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712；2.重慶市萬州區(qū)植物保護(hù)與果樹技術(shù)推廣站，重慶 404199；3.重慶農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹所，重慶 402260)

為明確脆紅李葉斑病的病原菌，采用組織分離法分離純化病原菌，通過形態(tài)學(xué)特征結(jié)合多基因聯(lián)合序列分析鑒定病原菌；采用孢子噴灑法和針刺接種法測(cè)試其致病性。結(jié)果表明：從脆紅李葉斑病病葉分離得到4株形態(tài)一致的真菌菌株，其代表菌株LY12的菌落呈圓形，菌絲白色至淺黃色；分生孢子器球形，黑色；分生孢子無色，單孢，多為橢圓形；采用ITS、和3段基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株LY12與荸薺莖點(diǎn)霉()聚為一支；根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定LY12為荸薺莖點(diǎn)霉()；致病力測(cè)試發(fā)現(xiàn)，該病原菌可以侵染川渝地區(qū)青脆李、半邊紅、青柰、金脆李和脆紅李的葉片、枝條和果實(shí)，葉片受害最嚴(yán)重，也可侵染尤力克檸檬、愛媛38雜柑、塔羅科血橙3個(gè)柑橘品種的葉片和果實(shí)；室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果表明，24種殺菌劑中，50% 啶酰菌胺水分散粒劑、38% 唑醚·啶酰菌胺懸浮劑、25% 嘧菌酯懸浮劑、75% 肟菌·戊唑醇水分散粒劑等11種殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，病原菌對(duì)50% 啶酰菌胺水分散粒劑最敏感，EC50為0.153 1 μg/mL。

脆紅李葉斑?。惠┧j莖點(diǎn)霉；致病力；藥劑篩選

脆紅李屬薔薇科(Rosaceae)李屬()核果類水果，是中國(guó)李選育實(shí)生后代的晚熟品種[1–2]。2019年川渝地區(qū)脆紅李的栽培面積已達(dá)7.62萬hm2，產(chǎn)量51.2萬t。截至2021年底，脆紅李的種植面積達(dá)到9.59萬hm2。隨著脆紅李種植面積的不斷擴(kuò)大，病害的識(shí)別和防控問題日益突出。目前，李真菌病害的研究主要集中在果實(shí)病害上，果生鏈核盤菌()、核果鏈核盤菌()和云南念珠菌()均可引起李褐腐病。該病害造成李果實(shí)僵果、腐爛[3–4]。李疔座霉菌()引起的李紅點(diǎn)病，果實(shí)散生很多深紅色小點(diǎn)，畸形，嚴(yán)重時(shí)造成果實(shí)脫落[5]。尖孢刺盤孢()和盤長(zhǎng)孢刺盤孢()引起布朗李和歐李的炭疽病，造成果實(shí)軟腐脫落或形成僵果掛在樹枝上[6–7]。吳玉珠等[8]報(bào)道，重慶萬州地區(qū)由新擬盤多毛孢(sp)和小孢擬盤多毛孢()復(fù)合侵染引起青脆李枯萎病，青脆李染病后葉片出現(xiàn)紅褐色病斑，嚴(yán)重時(shí)大量葉片脫落。伍文憲等[9]報(bào)道四川宣漢縣脆紅李果園 “火燒葉”病害，由鏈格孢菌()引起，葉片感病后出現(xiàn)紅褐色病斑，嚴(yán)重時(shí)葉片枯焦脫落，枝條枯死，影響果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)。

近年來，在四川汶川、重慶萬州和黔江等地的脆紅李果園發(fā)現(xiàn)一種脆紅李葉部病害，發(fā)病初期，葉片表面或葉緣出現(xiàn)黃褐色的不規(guī)則斑點(diǎn)，隨著病害的發(fā)展形成大面積黃褐色病斑，甚至葉片枯死凋落，嚴(yán)重影響脆紅李的產(chǎn)量和品質(zhì)。為明確造成脆紅李葉斑病的主要病原菌，筆者分離致病菌，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定，并通過室內(nèi)離體接種的方法測(cè)定病原菌對(duì)不同李和柑橘品種的致病力；隨后采用室內(nèi)毒力測(cè)定篩選有效防治藥劑，以期對(duì)脆紅李葉斑病害的防治提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料

2020年5月，在重慶萬州脆紅李果園采集葉斑病發(fā)病植株，帶回實(shí)驗(yàn)室于4 ℃冰箱保存；在重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所資源圃采集青脆李、半邊紅、青柰、金脆李和脆紅李健康無病的當(dāng)年生枝條、成熟葉片和膨大期果實(shí)；采集西南大學(xué)柑橘研究所國(guó)家果樹種質(zhì)重慶柑橘圃塔羅科血橙、尤力克檸檬和愛媛38雜柑的成熟葉片和膨大期果實(shí)。

24種供試藥劑：38% 唑醚·啶酰菌胺懸浮劑(山東金龍農(nóng)資有限公司)；29% 吡萘·嘧菌酯懸浮劑、37% 苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、50% 嘧菌環(huán)胺水分散粒劑(瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司)；40% 戊唑·醚菌酯懸浮劑(鎮(zhèn)江金安達(dá)塑膠有限公司)；50% 啶酰菌胺水分散粒劑、11.5% 吡唑醚菌酯乳油、250 g/L嘧菌酯懸浮劑、60% 唑醚·代森聯(lián)水乳劑(巴斯夫歐洲公司)；500 g/L異菌脲懸浮劑(上海創(chuàng)賽科技有限公司)；12.5% 烯唑醇可濕性粉劑、25% 溴菌腈乳油(江蘇托球農(nóng)化股份有限公司)；99% 噁霉靈粉劑(煙臺(tái)鑫潤(rùn)精細(xì)化工有限公司)；70% 戊唑·嘧菌酯水分散粒劑、450 g/L 咪鮮胺乳油(安道麥馬克西姆有限公司)；60% 霜脲· 醚菌酯可濕性粉劑(美國(guó)世科姆公司)；50% 甲基硫菌靈懸浮劑(陜西湯普森生物科技有限公司)；75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、80% 代森錳鋅可濕性粉劑、70% 丙森鋅可濕性粉劑(德國(guó)拜耳作物科學(xué)公司)；33.5%喹啉銅懸浮劑(浙江海正化工股份有限公司)；3% 噻霉酮微乳液(江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司)；46% 氫氧化銅可濕性粉劑 (上海生農(nóng)生化制品股份有限公司)；80% 克菌丹可濕性粉劑(安道麥北京農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司)。

1.2　方法

1.2.1脆紅李葉斑病病原菌的分離與鑒定

采用組織分離法[10]分離病原菌。將脆紅李葉斑病病葉剪成約3 cm2小塊，消毒、清洗后置于PDA平板上28 ℃培養(yǎng)，3 d后挑取菌落邊緣的菌絲繼續(xù)純化培養(yǎng)12 d，待其產(chǎn)孢后，將單孢子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到PDA斜面培養(yǎng)基上，4 ℃冰箱保存，備用。

參照文獻(xiàn)[11]的方法，對(duì)分離株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。分子鑒定采用菌絲裂解法：2×T5 Direct PCR Kit(Plant) 試劑盒(葆光生物)擴(kuò)增ITS[12]、[13]、[14]基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將序列提交至NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。

1.2.2病原菌致病性的測(cè)試

將病原菌在PDA平板上28 ℃恒溫培養(yǎng)12 d，用無菌水配制成1×106/mL的孢子懸浮液，噴灑在離體脆紅李葉片上，以噴灑無菌水作為空白對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察葉片的發(fā)病情況，待植株發(fā)病后對(duì)病原物進(jìn)行再分離培養(yǎng)和鑒定。

對(duì)文獻(xiàn)[11]的方法稍加改進(jìn)，測(cè)試致病菌的致病力。將青脆李、半邊紅、青柰、金脆李和脆紅李的枝條、葉片、果實(shí)以及塔羅科血橙、尤力克檸檬和愛媛38雜柑的葉片和果實(shí)消毒清洗后放置在接種盤中。果實(shí)和葉片采用針刺接種法，枝條采用刻傷接種法，接種直徑5 mm的菌餅，對(duì)照組接種5 mm的PDA培養(yǎng)基。每個(gè)處理接種25個(gè)樣本，4次重復(fù)，28 ℃保濕培養(yǎng)，十字交叉法測(cè)量病斑直徑。

1.2.3殺菌劑的篩選

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[15]測(cè)定殺菌劑的毒力。將24種殺菌劑配制成1 mg/mL的母液，稀釋250和2000倍，測(cè)試對(duì)病原菌的抑制效果。根據(jù)初篩試驗(yàn)結(jié)果，選擇抑制率大于50%的藥劑進(jìn)一步測(cè)試，將母液倍比稀釋250、500、1000、2000、4000和16 000倍，與對(duì)應(yīng)的PDA混合均勻后倒板，接種直徑3 mm的菌餅，以加入等量的無菌水的PDA為空白對(duì)照。每個(gè)處理4次重復(fù)。28 ℃恒溫培養(yǎng)6 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算對(duì)病原菌的抑制率。

1.3　數(shù)據(jù)處理

以(KT963805.1)為外群，采用MEGA 7.0鄰接法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(1000次重復(fù))。采用SPSS Statistics 25對(duì)脆紅李葉斑病病斑直徑進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(PBT)對(duì)殺菌劑試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得各藥劑對(duì)菌株的毒力回歸方程、抑制中濃度(EC50)、95%置信限和相關(guān)系數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1　脆紅李葉斑病致病菌的鑒定結(jié)果

脆紅李葉斑病發(fā)病初期，葉片出現(xiàn)較多圓形或不規(guī)則黃褐色病斑，隨后病斑面積不斷擴(kuò)大，形成連片的黃褐色病斑。受害嚴(yán)重時(shí)，脆紅李葉片枯死凋落，樹勢(shì)衰弱。該病害在四川汶川、重慶萬州和黔江等地皆有發(fā)生，田間病株率為4.6% ～ 10.8%。從3月上旬開始一直持續(xù)到5月下旬，高溫、高濕天氣易爆發(fā)病害，當(dāng)年春季抽發(fā)新葉易染病，嚴(yán)重時(shí)新葉脫落。

從脆紅李葉斑病葉上分離獲得4個(gè)菌株，于PDA平板上28 ℃培養(yǎng)，觀察它們的形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)菌落呈圓形，初期菌絲白色，毛氈狀，無氣生菌絲，邊緣有白色絨毛，靠近中間的菌絲為淡黃色，后期菌絲變?yōu)辄S褐色。在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，菌絲黑褐色，具隔膜。在水瓊脂上產(chǎn)孢，分生孢子器球狀，黑色，大小為(109.5～127.8) μm×(115.1～ 132.9) μm。分生孢子無色，單孢，多為橢圓形，大小(4.8～7.2) μm×(2.0～3.1) μm(圖1)。4個(gè)菌株的菌落形態(tài)特征一致，選取LY12菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1　菌落正面；2　菌落反面；3　分生孢子器；4　分生孢子。

LY12菌株ITS、和基因序列長(zhǎng)度分別為559、594和452 bp，將基因序列提交至NCBI/GenBank，登錄號(hào)分別為OQ190215、OQ193173和QQ211304。Blast 比對(duì)序列表明，LY12菌株與NCBI登錄號(hào)MN274965.1的序列的相似度為98%。從GenBank中下載荸薺莖點(diǎn)霉()、、葡萄莖枯病菌()和同源性較高的序列，基于ITS、和序列聯(lián)合建樹進(jìn)行多重序列比較及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果(圖2)表明，LYI2菌株與遺傳距離最小，聚為一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子鑒定，確定脆紅李葉斑病的病原菌為荸薺莖點(diǎn)霉()。

圖2　基于ITS、LSU和TUB2序列以鄰接法構(gòu)建的LY12菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2　病原菌的致病性

將菌株LY12接種到脆紅李離體葉片上，發(fā)病率為100%，3 d后葉片上產(chǎn)生黃褐色和深褐色的圓形或不規(guī)則斑點(diǎn)，對(duì)照葉片未發(fā)病。分離接種發(fā)病的葉片致病菌，獲得與LY12菌株相同的形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果。根據(jù)柯赫氏法則，判斷菌株LY12為脆紅李葉斑病的病原菌。

將菌株LY12分別接種到青脆李、半邊紅、青柰、金脆李和脆紅李的健康無病的枝條、葉片和果實(shí)上，以及尤力克檸檬、愛媛38雜柑、塔羅科血橙的葉片和果實(shí)上，進(jìn)行致病力測(cè)試。6 d后，5個(gè)李品種的枝條、葉片、果實(shí)上都出現(xiàn)了大小不一的病斑(表1、圖3)，其中脆紅李葉片上病斑平均直徑約1.27 cm，青脆李和青柰枝條上病斑平均直徑分別為0.63、0.61 cm，金脆李果實(shí)病斑平均直徑約為0.41 cm。該病菌侵染尤力克檸檬、愛媛38雜柑和塔羅科血橙的葉片和果實(shí)(圖4)，其中愛媛38雜柑果實(shí)病斑的平均直徑約為1.32 cm，塔羅科血橙葉片病斑的平均直徑約為0.51 cm。

表1　LY12菌株侵染李和柑橘的平均病斑直徑

同列數(shù)據(jù)不同字母表示品種間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。

1、6、11　分別為青脆李染病的葉片、枝條、果實(shí)；2、7、12　分別為脆紅李的葉片、枝條、果實(shí)；3、8、13　分別為金脆李的葉片、枝條、果實(shí)；4、9、14　分別為半邊紅李的葉片、枝條、果實(shí)；5、10、15　分別為青柰李的葉片、枝條、果實(shí)。

1、4　分別為染病的尤力克檸檬的葉片和果實(shí)；2、5　分別為愛媛38雜柑的葉片和果實(shí)；3、6　分別為塔羅科血橙的葉片和果實(shí)。

2.3　殺菌劑的防效

殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果顯示，24種殺菌劑稀釋250和2000倍后，有13種殺菌劑對(duì)菌絲的抑制率低于30%。對(duì)抑制率大于50% 的11種殺菌劑進(jìn)行毒力測(cè)定，結(jié)果(表2)表明，LY12菌株對(duì)50%啶酰菌胺水分散粒劑最敏感，EC50為0.153 1 μg/mL；38% 唑醚·啶酰菌胺懸浮劑、25% 嘧菌酯懸浮劑、12.5% 烯唑醇可濕性粉劑、75% 肟菌·戊唑醇水分散粒劑、29% 吡萘·嘧菌酯懸浮劑、40% 戊唑醚菌酯懸浮劑和11.5% 吡唑醚菌酯乳油對(duì)病原菌有顯著的抑制效果，EC50為0.233 9～0.811 5 μg/mL；37%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、450 g/L 咪鮮胺乳油和50% 嘧菌環(huán)胺水分散粒劑的EC50為1.386 7～ 4.374 0 μg/mL。

表2　11種殺菌劑對(duì)菌株LY12的毒力

3　結(jié)論與討論

2020年在重慶萬州脆紅李果園中發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的葉部病害，通過病原菌形態(tài)特征觀察、致病力測(cè)試、ITS、和序列分析，確定脆紅李葉斑病的致病菌為荸薺莖點(diǎn)霉()。有研究表明，主要引起英國(guó)、丹麥等歐洲國(guó)家菊科植物病害[16]。國(guó)內(nèi)首次在2010年湖北荸薺種植區(qū)荸薺上發(fā)現(xiàn)[12]。2021年陸俞萍等[17]從茶園發(fā)黃、發(fā)黑的葉片上也分離出。至此，該病原菌已侵染荸薺、菊科植物、傘形科植物等7科8種植物，推測(cè)對(duì)其他科屬具有潛在的侵染能力[18–19]。筆者通過針刺接種測(cè)試其致病力，發(fā)現(xiàn)該病菌侵染川渝地區(qū)主栽的5個(gè)李品種，葉片受害最重，其次是枝條和果實(shí)，還侵染尤力克檸檬、愛媛38雜柑和塔羅科血橙的葉片和果實(shí)。

采用室內(nèi)毒力測(cè)定法，測(cè)定24種果園常見殺菌劑的防效，發(fā)現(xiàn)37% 苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對(duì)菌絲有抑制作用，同時(shí)50% 啶酰菌胺水分散粒劑、38% 唑醚·啶酰菌胺懸浮劑、25% 嘧菌酯懸浮劑、12.5% 烯唑醇可濕性粉劑和75% 肟菌·戊唑醇水分散粒劑等8種藥劑對(duì)菌絲有更強(qiáng)的抑制作用。最適生長(zhǎng)溫度為20～25 ℃，雨水增多或溫度下降時(shí)病情會(huì)加重。病原體以分生孢子越冬，形成再侵染源。結(jié)合川渝氣候特征和脆紅李物候期，建議在花期1次、幼果期1～2次噴藥防治。藥劑選用38% 唑醚·啶酰菌胺懸浮劑、25% 嘧菌酯懸浮劑、75% 肟菌·戊唑醇水分散粒劑、29% 吡萘·嘧菌酯懸浮劑、50% 啶酰菌胺水分散粒劑、37% 苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑等，可使用代森錳鋅等保護(hù)劑防止落果；修剪后及時(shí)噴灑40%戊唑·醚菌酯懸浮劑、11.5% 吡唑醚菌酯乳油等藥劑保護(hù)剪鋸口，防止病菌侵入傷口，減少病菌數(shù)量，保護(hù)果樹正常生長(zhǎng)。

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Identification of the pathogen causing leaf spot ofand screening of fungicides

CHEN Na1，QIAO Xinghua2，ZHANG Jia1，ZHOU Huizhen1，WANG Wu3，HU Junhua1*

(1.Institute of Citrus, Southwest University, Chongqing 400712, China; 2.Wanzhou Plant Protection and Fruit Technology Extension Station, Chongqing 404199, China; 3.Institute of Fruit Science, Chongqing Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 402260, China)

In order to clarify the pathogen causing the leaf spots of, tissue isolation was performed to isolate and purify the pathogen, which was further identified by morphological characteristics and polygenic joint sequence analysis. The pathogenicity of the pathogen was determined by spore spraying method and acupuncture inoculation method, and 24 fungicides were screened indoors. The results showed that 4 fungal strains with the same morphological characteristics were isolated from the diseasedleaves. The representative strain LY12 had round colonies and white to light yellow hyphae; and had spherical, black pycnidium, with conidia colorless, monospore, mostly oval. The genes of ITS,andwere used to construct the phylogenetic tree. The results showed that strain LY12 andwere clustered in the same branch. According to morphological characteristics and phylogenetic analysis, strain LY12 was identified as. The pathogenicity test showed that the pathogen strain LY12 could infect the leaves, branches and fruits of plum varieties in Sichuan and Chongqing, including Qingcuili, Banbianhong, Qingnai, Jincuili, and Cuihongli, and the largest lesions appeared on the leaves. The pathogen could also infect leaves and fruits of citrus varieties including Ulick lemon, Ehime 38, and Taroko blood orange. Indoor fungicides screening test showed out of the 24 fungicides, 11 kinds of fungicides, such as 50% boscalid water dispersible granule, 38% boscalid·pyraclostrobin suspending agent, 25%azoxystrobin suspension, 75% trifloxystrobin·tebuconazole water dispersible granule ect., showed strong inhibitory effect on pathogen strain LY12. And 50% boscalid water dispersible granule had the most obvious inhibitory effect, with EC50being 0.153 1 μg/mL.

leaf spot;; pathogenicity; fungicide screening

S436.62

A

1007–1032(2023)05–0575–06

陳娜，喬興華，張嘉，周慧珍，王武，胡軍華．脆紅李葉斑病病原菌的鑒定及抑菌藥劑的篩選[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2023，49(5)：575–580．

CHEN N，QIAO X H，ZHANG J，ZHOU H Z，WANG W，HU J H．Identification of the pathogen causing leaf spot ofand screening of fungicides[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(5)：575–580．

http://xb.hunau.edu.cn

2023–03–31

2023–07–18

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0202006–04)

陳娜(1997—)，女，河南上蔡人，碩士研究生，主要從事分子植物病理學(xué)研究，1604664645@qq.com； *通信作者，胡軍華，博士，副研究員，主要從事分子植物病理學(xué)研究，hujunhua@cric.cn

10.13331/j.cnki.jhau.2023.05.011

責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維