意大利蜜蜂Hippo信號通路相關基因及其全長轉(zhuǎn)錄本的鑒定與分析

張佳欣，高旭澤，陳夢君，宋宇軒，荊欣，劉治灘，馮佩林，陳大福,2，郭睿,2*

意大利蜜蜂Hippo信號通路相關基因及其全長轉(zhuǎn)錄本的鑒定與分析

張佳欣1，高旭澤1，陳夢君1，宋宇軒1，荊欣1，劉治灘1，馮佩林1，陳大福1,2，郭睿1,2*

(1.福建農(nóng)林大學動物科學學院(蜂學學院)，福建 福州 350002；2.福建省蜂療研究所，福建 福州 350002)

采用Blast工具將已鑒定到的意大利蜜蜂(，簡稱意蜂)全長轉(zhuǎn)錄本比對Nr數(shù)據(jù)庫，共鑒定到意蜂Hippo信號通路中相關的49個基因及其550條全長轉(zhuǎn)錄本。運用Gffcompare軟件將鑒定到的Hippo信號通路相關全長轉(zhuǎn)錄本與西方蜜蜂參考基因組(Amel_HAv3.1)上注釋的轉(zhuǎn)錄本進行比較，分別延長西方蜜蜂參考基因組注釋到Hippo信號通路的9個基因的5UTR和7個基因的3UTR。通過Astalavista軟件鑒定到Hippo信號通路相關的4個基因的7次可變剪切(AS)事件，包括2次外顯子跳躍、2次內(nèi)含子保留和3次可變5端剪接。通過PCR驗證了1個基因的AS事件真實性。利用TAPIS pipeline鑒定到意蜂Hippo信號通路相關的24個基因含有1個及以上可變多聚腺苷酸化(APA)位點，其中含有1個APA位點的基因數(shù)量最多。通過TBtool軟件鑒定APA位點上游motif的一致性序列HVNCCNBNDYVDVVHVNDBVDYCNBBDNNNHNNVNNVMNN。

西方蜜蜂；意大利蜜蜂；Hippo信號通路相關基因；全長轉(zhuǎn)錄本

西方蜜蜂() 在全球廣泛分布，常用于農(nóng)作物授粉、養(yǎng)蜂生產(chǎn)和科學研究，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟價值[1]。意大利蜜蜂(，簡稱意蜂)是西方蜜蜂的四大亞種之一，具有優(yōu)良的生產(chǎn)性能。WALLBERG等[2]組裝和注釋了西方蜜蜂染色體級別基因組(Amel_HAv3.1)。

Hippo信號通路在黑腹果蠅()中被首次發(fā)現(xiàn)[3]，作為一條進化較為保守的激酶級聯(lián)反應鏈，在細胞增殖、組織生長、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、免疫防御及病原侵染等諸多生物學過程中起關鍵作用[4]。陳慶等[5]在果蠅中鑒定到Hippo通路上的4種主要激酶，即Hippo(Hpo)、Salvador(Sav)、Warts(Wts)和Mob腫瘤抑制因子(Mats)，發(fā)現(xiàn)它們中的任何一種失活都會促進細胞生長和抑制細胞凋亡而導致細胞無限增殖。LI等[6]發(fā)現(xiàn)家蠶()中、、、和基因的序列高度保守，在家蠶BmN–SWU1(NS)細胞系中上調(diào)和下調(diào)后，抑制細胞增殖，說明Hippo信號通路參與調(diào)控BmN–SWU1(NS)細胞的增殖。

目前，全長轉(zhuǎn)錄組研究僅在果蠅和家蠶等少數(shù)昆蟲中見諸報道，多數(shù)昆蟲的相關研究仍然缺失。蜜蜂的全長轉(zhuǎn)錄組研究迄今僅有2例報道：ZHENG等[7]通過納米孔測序，發(fā)現(xiàn)在西方蜜蜂蜂王和工蜂級型發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄本的表達量發(fā)生動態(tài)變化，基因的可變多聚腺苷酸化(APA)和可變剪切(AS)導致轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變得復雜；范小雪等[8]利用納米孔測序技術對意蜂工蜂中腸組織RNA進行測序并獲得了長讀段數(shù)據(jù)。在范小雪等研究基礎上，筆者運用生物信息學方法鑒定意蜂Hippo信號通路相關基因和全長轉(zhuǎn)錄本，進而對基因的AS事件和APA位點進行鑒定，以期展示意蜂Hippo信號通路相關基因和全長轉(zhuǎn)錄本的全面信息，為開展相關基因和剪接體的功能研究提供參考。

1　意蜂納米孔測序長讀段數(shù)據(jù)來源

范小雪等[8]制備意蜂7日齡和10日齡工蜂中腸樣品，完成了RNA提取、cDNA建庫、納米孔測序及數(shù)據(jù)質(zhì)控，獲得了長讀段測序數(shù)據(jù)，以此長讀段測序數(shù)據(jù)作為本研究數(shù)據(jù)來源。

2　研究方法

2.1　意蜂Hippo信號通路相關基因和全長轉(zhuǎn)錄本的鑒定

參照蔡宗兵等[9]的方法，使用Blast工具(采用默認參數(shù))將鑒定到的意蜂全長轉(zhuǎn)錄本序列比對到Nr數(shù)據(jù)庫(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FAS TA/)，根據(jù)注釋信息篩選Hippo信號通路相關基因和全長轉(zhuǎn)錄本。

2.2　西方蜜蜂參考基因組注釋的Hippo信號通路相關基因的結(jié)構(gòu)優(yōu)化

按照杜宇等[10]的方法，利用gffcompare(http:// ccb.jhu.edu/software/stringtie/gffcompare.shtml)將鑒定到的Hippo信號通路相關全長轉(zhuǎn)錄本與西方蜜蜂參考基因組(Amel_HAv3.1)上已注釋的轉(zhuǎn)錄本進行比較，優(yōu)化已注釋基因的結(jié)構(gòu)，并鑒定未注釋的新基因和新轉(zhuǎn)錄本。如果在已注釋基因邊界外區(qū)域有比對上的讀段，則將基因的非翻譯區(qū)(UTR)向上游或下游延伸，以修正邊界。

2.3　意蜂Hippo信號通路相關基因的AS事件鑒定及PCR驗證

參照陳華枝等[11]的方法，運用Astalavista軟件鑒定意蜂工蜂Hippo信號通過相關基因的AS事件，采用默認參數(shù)。進一步統(tǒng)計內(nèi)含子保留(IR)、外顯子跳躍(ES)、可變5端剪接(A5SS)等3種類型的AS事件數(shù)量。

隨機選擇肌動蛋白克隆205樣異構(gòu)體X1基因(AS類型為ES)進行PCR驗證，以驗證Hippo信號通路中的AS事件準確性。根據(jù)核苷酸序列設計跨剪接位點的特異性引物(上游AACAAGAAACGGTG，下游TCATCTCCGACCAACCAG)。以肌動蛋白基因(GeneBank ID LOC107999330)作為內(nèi)參，并設計相應的特異性引物(上游TTATATGCCAACAC TGTCCTTT，下游AGAATTGATCCACCAATCCA)。委托上海生工生物工程有限公司合成引物。使用RNA抽提試劑盒(Promega)分別提取意蜂7日齡和10日齡工蜂中腸樣品的總RNA，等量混合后作為模板進行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA作為模板進行PCR擴增。反應體系和程序按照范小雪等[10]的報道設置。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用核酸凝膠成像儀(Bio–red)觀察和拍照。

2.4　意蜂Hippo信號通路相關基因的APA位點鑒定

參照杜宇等[12]的方法，利用TAPIS pipeline[13]鑒定酚氧化酶及絲氨酸蛋白酶相關基因的APA位點，參數(shù)設置：–meme–minw 6，–meme– maxw 6，–norc，–fimo–skip，–spamo–skip。采用TBtools v1.046 軟件分析所有APA位點的上游50 bp的序列特征，進而鑒定出motif。

3　結(jié)果與分析

3.1　意蜂Hippo信號通路相關基因和全長轉(zhuǎn)錄本的鑒定

采用Blast工具，將已鑒定到的意蜂全長轉(zhuǎn)錄本比對Nr數(shù)據(jù)庫，共鑒定到意蜂Hippo信號通路中相關的49個基因及其550條全長轉(zhuǎn)錄本。由于鑒定到的相關基因和全長轉(zhuǎn)錄本數(shù)量較多，僅在表1中展示意蜂Hippo信號通路相關的15個基因及其全長轉(zhuǎn)錄本。注釋到14–3–3蛋白ε全長轉(zhuǎn)錄本最多，為14條；注釋到轉(zhuǎn)錄增強因子TEF–1亞型X4的全長轉(zhuǎn)錄本為13條；注釋到支架蛋白，肌動蛋白、克隆205蛋白，肌動蛋白、肌肉，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶STE20，類RasGTP結(jié)合蛋白，未特征蛋白，G1/ s特異性周期蛋白EL，LIM結(jié)構(gòu)域蛋白，類克隆403蛋白3，未特征蛋白、轉(zhuǎn)錄變體X3，蛋白Wnt–1，互作蛋白類RIP3–like和Ras關聯(lián)結(jié)構(gòu)域蛋白2的全長轉(zhuǎn)錄本均為1條(表1)。

3.2　西方蜜蜂參考基因組注釋到Hippo信號通路的基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化

對西方蜜蜂參考基因組上注釋到Hippo信號通路上的16個基因進行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化。其中，正鏈和負鏈延長的基因分別為10個和6個；5端延長的基因有9個，延長長度69 445～1 863 562 bp；3端延長的基因有7個，延長長度1474～1 179 780 bp(表2)。

表2　西方蜜蜂參考基因組上注釋到Hippo信號通路的基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化結(jié)果

3.3　意蜂Hippo信號通路相關基因的AS事件及驗證結(jié)果

意蜂Hippo信號通路相關的49個基因中，鑒定到4個基因的7次AS事件，涉及外顯子跳躍(ES)、內(nèi)含子保留(IR)和可變5端剪接(A5SS)等3種類型(表3)，其中，肌動蛋白、克隆205蛋白編碼基因(GeneBank登錄號LOC551369)發(fā)生2次外顯子跳躍，未表征蛋白編碼基因(GeneBank登錄號LOC107964603)發(fā)生2次內(nèi)含子保留，絲氨酸蘇氨酸蛋白磷酸酶2a催化亞基編碼基因(GeneBank登錄號LOC550710)和14–3–3蛋白ε編碼基因(GeneBank登錄號LOC408951)分別發(fā)生2次和1次可變5端剪接(表3)。

表3　意蜂Hippo信號通路相關基因的AS事件信息

C和W分別代表負義鏈和正義鏈。

圖1–A顯示外顯子跳躍類型。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，通過PCR擴增鑒定到肌動蛋白異構(gòu)體X2基因的2個目的片段，大小分別約為659 bp和375 bp(圖1–B)，與基于Nanopore測序數(shù)據(jù)的預測結(jié)果(圖1–C)一致，證實了該AS事件的真實性。

3.4　意蜂Hippo信號通路相關基因的APA位點鑒定結(jié)果

在意蜂Hippo信號通路相關的49個基因中，鑒定到24個基因含有1個及以上APA位點(表4)。其中，含有1個APA位點的基因數(shù)量最多，為4個；含有2和3個APA位點的基因均為3個；含有4個APA位點的基因有2個(圖2–A)。由于鑒定到的相關基因數(shù)量較多，僅在表4中展示意蜂Hippo信號通路相關的5個基因及其全長轉(zhuǎn)錄本，其中含有1、2、3、4和5個APA位點的相關基因分別展示1個。此外，在Hippo信號通路相關基因的APA位點上游鑒定到motif的一致性序列為HVNCCNBNDYVDVVHVNDBVDYCNBBDNNNHNNVNNVMNN(圖2–B)。

表4　意蜂Hippo信號通路相關的5個基因的APA位點信息

A　含不同數(shù)量APA位點的基因數(shù)統(tǒng)計；B　APA位點上游40 nt鑒定到的motif。

4　結(jié)論與討論

基于前期獲得的納米孔長讀段數(shù)據(jù)，本研究共鑒定到意蜂Hippo信號通路相關的49個基因及其550條全長轉(zhuǎn)錄本，并對西方蜜蜂參考基因組上注釋到Hippo信號通路的9個基因的5UTR和7個基因的3UTR分別進行了延長。共鑒定到意蜂Hippo信號通路相關的3個基因的7次AS事件，涉及ES、IR和A5SS等3種類型。推測上述3個基因通過發(fā)生ES、IR和A5SS影響意蜂Hippo信號通路，進而調(diào)節(jié)器官大小及個體發(fā)育等過程。

本研究共鑒定到意蜂Hippo信號通路相關的24個基因含有1個及以上APA位點，基因占比約為49%，說明意蜂Hippo信號通路相關基因普遍發(fā)生APA且存在豐富的APA位點，與白蠅()[14]、草地貪夜蛾()[15]和黑腹果蠅()[16]等昆蟲中的研究結(jié)果相似。另外，在APA位點的上游鑒定到motif的一致性序列為HVNCCNBNDYVDVVHV NDBVDYCNBBDNNNHNNVNNVMNN，與前人在其他動植物如小鼠()[17]、擬南芥()[18]和東方蜜蜂微孢子蟲()[11]中鑒定到motif均不相同，表明不同物種基因APA位點上游的motif具有種屬特異性。這些motif如何調(diào)節(jié)意蜂APA位點形成，進而影響Hippo信號通路，需進一步研究。

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Identification and investigation of genes and their full-length transcripts relative to Hippo signaling pathway in

ZHANG Jiaxin1，GAO Xuze1，CHEN Mengjun1，SONG Yuxuan1，JING Xin1，LIU Zhitan1，F(xiàn)ENG Peilin1，CHEN Dafu1,2，GUO Rui1,2*

(1.College of Animal Sciences (College of Bee Science), Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.Apitherapy Research Institute of Fujian Province, Fuzhou, Fujian 350002, China)

The previously identified full-length transcripts ofwere aligned to the Nr database by Blast tool, a total of 49 genes and their 550 full-length transcripts relevant to the Hippo signaling pathway were identified. The identified 550 full-length transcripts relative to the Hippo signaling pathway were compared with the annotated transcripts in the() reference genome (Amel_HAv3.1) using the gffcompare software, the 5UTRs of 9 genes and the 3UTRs of 7 genes annotated to the Hippo signaling pathway in thereference genome were respectively prolonged. Based on the Astalavista software, 7 alternative splicing (AS) events in 4 genes were identified, including two exon skipping, two intron retention and three alternative 5splicing sites. The authenticity of AS events in 1 gene was verified by PCR. On basis of the TAPIS pipeline, 24 genes associated with the Hippo signaling pathway were identified to contain at least 1 alternative polyadenylation (APA) sites individually; among them, the genes containing 1 APA site were the most abundant. By using the TBtool software, the consensus sequence of HVNCCNBNDYVDVVHVNDBVDYCNBBDNNNHNNVNNVMNN was identified.

;; Hippo signaling pathway-related genes; full-length transcript

Q969.557.7

A

1007–1032(2023)05–0529–06

張佳欣，高旭澤，陳夢君，宋宇軒，荊欣，劉治灘，馮佩林，陳大福，郭睿．意大利蜜蜂Hippo信號通路相關基因及其全長轉(zhuǎn)錄本的鑒定與分析[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2023，49(5)：529–534．

ZHANG J X，GAO X Z，CHEN M J，SONG Y X，JING X，LIU Z T，F(xiàn)ENG P L，CHEN D F，GUO R．Identification and investigation of genes and their full-length transcripts relative to Hippo signaling pathway in[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(5)：529–534．

http://xb.hunau.edu.cn

2023–03–21

2023–08–25

國家自然科學基金面上項目(32172792)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系專項資金項目(CARS–44–KXJ7)；福建省自然科學基金面上項目(2022J01131334)；福建農(nóng)林大學科技創(chuàng)新專項基金項目(KFb22060XA)

張佳欣(1998—)，女，湖北十堰人，碩士研究生，主要從事蜜蜂分子生物學研究，jiaxin19981005@163.com；*通信作者，郭睿，博士，副教授，主要從事昆蟲–病原互作研究，fafu_ruiguo@126.com

10.13331/j.cnki.jhau.2023.05.005

責任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維