氣相色譜法測定乙氧呋草黃原藥中2 種甲磺酸酯含量

文亮，王曉燕，李露露，管鵬飛，譚頭云

（永農(nóng)生物科學(xué)有限公司，浙江 紹興 312300）

乙氧呋草黃是由德國AgrEvo 公司率先開發(fā)用在甜菜田的除草劑[1]，可以破壞草類植物光合作用，抑制其生長，具有低毒、廣譜性和選擇性等特點。甜菜對其有著高度的耐藥性，大量使用后仍然有較好的除草作用，對許多種闊葉類雜草也能起到很好除雜效果[2]。乙氧呋草黃也可以作為混劑組分，如與甜菜安、甜菜寧等混合使用在甜菜田上進(jìn)行除草[3]，降低其他農(nóng)藥的使用量，從而達(dá)到更好的藥效以及更低的使用危害。

乙氧呋草黃作為苯并呋喃環(huán)類型的除草劑，合成時使用過乙醇和異丁醇會導(dǎo)致反應(yīng)生成雜質(zhì)甲磺酸乙酯（EMS）和甲磺酸異丁酯（IBMS）[4]。甲磺酸乙酯和甲磺酸異丁酯為基因毒性雜質(zhì)（GTIs）[5]，歐洲藥品管理局(EMA)人用藥品委員會（CHMP）發(fā)布的《基因毒性雜質(zhì)限度指南》以及國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）協(xié)調(diào)指導(dǎo)原則M7《評估和控制藥物中的DNA 活性（致突變）雜質(zhì)以限制潛在的致癌危險》均明確指出若藥成品中含有少量基因毒性雜質(zhì)，則應(yīng)對其進(jìn)行監(jiān)視和控制[6-7]。毒性雜質(zhì)容易引發(fā)疾病危害甚至導(dǎo)致癌變，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)公布的致癌物清單中將甲磺酸乙酯和甲磺酸異丁酯列為致癌物。出口至歐洲國家的乙氧呋草黃原藥需嚴(yán)格控制毒性雜質(zhì)的限度[8]，ICH 明確規(guī)定成品乙氧呋草黃中單個基因毒性雜質(zhì)含量不應(yīng)超出0.1 mg·L-1。本研究通過建立氣相色譜測定乙氧呋草黃中甲磺酸酯類分析方法，實現(xiàn)對乙氧呋草黃進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Agilent 7820A 氣相色譜儀，美國安捷倫公司；SQP 電子天平，賽多利斯（北京）公司。

1.1.2 試劑與原藥

乙腈：色譜純，阿斯頓生物工程技術(shù)有限公司；

甲磺酸乙酯：99.0%，麥克林生化科技有限公司；

甲磺酸異丁酯：98.0%，麥克林生化科技有限公司；

乙氧呋草黃原料藥（永農(nóng)生物科學(xué)有限公司，批號為：202305003，202305001，202304016，202304011）。

1.2 氣相色譜條件

色譜柱：DB-WAX (30 m×0.32 mm,0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱；固定相為聚乙二醇（PEG）。

進(jìn)樣口溫度：250 ℃。

柱溫：進(jìn)行程序溫度設(shè)定，先將起始柱溫設(shè)為60 ℃，維持2 min，然后以10 ℃/min 的速度上升至190 ℃，接著以30 ℃/min 的速度上升到240 ℃，保持10 min，最后在240 ℃恒溫狀態(tài)下后運行7 min。

分流比：不進(jìn)行分流。

流量：空氣：400 mL/min；氫氣：40 mL/min；尾吹氣（氮氣）:25 mL/min。

進(jìn)樣量：1 μL。

檢測器FID 溫度：250 ℃。

1.3 測定步驟

1.3.1 標(biāo)樣溶液的配制

將甲磺酸乙酯（EMS）標(biāo)準(zhǔn)品與甲磺酸異丁酯(IBMS)標(biāo)準(zhǔn)品各0.05 g（精確至0.0001 g），置于50 mL 容量瓶中，加入溶解相乙腈，通過超聲振蕩將其均勻溶解，放置至室溫待其穩(wěn)定后進(jìn)行定容。再移取上述溶液1 mL 加入100 mL 容量瓶中，用溶解相進(jìn)行稀釋，攪動均勻、定容。配置成甲磺酸乙酯、甲磺酸異丁酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.0 mg·L-1）。

1.3.2 試樣溶液的配制

準(zhǔn)確稱取乙氧呋草黃5 g（精確至0.0001 g），將其放置于10 mL 容量瓶中，加入適量的溶解相，經(jīng)過超聲攪拌，待其完全溶解并冷卻至室溫后，使用乙腈進(jìn)行定容、搖勻。

1.3.3 儀器測定

在上述氣相色譜條件下，當(dāng)儀器火焰信號值低于20 pA 并保持穩(wěn)定狀態(tài)，進(jìn)甲磺酸乙酯、甲磺酸異丁酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣，直至相鄰2針的相對響應(yīng)值變化≤1.5%。再進(jìn)行序列進(jìn)樣，依次添加標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液。

1.3.4 外標(biāo)法計算

對氣相色譜測定的2 次試樣溶液及試樣前后2 次標(biāo)樣溶液中甲磺酸酯類峰面積分別進(jìn)行平均，根據(jù)式（1）計算樣品乙氧呋草黃中甲磺酸酯類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式（1）中：A1為標(biāo)樣溶液中甲磺酸酯類的峰面積平均值；A2為試樣溶液中甲磺酸酯類的峰面積平均值；m1為甲磺酸酯類標(biāo)樣的質(zhì)量，g；m2為甲磺酸酯類試樣的質(zhì)量，g；P 為甲磺酸酯類標(biāo)樣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.3.5 色譜行為

根據(jù)上述色譜工作條件，對甲磺酸乙酯和甲磺酸異丁酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與乙氧呋草黃原藥溶液進(jìn)行測定。其典型色譜圖見圖1 和圖2。

圖1 甲磺酸乙酯和甲磺酸異丁酯色譜圖

圖2 乙氧呋草黃原藥色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 測定條件的選擇

2.1.1 溶解相的選擇

乙氧呋草黃中雜質(zhì)甲磺酸乙酯和甲磺酸異丁酯的含量有嚴(yán)格控制要求，采用氣相色譜測定時，使用氫火焰檢測器，在靈敏度一定的情況下，需要盡可能提高乙氧呋草黃成品的溶解度。在乙氧呋草黃前處理溶解過程中，選擇不同有機溶劑（甲醇、乙腈、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯和N，N-二甲基甲酰胺），以單一有機溶劑或者不同有機溶劑兩兩混合的方式進(jìn)行溶解，如甲醇-乙腈、甲醇-丙酮、乙腈-丙酮和乙腈-三氯甲烷等，調(diào)整有機溶劑的體積比為9:1～1：9。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在使用單一有機溶劑乙腈時，乙氧呋草黃的溶解度就可以達(dá)到0.5 g/mL，滿足乙氧呋草黃中雜質(zhì)甲磺酸乙酯和甲磺酸異丁酯的檢測限和雜質(zhì)分離要求，因此選定乙腈作為溶解相。

2.1.2 色譜柱的選擇

甲磺酸乙酯與甲磺酸異丁酯因沸點高、極性接近、含量低，對氣相色譜柱的要求也更高。對不同類型、不同內(nèi)徑和不同極性的氣相色譜柱進(jìn)行篩選，包含DB-1(30 m×0.32 mm,0.25 μm)，DB-5(30 m×0.25 mm,0.25 μm)，DB-35 (30 m×0.32 mm,0.25 μm)，HP-5 (30 m×0.32 mm,0.25 μm),DBWAX(30 m×0.32 mm,0.25 μm)。經(jīng)過多次實驗，對樣品在色譜柱上的峰型和峰面積響應(yīng)進(jìn)行比較，并要求乙氧呋草黃成品中其他雜質(zhì)不會干擾甲磺酸乙酯和甲磺酸異丁酯。最終選擇DB-WAX(30 m×0.32 mm,0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱，其具有最佳的峰面積響應(yīng)以及較好的分離度，對乙氧呋草黃中雜質(zhì)甲磺酸乙酯和甲磺酸異丁酯的分離和定量有最佳的效果。

2.1.3 氣相色譜條件的優(yōu)化

綜合考慮乙氧呋草黃成品中甲磺酸乙酯和甲磺酸異丁酯的出峰保留時間、分離效果、峰面積響應(yīng)，對氣相色譜的進(jìn)樣體積、進(jìn)樣口溫度以及柱溫箱的溫度進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。對氣相色譜進(jìn)樣體積進(jìn)行優(yōu)化，要求盡可能使甲磺酸乙酯和甲磺酸異丁酯有最高的峰面積響應(yīng)，同時需要滿足儀器在多針運行下仍然有出色的平行性。進(jìn)樣口溫度為260 ℃，進(jìn)樣口壓力為35.7 kPa，改變不同的進(jìn)樣體積，最終選擇進(jìn)樣體積為1 μL，此時飽和蒸氣壓負(fù)荷量為67%，接近最佳負(fù)荷量。進(jìn)樣口溫度同樣影響峰面積的大小，甲磺酸酯雜質(zhì)在更高的溫度下有更高的靈敏度，但受限于DB-WAX色譜柱，不宜將進(jìn)樣口溫度繼續(xù)提升，因此進(jìn)樣口溫度為260 ℃是最佳溫度。在對柱溫箱溫度進(jìn)行優(yōu)化時，除滿足甲磺酸乙酯和甲磺酸異丁酯良好分離度以外，色譜柱的升溫程序在240 ℃后運行7 min，可以有效地除去乙氧呋草黃成品峰，以免其殘留干擾下一針數(shù)據(jù)采集，從而實現(xiàn)快速分析、節(jié)約實驗成本。

2.2 線性相關(guān)性

將配置好的甲磺酸乙酯、甲磺酸異丁酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mg·L-1作為儲備液，用乙腈逐級稀釋，配制成1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、0.25 mg·L-1、0.1 mg·L-1和0.05 mg·L-1等5 個梯度標(biāo)樣溶液，在上述氣相色譜條件下進(jìn)樣測定，得到相應(yīng)的峰面積響應(yīng)值，以峰面積與濃度作線性回歸方程。得出甲磺酸乙酯的線性回歸方程為：y1=2.1162x1+0.1072，相關(guān)系數(shù)為0.9999；甲磺酸異丁酯的線性回歸方程為：y2=3.3298x2+0.0509，相關(guān)系數(shù)為0.9999。甲磺酸乙酯和甲磺酸異丁酯在0.05～1 mg·L-1范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)均為0.9999，表明在此濃度范圍內(nèi)雜質(zhì)濃度與相應(yīng)峰面積呈顯著性線性關(guān)系。

2.3 分析方法的精密度

按照上述儀器設(shè)定條件進(jìn)行測定，對乙氧呋草黃原藥中雜質(zhì)平行測定5 次，甲磺酸乙酯、甲磺酸異丁酯測定的含量、平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)見表1。從結(jié)果可知，甲磺酸乙酯與甲磺酸異丁酯的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.03%，且變異系數(shù)均小于0.6%，表明甲磺酸酯雜質(zhì)含量測定的數(shù)據(jù)離散程度極低，由此可見該測定方法重復(fù)性較好。

表1 精密度測定結(jié)果

2.4 加標(biāo)回收率

精密稱量已知甲磺酸乙酯、甲磺酸異丁酯含量的乙氧呋草黃原藥5 mg 各6 份，置于10 mL 容量瓶中，再準(zhǔn)確量取濃度為1 mg·L-1和0.1 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入樣品中進(jìn)行定容。制備成含有甲磺酸乙酯、甲磺酸異丁酯濃度為高、低兩種供試品溶液各3 份。按上述儀器分析方法測定，根據(jù)其加入量和測得量計算回收率，見表2。

表2 加標(biāo)回收率

根據(jù)表2 結(jié)果可知，甲磺酸乙酯低濃度的平均回收率為96.89%，高濃度的平均回收率為97.68%；甲磺酸異丁酯低濃度的平均回收率為96.67%，高濃度的平均回收率為97.89%。甲磺酸乙酯和甲磺酸異丁酯兩者高、低濃度的添加都具備優(yōu)異的回收率，表明該方法具備較高的可靠性。

2.5 檢測限和定量限

在線性范圍的最低濃度下繼續(xù)使用溶劑稀釋，分析乙氧呋草黃中雜質(zhì)甲磺酸乙酯、甲磺酸異丁酯，信噪比為10:1 時的濃度作為定量限，信噪比為3:1 的濃度作為檢測限。檢測結(jié)果如下：甲磺酸乙酯、甲磺酸異丁酯定量限分別為0.037 mg·L-1、0.044 mg·L-1，甲磺酸乙酯、甲磺酸異丁酯檢測限分別為0.012 mg·L-1、0.014 mg·L-1。根據(jù)毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）的規(guī)定，乙氧呋草黃中基因毒性雜質(zhì)含量不得高于0.1 mg·L-1。由此可見2 種雜質(zhì)的定量限和檢測限均低于需控制的限度，滿足分析的要求。

2.6 樣品含量檢測

按本文實驗方法進(jìn)行操作，測定4 批次乙氧呋草黃原藥（永農(nóng)生物科學(xué)有限公司，批號202305003，202305001，20230416，20230411）,其毒性雜質(zhì)含量檢測結(jié)果見表3。由表3 可知：本方法能夠應(yīng)用于乙氧呋草黃中甲磺酸酯的檢測，對乙氧呋草黃原藥中雜質(zhì)含量的測定結(jié)果完全符合TTC 所規(guī)定的限值。

表3 乙氧呋草黃原藥中毒性雜質(zhì)檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了氣相色譜法測定乙氧呋草黃中雜質(zhì)甲磺酸酯類含量的方法。該方法無需衍生手段，分離效果好、定量準(zhǔn)確，滿足檢測分析要求以及農(nóng)藥乙氧呋草黃質(zhì)量監(jiān)控要求。