杜仲雄花粉總黃酮抗衰老作用

高夢珂,代俊俊,許世偉,李欽

河南大學(xué) 藥學(xué)院,河南 開封 475000

隨著人體年齡的增長,機(jī)體會(huì)逐漸發(fā)生功能及代謝方面的變化,抗氧化物酶和抗氧化物質(zhì)合成速度和活力減弱,代謝產(chǎn)物丙二醛增多,體內(nèi)產(chǎn)生和清除自由基的平衡被打破,造成自由基堆積,衰老加速。如果同時(shí)伴有病理性的改變,則稱為衰老。衰老相關(guān)疾病如阿爾茲海默癥、帕金森等,嚴(yán)重影響到老年人的生存及生活質(zhì)量。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步及生活條件的改善,人們在追求長壽的同時(shí)也越來越把目光聚焦在對自身健康的保障上[1-2]。黃酮類化合物廣泛存在于自然界的植物中,是植物的次生代謝產(chǎn)物,具有抗氧化、預(yù)防癌癥、調(diào)節(jié)免疫、預(yù)防心血管疾病、抗炎等作用。黃酮類化合物發(fā)揮抗氧化作用主要通過減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基兩種途徑[3]。

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)為杜仲科杜仲屬植物,是我國特有的名貴滋補(bǔ)藥材,具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨,安胎的功能。現(xiàn)代研究表明杜仲主要含有黃酮類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、多糖類、多酚類、木質(zhì)素類活性成分,具有抗氧化、抗衰老、降血糖、調(diào)節(jié)血壓、抗菌抗病毒等作用。黃酮類化合物為杜仲的主要活性成分之一,具有抗氧化、消除自由基、抑菌、抗過敏等作用[4-7]。目前對杜仲的研究主要聚焦于杜仲皮、葉、雄花,但對杜仲花粉的研究較少。查閱文獻(xiàn)可知,杜仲雄花粉含有總黃酮、蛋白質(zhì)、維生素等有效成分,在藥用方面及保健品方面具有較高的利用價(jià)值[8]。為了更好地開發(fā)利用這一資源,本實(shí)驗(yàn)利用D-半乳糖建立衰老模型,探討杜仲雄花粉總黃酮的抗衰老作用,旨在為杜仲雄花粉的開發(fā)利用及作用機(jī)制的研究提供一定的參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

杜仲雄花粉,河南芳捷農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。

D-半乳糖,北京索萊寶科技有限公司;維生素C,東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司(5230205);冰醋酸,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA 法,A003-1-2),SOD試劑盒(A001-1-2),總抗氧化能力(T-AOC)檢測試盒(ABTS法,A015-2-1),總蛋白定量測定試盒(BCA法,A045-4-2),南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性昆明小鼠,體質(zhì)量14～16 g,由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物使用許可證編號(hào)為SCXK(京)2019-0010.

1.3 儀器與設(shè)備

電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;全波長酶標(biāo)儀(Powerwave XS),美國ThermoScientific公司;ZS-001Morris 水迷宮,北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技有限公司;低溫高速離心機(jī),美國Thermo公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 杜仲雄花粉總黃酮提取物的制備

稱取取杜仲雄花粉200 g加20倍70%乙醇,浸泡1 h;超聲處理40 min后,60 ℃水浴加熱30 min,過濾保留濾液。重復(fù)以上操作3次,合并濾液[9]。減壓濃縮至濃度為0.2 g/mL(生藥)作為上樣溶液。采用NKA-9大孔樹脂進(jìn)行純化,上樣量1 BV,吸附6 h后,用5 BV蒸餾水以2 mL/min沖洗至洗脫液呈無色,然后用6 BV 70%乙醇以2 mL/min速度洗脫,保留洗脫液。減壓濃縮后,采用聚酰胺(100～200目)進(jìn)行二次純化。采用蒸餾水、25%乙醇、50%乙醇進(jìn)行梯度洗脫,保留50%乙醇洗脫液?；厥杖軇?所得浸膏即為杜仲雄花粉總黃酮(FEF)提取物。采用紫外分光光度法測得黃酮含量為70.61%。

2.2 小鼠分組

雄性昆明小鼠60只,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機(jī)分成6組,每組10只,分別為正常組、模型組、杜仲雄花粉總黃酮低劑量組、杜仲雄花粉總黃酮中劑量組、杜仲雄花粉總黃酮高劑量組和陽性藥組。

2.3 小鼠處理

每個(gè)供試實(shí)驗(yàn)組除正常組外,其余各組每日1次以D-半乳糖生理鹽水溶液頸背部皮下注射,給藥量400 (mg/kg)/d[10-13],正常組注射等體積的生理鹽水,連續(xù)9周。自第5周開始杜仲雄花粉總黃酮低、中、高劑量組分別灌胃給予80、160、320(mg/kg)/d杜仲雄花粉總黃酮提取物(FEF)溶液[14-17],陽性藥組灌胃維生素C 溶液100 (mg/kg)/d,正常組與模型組灌胃等體積的蒸餾水。各組實(shí)驗(yàn)小鼠自由飲食,室溫(20±2)℃?？倢?shí)驗(yàn)周期共9周。

2.4 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前6 d進(jìn)行行為學(xué)試驗(yàn)。行為學(xué)共分為兩部分:定位航行試驗(yàn),空間探索試驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)期間繼續(xù)給藥。

1) 定位航行試驗(yàn)。將小鼠從測試象限中央面向池壁放入水中,并開始計(jì)時(shí),小鼠找到平臺(tái)并在平臺(tái)上停留5 s記為試驗(yàn)結(jié)束,從小鼠入水到尋找到平臺(tái)記為潛伏期。若小鼠60 s內(nèi)不能尋找到平臺(tái),則將小鼠引導(dǎo)至平臺(tái)上并停留15 s,潛伏期記為60 s。平臺(tái)位于第一象限,每天依次將小鼠從二、三、四象限放入水中,連續(xù)訓(xùn)練5 d。

在施工中的樁體材料中加入一定量的高黏度剛性樁體，這種方法進(jìn)行加固施工效果非常好，可以適用的范圍也比較大，且不會(huì)受到氣候條件的影響，加固之后就能夠具備較強(qiáng)的承載性能[4]。

2) 空間探索試驗(yàn)。于行為學(xué)試驗(yàn)的第6天將平臺(tái)從第一象限撤去,將小鼠從第四象限放入水中,記錄60 s內(nèi)小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡并進(jìn)行分析[18]。

2.4 樣品采集及器官處理

末次給藥后禁食12 h,摘眼球取血,在4 ℃環(huán)境下靜置,待血清析出后采用離心機(jī)3 500 r/min離心15 min,取血清待測。

采血后小鼠頸椎脫臼處死,取出脾臟、腎臟、肝臟、腦和心臟,用生理鹽水清洗干凈。肝臟、心臟、腎、脾稱重,肝臟與腦組織-80 ℃冷凍保存。

2.5 小鼠臟器指數(shù)的測定

根據(jù)公式分別計(jì)算腎臟指數(shù)、肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)。

臟器指數(shù)(g/g)=組織質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)。

2.6 生化指標(biāo)測定

按照試劑盒說明書上的方法測定MDA 含量、SOD活力、總抗氧化能力。

2.7 數(shù)據(jù)處理與顯著性分析

采用IBM SPSS Statisticsa 26數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用表示,用LSD法進(jìn)行顯著性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 杜仲雄花粉總黃酮提取物對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

Morris 水迷宮定位航行試驗(yàn)結(jié)果如圖1～圖4所示。

圖1 定位航行試驗(yàn)中小鼠潛伏期

圖2 第5天潛伏期

圖3 空間探索實(shí)驗(yàn)中小鼠小鼠游泳軌跡圖

圖4 小鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)(次)

分析各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn),在定位航行試驗(yàn)中隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加,各組小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間均逐漸縮短,其中FEF低劑量組下降幅度最大,為69.14%,模型組最小,下降幅度為40.98%;分析第5天潛伏期數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn),模型組小鼠潛伏期顯著大于正常組(P＜0.001),表明模型組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力嚴(yán)重衰退。與模型組相比,陽性藥組及杜仲雄花粉總黃酮低劑量組小鼠潛伏期顯著縮短(P＜0.01),說明維生素C和杜仲雄花粉總黃酮可以改善D-半乳糖導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力的衰退。

定位航行試驗(yàn)結(jié)束后,于次日進(jìn)行空間探索試驗(yàn),分析各組小鼠的游泳軌跡、原平臺(tái)位置穿越次數(shù),考察各組小鼠對原平臺(tái)位置的記憶能力。

從運(yùn)動(dòng)路徑可以看出,除模型組外其余各組入水后,經(jīng)過一段時(shí)間的搜尋均能到達(dá)原平臺(tái)所在位置,且多在平臺(tái)所在象限區(qū)域活動(dòng),而模型組入水后,多沿池壁運(yùn)動(dòng),不能準(zhǔn)確到達(dá)原平臺(tái)位置。通過對穿越原平臺(tái)次數(shù)的分析,可以看出正常組與模型組有極顯著性差異(P＜0.001),說明模型組小鼠的記憶能力嚴(yán)重下降,D-半乳糖可以對小鼠的記憶能力產(chǎn)生負(fù)面影響。

與模型組相比,陽性藥組小鼠入水后,多在平臺(tái)所在象限及鄰近區(qū)域運(yùn)動(dòng),且穿越平臺(tái)的次數(shù)顯著多于模型組(P＜0.01),說明陽性藥組小鼠對原平臺(tái)位置記憶較模型組準(zhǔn)確,維生素C對小鼠記憶能力的下降有保護(hù)作用。杜仲雄花粉總黃酮高、中、低劑量組均穿越平臺(tái)次數(shù)均與模型組有顯著性差異,且中、低劑量組小鼠入水后能主動(dòng)在原平臺(tái)位置附近探索,很少在目標(biāo)象限對側(cè)象限搜索,表明杜仲雄花粉總黃酮提取物對D-半乳糖造成的小鼠記憶能力下降有一定的改善作用。

3.2 杜仲雄花粉總黃酮提取物對小鼠器官的影響

如圖5所示,與正常組相比,模型組小鼠的肝臟指數(shù)極顯著降低(P＜0.001),說明模型小鼠肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷。與模型組相比,陽性藥組小鼠的肝臟指數(shù)極顯著增加(P＜0.01),說明維生素C對D-半乳糖導(dǎo)致的小鼠肝損傷有很好的保護(hù)作用;與模型組相比,杜仲雄花粉總黃酮提取物中、低劑量組小鼠的肝臟指數(shù)顯著增加,說明杜仲雄花粉總黃酮提取物對D-半乳糖導(dǎo)致的小鼠肝損傷有一定的保護(hù)作用。杜仲雄花粉總黃酮提取物高劑量組小鼠的肝臟指數(shù)雖有上升趨勢,但無顯著性差異。陽性藥組及杜仲雄花粉總黃酮提取物組的腎臟和肝臟指數(shù)與模型組相比雖然有所上升但無顯著性差異。

圖5 各組小鼠臟器指數(shù)

3.3 杜仲雄花粉總黃酮提取物對小鼠生化指標(biāo)的影響

3.3.1 小鼠組織和血清總抗氧化能力(T-AOC)測試結(jié)果

由表1可知,模型組小鼠腦、肝臟和血清中總抗氧化能力最弱,并且與正常組有顯著性差異(P＜0.05),說明造模方法正確且衰老小鼠模型構(gòu)建正確。杜仲雄花粉總黃酮高、中、低劑量組器官與血清中總抗氧化能力均與模型組形成顯著性差異,其中總黃酮中劑量組的腦組織,肝臟,血清的總抗氧化能力均與模型組有極顯著性差異。陽性藥組腦組織和血清中總抗氧化能力與模型組形成顯著性差異,但肝臟中總抗氧化能力與模型組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明杜仲雄花粉總黃酮提取物有助于D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠提高總抗氧化能力,對肝臟的作用最強(qiáng)且優(yōu)于陽性對照藥維生素C。

表1 小鼠組織和血清中T-AOC水平

3.3.2 小鼠組織和血清中SOD活力測試結(jié)果

由表2可知,模型組小鼠器官和血清中SOD活力均與正常組形成顯著性差異(P＜0.05)。除杜仲雄花粉總黃酮高劑量組外,中、低劑量組小鼠器官及血清中SOD活力均與模型組形成顯著性差異,杜仲雄花粉總黃酮低劑量組的腦、肝臟、血清中S0D 活力比模型組分別提高了79.18%、61.31%、12.96%,在腦組織中SOD活力提高最大。表明杜仲雄花粉總黃酮提取物有助于提高D-半乳糖致衰老小鼠的SOD 活力,對D-半乳糖造成的小鼠腦組織中SOD活力下降有較好的延緩效果。

表2 小鼠組織和血清中SOD水平

3.3.3 小鼠組織和血清中MDA含量測定結(jié)果

由表3可知模型組小鼠腦、肝臟、血清中MDA的含量均與正常組形成顯著性差異,說明采用皮下注射D-半乳糖的方法可以加速小鼠的衰老。杜仲雄花粉總黃酮高、中、低劑量組小鼠腦及肝臟中MDA含量均低于模型組,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),表明杜仲雄花粉總黃酮有助于D-半乳糖致衰老小鼠清除脂質(zhì)過氧化物,具有一定的抗氧化能力。

表3 小鼠組織和血清中MDA含量

以上結(jié)果表明,杜仲雄花粉總黃酮具有提高D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠血清、肝臟、腦組織中SOD活力、總抗氧化能力和清除肝臟、腦組織中脂質(zhì)過氧化物的能力,有效防止或緩解氧化應(yīng)激損傷,從而起到抗氧化衰老的作用。

4 結(jié)論

D-半乳糖在正常情況下可以代謝葡萄糖,但在體內(nèi)大量存在時(shí),則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、免疫炎癥、端?？s短、代謝功能障礙等功能性變化,促進(jìn)機(jī)體衰老[19]。近年來科研工作者對于黃酮類化合物抗衰老作用的研究逐漸深入,對于其抗衰老作用機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。黃酮類化合物是一種較好的抗氧化劑,其發(fā)揮抗衰老作用與機(jī)體自由基的清除和抑制脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)。研究證明黃芩[20]、草豆蔻[21]、紅景天[22]植物中的黃酮類化合物能夠通過其自身的酚羥基阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),進(jìn)而減少自由基的產(chǎn)生,還可以通過增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化物酶的活性,清除體內(nèi)過多的自由基,并且抑制脂質(zhì)過氧化作用,減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如MDA等對機(jī)體的傷害,進(jìn)一步發(fā)揮抗衰老作用。與黃酮類化合物發(fā)揮抗衰老作用相關(guān)的信號(hào)通路主要有MAPK 信號(hào)通路、NF-kB 信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、SIRT1信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路等。黃酮類化合物通過調(diào)控衰老相關(guān)信號(hào)通路,參與機(jī)體的免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的過程,保護(hù)細(xì)胞,發(fā)揮抗衰老作用[23]。

本實(shí)驗(yàn)評價(jià)了杜仲雄花粉總黃酮提取物對D-半乳糖致衰老小鼠的影響。結(jié)果顯示杜仲雄花粉總黃酮提取物可以縮短小鼠潛伏期、提高小鼠對原平臺(tái)位置的記憶能力,改善衰老導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力衰退,延緩模型小鼠大腦衰老;給予衰老小鼠杜仲雄花粉總黃酮提取物可以顯著提高小鼠肝臟的臟器指數(shù),緩解衰老所致的肝組織損傷。以上結(jié)果證明了杜仲雄花粉總黃酮提取物具有一定的抗衰老作用。進(jìn)一步測定各組小鼠血清及腦、肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)的活性、總抗氧化能力(T-AOC)及丙二醛(MDA)的含量,結(jié)果顯示杜仲雄花粉總黃酮提取物可以提高供試實(shí)驗(yàn)小鼠主要器官和血清中超氧化物歧化酶(SOD)的活性及總抗氧化能力,減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生。T-AOC、SOD活性及MDA 含量在小鼠肝臟、腦主要器官和血清中表現(xiàn)出不同水平,表明杜仲雄花粉總黃酮提取物對小鼠各主要器官和血清的作用能力不同。杜仲雄花粉總黃酮提取物通過提高衰老小鼠抗氧化能力,減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,緩解氧化應(yīng)激對機(jī)體產(chǎn)生的損傷,具有一定的抗衰老作用。本研究為杜仲雄花粉產(chǎn)品的進(jìn)一步研發(fā)提供了理論依據(jù)。杜仲雄花粉總黃酮提取物的延緩衰老作用究竟是什么形式,還有待進(jìn)一步研究。