荔枝皮提取液?jiǎn)螌幖兓に?/h1>

2023-11-16 07:13:18蔣紅芝義崇寬尹翠瑩

輕紡工業(yè)與技術(shù)訂閱 2023年5期 收藏

關(guān)鍵詞：濃縮液清液柱層析

蔣紅芝，義崇寬，尹翠瑩

（廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，廣西 南寧 530007）

單寧是一類(lèi)廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚類(lèi)化合物，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，已被證實(shí)具有多種功效，比如抗氧化作用，能有效預(yù)防高血脂、高血糖、心腦血管等慢性疾病[1]。荔枝屬植物荔枝的果實(shí)。我國(guó)是荔枝生產(chǎn)大國(guó)，主要荔枝產(chǎn)地為廣東、福建、廣西、海南。荔枝在食藥、營(yíng)養(yǎng)保健、紡織染整等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，比如單寧與鐵、銅、鋁金屬離子結(jié)合可生成有色絡(luò)合物，用于羊毛、蠶絲等蛋白質(zhì)染色[2-3]。

荔枝皮目前尚未得到有效利用。荔枝皮含有多酚物質(zhì)（單寧），為主要功能成分之一。純化單寧的方法有溶劑萃取法、沉淀分離法、大孔樹(shù)脂吸附法、膜分離技術(shù)等[4]。其中，大孔樹(shù)脂吸附法具有生產(chǎn)效率高、成本低且操作簡(jiǎn)單方便、選擇性好、吸附容量大、大孔樹(shù)脂可再生重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)化制備天然產(chǎn)物中[5]。筆者對(duì)荔枝皮中單寧的純化工藝進(jìn)行研究，采用紫外-可見(jiàn)分光法測(cè)量荔枝皮中單寧的含量，利用大孔樹(shù)脂吸附對(duì)荔枝皮濃縮液中的單寧進(jìn)行分離和純化，篩選出性能較優(yōu)的大孔樹(shù)脂[6]，為實(shí)現(xiàn)荔枝皮資源的綜合利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

原料：桂味荔枝經(jīng)自然曬干的荔枝皮。

材料：?jiǎn)螌幩幔ǚ治黾?，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司），無(wú)水乙醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司），AB-8 大孔吸附樹(shù)脂、D101 大孔吸附樹(shù)脂（安徽三星樹(shù)脂科技發(fā)展有限公司），NKA-9 大孔吸附樹(shù)脂、ADS-21 大孔吸附樹(shù)脂、HPD826 大孔吸附樹(shù)脂（上海一基實(shí)業(yè)有限公司）。

儀器與設(shè)備：AS 220.R2 電子天平（蘇州培科實(shí)驗(yàn)室儀器科技有限公司）、高速多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）、KQ5200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、SHB—Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）、TopPette 手動(dòng)單道可調(diào)移液器[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司]、TU-1901 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、SB-5200D 超聲波清洗儀（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）、DBS-100 電腦全自動(dòng)部份收集器（上海滬西分析儀器廠有限公司）、HB-2B 恒流泵（上海青浦滬西儀器廠）、RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線和含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取單寧0.0500±0.0001g，用純化水定容至100mL，配制成500μg/mL 單寧貯備液。精確量取不同體積的貯備液0mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL 置于50mL 容量瓶中，用純化水定容，搖勻，選取0.25mL 稀釋到50mL 的溶液在200～400nm掃描吸收曲線，獲得最大吸收波長(zhǎng)。在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。

取曬干的荔枝皮，粉碎至細(xì)粉。參照前期研究的荔枝皮單寧最佳提取工藝[3]，精密稱(chēng)定荔枝皮粉，按料液比1∶40，加入70%乙醇（體積分?jǐn)?shù)），浸泡20min 后，放入45℃的超聲波清洗儀中提取40 min，冷卻后進(jìn)行抽濾，記錄提取抽濾液的體積。采用60℃減壓濃縮，得荔枝皮濃縮液，稀釋后測(cè)定吸光度A，計(jì)算單寧的含量，見(jiàn)公式（1）。

式中：m 為濃縮液中單寧的質(zhì)量，μg；c 為提取液稀釋后的濃度，μg/mL；V 為濃縮液的體積，mL；n 為稀釋倍數(shù)。

單寧的吸附量、吸附率計(jì)算見(jiàn)公式（2）、公式（3）。

式中：me為吸附平衡后溶液中的單寧量，μg；ce為吸附平衡后溶液中單寧的濃度，μg/mL；V 為吸附平衡后剩余溶液的體積，mL；n 為稀釋倍數(shù)；m0為吸附前溶液中的單寧量，μg。

1.2.2 大孔樹(shù)脂分離純化

柱層析分離純化的工藝流程為：吸附樹(shù)脂預(yù)處理→大孔樹(shù)脂裝柱→平衡→添加荔枝皮單寧濃縮液→樹(shù)脂吸附單寧→用洗脫溶劑洗脫→收集洗脫液→稀釋后測(cè)定吸光度→吸光度乘以稀釋倍數(shù)后繪圖[8]。

1.2.2.1 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理

先用95%乙醇浸泡大孔樹(shù)脂24 h，使其充分溶脹，適當(dāng)攪拌使大孔樹(shù)脂充分接觸，以便趕出孔中的空氣[6]，然后將大孔樹(shù)脂裝柱，用95%乙醇沖洗，直至洗出液加適量純化水后無(wú)白色渾濁現(xiàn)象出現(xiàn)，最后用純化水洗至沒(méi)有乙醇即可使用。

1.2.2.2 最佳樹(shù)脂的篩選

分別稱(chēng)取2.00g 預(yù)處理過(guò)的型號(hào)為ADS-21、HPD826、AB-8、NKA-9、D101 的大孔樹(shù)脂，加入荔枝皮單寧提取液的濃縮液5mL，室溫下靜置吸附一定時(shí)間后取上清液測(cè)定吸光度，吸光度小則說(shuō)明吸附好。

1.2.2.3 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附和洗脫

分別稱(chēng)取10.00g 預(yù)處理過(guò)的型號(hào)為ADS-21、HPD826、AB-8、NKA-9、D101 的大孔樹(shù)脂[7]置于5 個(gè)燒杯中，加入荔枝皮濃縮液10.00mL，在室溫下吸附30min、60min 后取上清液測(cè)定吸光度，至達(dá)到吸附平衡為止，計(jì)算吸附率。據(jù)此選擇出吸附效果好的樹(shù)脂。

從已充分吸附荔枝皮濃縮液的5 種型號(hào)的樹(shù)脂中分別稱(chēng)取2.00g 各3 份，加入不同體積分?jǐn)?shù)（50%、70%、90%）的乙醇溶液5mL，洗脫30min、60min、80min，分別測(cè)定上清液的吸光度，計(jì)算洗脫率。據(jù)此選擇出洗脫效果好的樹(shù)脂。

1.2.2.4 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附和洗脫

分別稱(chēng)取25.00g HPD826、ADS-21 預(yù)處理過(guò)的樹(shù)脂置于2 個(gè)燒杯中，加入荔枝皮的濃縮液25.00mL，在室溫下的超聲波清洗器中進(jìn)行振蕩吸附30min、60min后測(cè)定上清液的吸光度[9]。用90%乙醇洗脫，收集洗脫液，測(cè)定吸光度。

1.2.2.5 柱層析吸附和洗脫

將靜態(tài)吸附試驗(yàn)篩選出的大孔樹(shù)脂HPD826、大孔樹(shù)脂ADS-21 分別裝柱（濕法裝柱），量取荔枝皮濃縮液25.00mL，吸附1h，用純化水洗3 次。再用90%乙醇洗脫，收集洗脫液，測(cè)定吸光度。考察洗脫溶劑用量對(duì)洗脫率的影響[10]。洗脫率計(jì)算公式見(jiàn)公式（4）。

式中：ma為洗脫的質(zhì)量，μg；m0為吸附前溶液中的單寧量，μg；me為吸附平衡后溶液中的單寧量，μg。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧酸定性和定量結(jié)果

2.1.1 單寧酸的最大吸收波長(zhǎng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

從單寧酸掃描曲線得到最大吸收波長(zhǎng)為276nm。在276nm 下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A，繪出c-A 標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程c=28.849A+2.4219。標(biāo)準(zhǔn)單寧酸濃度c 在0～30.00μg/mL 范圍內(nèi)與A 呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2 荔枝皮單寧最大吸收波長(zhǎng)

用70%乙醇提取荔枝皮中的單寧，提取液色澤為暗紅色，提取液減壓濃縮，回收乙醇。取濃縮液0.15mL 并稀釋成50mL，掃描曲線得最大吸收波長(zhǎng)為278nm。其處于單寧酸最大吸收波長(zhǎng)276±2nm 范圍內(nèi)，故荔枝皮提取液中含有單寧。分別測(cè)定提取液、濃縮液稀釋后的吸光度，計(jì)算出對(duì)應(yīng)的單寧含量，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 不同提取液、濃縮液中單寧的含量

2.2 最佳吸附樹(shù)脂類(lèi)型的篩選

分別稱(chēng)取2.00g 預(yù)處理過(guò)的型號(hào)為ADS-21、HPD826、AB-8、NKA-9、D101 的大孔樹(shù)脂，分別加入荔枝皮單寧提取液的濃縮液5mL，室溫下靜置吸附一定時(shí)間后，測(cè)定上清液的吸光度。影響大孔樹(shù)脂吸附性能的因素包括孔徑和比表面積等，孔徑大小影響被吸附物質(zhì)的擴(kuò)散，比表面積大小影響吸附物質(zhì)的量[11]。通過(guò)靜態(tài)吸附后，取上清液2mL 稀釋至50mL，用5 種樹(shù)脂吸附60min 后，測(cè)定吸光度，計(jì)算吸附率。吸附率結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂對(duì)荔枝皮單寧的吸附效果

數(shù)據(jù)表明，大孔樹(shù)脂對(duì)荔枝皮單寧的吸附率由大到小順序?yàn)镹KA-9 >ADS-21 >HPD826 >D101 >AB-8。顯然，NKA-9 大孔樹(shù)脂吸附效果最好，其次分別是ADS-21 大孔樹(shù)脂、HPD826 大孔樹(shù)脂。

2.3 洗脫劑溶液濃度的選擇

吸附荔枝皮單寧的大孔樹(shù)脂洗脫率見(jiàn)表2，表2中的洗脫率數(shù)據(jù)取4 位有效數(shù)字。

表2 溶劑對(duì)荔枝皮單寧的洗脫率影響

數(shù)據(jù)表明，5 種類(lèi)型樹(shù)脂各自的洗脫率極高值集中在體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇中處理30min，而5 種類(lèi)型樹(shù)脂在體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇中處理30min 也能相應(yīng)得到較好的洗脫率。

HPD826 在90%乙醇中洗脫30min 時(shí)，洗脫率為5種類(lèi)型樹(shù)脂全部測(cè)試數(shù)據(jù)的最高值16.13%，說(shuō)明其洗脫效果最好。在90%乙醇中洗脫30min 時(shí)，ADS-21 洗脫率為13.77%；在90%乙醇中洗脫30min 時(shí)，D101 洗脫率達(dá)15.70%，但其洗脫60min 后降為13.56%。結(jié)合圖1 的吸附率數(shù)據(jù)看，NKA-9 的大孔樹(shù)脂吸附效果比較好但洗脫效果差。經(jīng)綜合比較后認(rèn)為，HPD826、ADS-21 的吸附率、洗脫率均較好，故后續(xù)選擇HPD826、ADS-21 做大樣試驗(yàn)。而洗脫溶劑選擇體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇洗脫效果較好。

2.4 大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附和洗脫結(jié)果

2.4.1 靜態(tài)吸附結(jié)果

分別稱(chēng)取10.00g 預(yù)處理過(guò)的型號(hào)為ADS-21、HPD826、AB-8、NKA-9、D101 的大孔樹(shù)脂置于5 個(gè)燒杯中，加入荔枝皮的濃縮液10.00mL，在室溫條件下靜置吸附60min 后，取上清液測(cè)定吸光度A。各樹(shù)脂的靜態(tài)吸附率見(jiàn)圖2。靜態(tài)吸附率由大到小的順序?yàn)锳DS-21 >NKA-9 >D101 >HPD826 >AB-8，ADS-21 的吸附率為89.15%，吸附效果最好，其次是NKA-9 的吸附率為82.18%，D101 的吸附率為77.02%。

圖2 不同樹(shù)脂的靜態(tài)吸附率

2.4.2 靜態(tài)洗脫結(jié)果

選擇90%乙醇進(jìn)行洗脫，分別洗脫30min、60min、80min 后，取上層清液1mL 稀釋至50mL，測(cè)定吸光度，計(jì)算洗脫率。不同樹(shù)脂的靜態(tài)洗脫率見(jiàn)圖3。由圖3 可知，各樹(shù)脂隨著洗脫時(shí)間的延長(zhǎng)，洗脫率均有所下降，但是下降的趨勢(shì)各不相同。例如，洗脫30min 時(shí)，HPD826和D101 的洗脫率相對(duì)其他樹(shù)脂較高，而洗脫60min時(shí)，D101 和ADS-21 的洗脫率相對(duì)其他樹(shù)脂較高。

圖3 90%乙醇不同樹(shù)脂靜態(tài)洗脫率

2.5 大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附和洗脫結(jié)果

2.5.1 HPD826 動(dòng)態(tài)吸附和洗脫結(jié)果

稱(chēng)取2 份25.00g HPD826 預(yù)處理過(guò)的樹(shù)脂置于2個(gè)燒杯中，加入荔枝皮的濃縮提取液25.00mL。一份在室溫下用超聲波清洗器振蕩吸附30min、60min 后測(cè)定上清液的吸光度，30min 的吸光度為0.334，60min 的吸光度為0.170。另一份在柱層析上吸附，25.00mL 反復(fù)吸附3 次約0.5h，靜置0.5h，合計(jì)1h 后洗凈，測(cè)定上層清液的吸光度。2 份試樣再分別用柱層析洗脫，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4 可見(jiàn)，HPD826 大孔樹(shù)脂柱層析吸附的洗脫峰較高和較窄，柱層析吸附比超聲波吸附的吸附效果好。

圖4 HPD826 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)洗脫曲線

2.5.2 2 種樹(shù)脂動(dòng)態(tài)洗脫對(duì)比

HPD826、ADS-21 柱層析動(dòng)態(tài)洗脫液峰值曲線見(jiàn)圖5。由圖5 可見(jiàn)，荔枝皮濃縮液經(jīng)過(guò)HPD826、ADS-21 這2 種大孔樹(shù)脂吸附、柱層析動(dòng)態(tài)洗脫分離后較集中在1 個(gè)洗脫峰。HPD826 大孔樹(shù)脂吸附柱層析的洗脫峰比較窄，洗脫下來(lái)的單寧相對(duì)比較集中，即分離洗脫的效果比較好。HPD826 大孔樹(shù)脂洗脫效果優(yōu)于ADS-21 大孔樹(shù)脂。HPD826、ADS-21 2 種樹(shù)脂均可以用作荔枝皮單寧的分離純化。

圖5 HPD826、ADS-21 柱層析動(dòng)態(tài)洗脫液峰值曲線

3 結(jié)論

（1）荔枝皮中單寧的提取參照荔枝皮單寧的最佳提取工藝進(jìn)行，提取液經(jīng)濃縮后得濃縮液。

（2）不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂對(duì)荔枝皮濃縮液中單寧的吸附和洗脫效果有所不同。NKA-9、ADS-21、HPD826 吸附效果較好；90%乙醇洗脫效果最好；綜合吸附及洗脫效果，篩選出了對(duì)荔枝皮單寧分離純化效果較好的大孔樹(shù)脂HPD826、ADS-21，二者吸附率分別為76.57%、89.15%，洗脫率分別為16.13%、13.77%。ADS-21 的吸附效果優(yōu)于HPD826，但從洗脫效果看，HPD826 優(yōu)于ADS-21。

（3）HPD826 樹(shù)脂分離純化荔枝皮單寧的工藝參數(shù)為：上柱流速為勻速，質(zhì)量濃度為3828.5μg/ml，洗脫劑為90%乙醇（體積分?jǐn)?shù)）。

（4）荔枝皮濃縮液中單寧經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附、90%乙醇洗脫后，再經(jīng)濃縮、真空干燥后可得固體單寧。

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