用DNA 宏條形碼技術(shù)分析鵠沼枝額蟲的食性

陳江，吳俁學，王艷艷，姚俊杰，何浩宇

（1.貴州大學漁業(yè)資源與環(huán)境研究中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025）

食性分析是攝食生態(tài)學（trophic ecology）的主要內(nèi)容之一和動物個體及種群研究的基礎(chǔ)。目前，食性分析的方法主要有胃內(nèi)容物分析法、穩(wěn)定同位素法和直接觀察法。在魚類等水生動物食性研究中，主要采取胃內(nèi)容物形態(tài)學鑒定分析法[1,2]，但已被消化的碎屑食物、糜等無法鏡檢觀察判斷種類[3]。小型水生動物攝食量小、腸內(nèi)容物分離困難，形態(tài)學的鑒定就更加困難[4]。

DNA 宏條形碼（DNA metabarcoding）技術(shù)是2012 年由Taberlet 等[5]研究提出，能更有效地分析胃內(nèi)容物，已廣泛運用于土壤和水生態(tài)環(huán)境的多樣性監(jiān)測[6,7]、微生物菌群研究[8,9]、陸生動物食性[10]和生物監(jiān)測[11]等。在水生動物中，已開始利用宏條形碼技術(shù)來研究海蜇（Rhopilema esculentum）、塔型馬蹄螺（Tectus pyramis）、黃鰭棘鯛（Acanthopagrus latus）等的食性[12-14]。

仙女蝦（fairy shrimp）是一種淡水小型甲殼動物，是無甲目（Anostraca）一類動物的統(tǒng)稱，是甲殼綱動物中最具多樣性的分類單元[15]。仙女蝦的大部分物種是濾食性動物[16,17]，極少數(shù)仙女蝦是捕食者[18]。2021 年9 月30 日，在貴州省都勻市甲登村一個池塘發(fā)現(xiàn)有仙女蝦，經(jīng)鑒定為鵠沼枝額蟲（Branchinella kugenumaensis），隸屬于釵額蟲科（Thamnocephalidae）枝額蟲屬（Branchinella）。鵠沼枝額蟲主要分布于中國、日本、朝鮮及印度南部，為淡水仙女蝦。潘茜等研究了餌料對鵠沼枝額蟲生長和生殖力的影響。他們提到鵠沼枝額蟲主要以細菌、有機碎屑和單胞藻等為食，用豆腐、蝦片、米糠、大豆、面粉、小球藻6 種餌料培養(yǎng)鵠沼枝額蟲幼體[19]。鵠沼枝額蟲通過產(chǎn)生休眠卵來度過不利時期，條件適宜時，大量生長、繁衍[20]。鵠沼枝額蟲出現(xiàn)時間和地點不確定，對其在自然界中的食性了解較少。本研究采用DNA 宏條形碼技術(shù)研究了鵠沼枝額蟲的食性，以進一步認識其攝食特點。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在貴州省都勻市甲登村的一個池塘（E107°44'46.74"，N26°17'55.36"）采集鵠沼枝額蟲樣品。蟲體質(zhì)量（0.032±0.004）g，全長（15.93±1.81）mm。

用滅菌后的器具在解剖鏡下快速取腸道放入無菌管中，用無水乙醇固定，然后放入裝有干冰的低溫盒。共采集50 尾鵠沼枝額蟲腸道，帶回實驗室后，-80 ℃保存。

1.2 DNA 提取、文庫構(gòu)建和測序

使用OMEGA 的E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 試劑盒提取鵠沼枝額蟲宏基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性，Qubit 定量檢測DNA 樣本濃度，質(zhì)檢合格后，將提取的DNA 用Covaris S220 聚焦超聲儀進行剪切、回收，質(zhì)檢合格后，使用NEB NextUltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina 試劑盒進行文庫擴建。測序以及部分數(shù)據(jù)分析由上海生工生物工程公司完成。

1.3 宏基因組拼接組裝、預(yù)測和物種注釋

將質(zhì)量控制后的讀長用IDBA_UD 軟件拼接組裝成長序列contig，根據(jù)讀長間的overlap 關(guān)系，獲得contigs。使用Prodigal 軟件對組裝后的contigs 的開放式閱讀框進行預(yù)測。采用CD-HIT 軟件進行聚類，每類取最長的基因作為代表序列，構(gòu)建非冗余基因集。使用DIAMOND 軟件將基因集蛋白序列與Nr 數(shù)據(jù)庫進行blastp 同源性比對，得到同源物種信息。根據(jù)NCBI 的微生物分類學信息數(shù)據(jù)庫，在界、門、綱、目、科、屬和種水平注釋物種信息。統(tǒng)計分析時，動物統(tǒng)計序列相對量在0.1%以上的物種，考慮到水體中藻類的因素，植物統(tǒng)計序列相對量在0.001%以上的物種。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測序數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果

樣品測序數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果見表1。對鵠沼枝額蟲樣品進行高通量測序，共獲得有效序列61 146 906條，平均序列長度138.54 bp。堿基質(zhì)量在Q30 以上的比列為93.52%，GC 堿基數(shù)目3 517 923 616 bp。

表1 樣品測序數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果Tab.1 Quality control results of sample sequencing data

2.2 鵠沼枝額蟲的食物種類

鵠沼枝額蟲食物組成中各門的物種數(shù)見表2。在除去鵠沼枝額蟲自身序列、無法鑒定且數(shù)量較少的序列后，共獲得151 個物種，分屬于10 個門類:節(jié)肢動物門（Arthropoda）、刺胞動物門（Cnidaria）、脊索動物門（Chordata）、線蟲動物門（Nematoda）、軟體動物門（Mollusca）、半索動物門（Hemichordata）、環(huán)節(jié)動物門（Annelida）、扁形動物門（Platyhelminthes）、被子植物門（Angiospermae）和綠藻門（Chlorophyta）。食物序列最豐富的類群是節(jié)肢動物門，共有83 種，其次是脊索動物門和被子植物門，分別有27 種和14種，最少的是環(huán)節(jié)動物門和半索動物門，分別是2種和1 種。

表2 鵠沼枝額蟲食物各門物種數(shù)Tab.2 Number of species in the food items of fairy shrimp B.kugenumaensis in phylum level

鵠沼枝額蟲主要食性物種組成見表3。鵠沼枝額蟲主要的食性物種來自四個門：節(jié)肢動物門、刺胞動物門、脊索動物門和半索動物門，共有19 個物種。在綱水平，昆蟲綱有12 個物種，甲殼綱、蛛形綱各有2 個物種，水螅綱、鳥綱和腸鰓綱均只有1 個物種。

表3 鵠沼枝額蟲主要食性物種組成Tab.3 Species composition of food items in fairy shrimp B.kugenumaensis

從門水平上來看（圖1），節(jié)肢動物門占據(jù)了食物序列總數(shù)的70%，脊索動物門占11%，刺胞動物門占5%，軟體動物門占4%，線蟲動物門占4%，半索動物門占2%。植物所占食物序列的比例少，被子植物門0.7%、綠藻門0.3%。

圖1 鵠沼枝額蟲門水平上食物組成比例Fig.1 Food composition of fairy shrimp B.kugenumaensis at phylum level

在屬水平上（圖2），溞屬（Daphnia）占食物序列比例最高，為12%，其中大型溞（D.magna）占7%，蚤狀溞（D.pulex）占5%。其次是水螅屬（Hydra）占據(jù)食物序列的5%，其中Hydra littoralis 占據(jù)0.9%，水螅（Hydra vulgaris）占據(jù)4%。頂切葉蟻屬，占據(jù)食物序列的4%，物種為頂切葉蟻（Acromyrmex echinatior）。弓背蟻屬（Harpegnathos）占據(jù)食物序列的4%，物種為跳鐮猛蟻（Harpegnathos saltator）；鐮猛蟻屬（Camponotus）占據(jù)食物序列的3%，物種為佛羅里達弓背蟻（Camponotus floridanus），毛蟻屬（Lasius）占據(jù)食物序列的1%，物種為黑毛蟻（Lasius niger）。斑蝶屬（Danaus）、長吻蟲屬（Saccoglossus）和鴿屬（Columba）占據(jù)食物序列的3%，均只有一個物種，分別為黑脈金斑蝶（Danaus plexippus）、Saccoglossus kowalevskii 和原鴿（Columba livia）。

圖2 鵠沼枝額蟲屬水平上食物組成比例（取相對含量前十五的屬）Fig.2 Food composition of fairy shrimp B.kugenumaensis at genus level

3 討論

3.1 鵠沼枝額蟲食性分析

飼喂實驗和胃腸內(nèi)容物分析發(fā)現(xiàn)，大部分仙女蝦物種過濾水體中的有機顆粒來生存[16,17]，但不清楚有機顆粒的物種組成。本研究運用DNA 宏條形碼技術(shù)，了解了鵠沼枝額蟲在自然水域中的濾食信息。鵠沼枝額蟲因體型差異、生活環(huán)境等因素的影響，無法捕食節(jié)肢動物門、脊索動物門、軟體動物門等門類的個體較大的動物，但檢測結(jié)果中這幾個門類的動物占據(jù)了70%DNA 序列，這表明鵠沼枝額蟲是濾食水體中這些門類動物的有機碎屑。

本研究觀察到，鵠沼枝額蟲以仰泳的形式游泳，頭部和腹面朝上，腹部附肢撥水游動。Cannon 在闡述仙女蝦的攝食機制時認為，食物顆粒是被一股明確的力帶向口腔，鵠沼枝額蟲的攝食是主動過濾[16]。從形態(tài)學來看，鵠沼枝額蟲的唇是頭部在額附肢下方的延續(xù)，大致呈三角形，向后延伸，邊緣周圍有稠密的剛毛，外唇腺突出；下頜骨在口器的兩側(cè)，呈棒狀，前端有細小的齒和較大的棘；上頜骨較小，無節(jié)，邊緣具17～18 雙節(jié)羽狀剛毛[20]。鵠沼枝額蟲的口器上下都具有剛毛，有利于鵠沼枝額蟲過濾水體中的有機顆粒。鵠沼枝額蟲的齒和棘的可將較大的食物顆粒切碎。本研究結(jié)果中大型蚤體長在1.75～6.00 mm，蚤狀溞體長在0.91～3.36 mm。鵠沼枝額蟲個體較大，可用齒和棘切碎后進入腸道。

鵠沼枝額蟲是主動濾食。從食物組成中發(fā)現(xiàn)，動物成分占據(jù)了99%，植物成分只占0.9%，是否說明鵠沼枝額蟲的食物組成是以動物蛋白為主呢？有關(guān)研究表明，仙女蝦的濾食無選擇性，即各種動植物死后在水中降解為有機碎屑被其隨機濾食[21]。鵠沼枝額蟲也同樣如此，它通過葉足運動來攝食，對于環(huán)境中的有機碎屑無法選擇，均被其濾食。食物成分的動物與植物的占比，只能說明該水體中動物有機碎屑量遠遠高于植物有機碎屑量。

3.2 DNA 宏條形碼技術(shù)鑒定小型水生動物食性物種的優(yōu)勢

在DNA 宏條形碼技術(shù)出現(xiàn)以前，對仙女蝦等小型水生動物的食性研究大多采用飼喂實驗、胃腸內(nèi)容物分析方法[17,22-24]。如Brendonck 將一種仙女蝦（S.proboscideus）養(yǎng)殖在不同密度海藻細胞的懸浮液中，觀察其濾過率和攝食率[23]；Metens 等[24]用纖毛蟲、輪蟲、團藻、線蟲和小型甲殼動物作為食物喂養(yǎng)S.proboscideus 研究其食性和攝食機制；Bernice分析了另一種仙女蝦（Spreptocephlas dichotomus）腸道內(nèi)容物，發(fā)現(xiàn)了浮游動植物和甲殼動物碎片，認為浮游植物是S.dichotomus 的主要食物來源，也認為它的濾食無選擇[22]。這些研究工作多在實驗室進行，相對于復(fù)雜自然水體，實驗室條件可控；胃腸內(nèi)容物分析雖然可以觀察到野外仙女蝦的部分食物種類，但對“甲殼動物碎片”、濾食有機顆粒和已消化或半消化食物，則難以通過形態(tài)學鑒定。

DNA 宏條形碼技術(shù)的發(fā)展，為小型水生動物的食性研究提供了極大的便利。本研究中，對鵠沼枝額蟲整個腸道的測序準確地定性分析了野生鵠沼枝額蟲濾食有機碎屑的食物物種組成，這是飼喂實驗、胃腸內(nèi)容物分析等方法難以獲得的結(jié)果。DNA宏條形碼技術(shù)在食性分析中具有對餌料生物的分辨率和準確性高，可以分析已經(jīng)被消化的餌料生物，在水生動物食性分析中將發(fā)揮重要作用。

小結(jié)

采樣DNA 宏條形碼技術(shù)鑒定了自然水域中鵠沼枝額的食性。共鑒定出10 個門的151 個物種，獲得了大量具體食物物種的信息。研究表明，在自然水體中，鵠沼枝額蟲的食物來源與其出現(xiàn)的水體環(huán)境密切相關(guān)，其獲取食物的方式是主動濾食，食物種類無選擇性，但可以用齒和棘切碎個體較大的大型蚤和蚤狀溞。

在以后的研究中，期望在更多不同的水體獲得鵠沼枝額蟲，測定與分析食性，獲得更多、更全面地對鵠沼枝額蟲食性的深入認識。