雙通道結構光照明超分辨定量熒光共振能量轉移成像系統(tǒng)*

羅澤偉 武戈 陳摯 鄧馳楠 萬蓉 楊濤 莊正飛 陳同生?

1)(華南師范大學生物光子學研究院,教育部激光生命科學重點實驗室,廣州 510631)

2)(華南師范大學生物光子學研究院,廣東省激光生命科學重點實驗室,廣州 510631)

基于結構光照明(structured illumination,SI) 的超分辨熒光共振能量轉移(super resolution fluorescence resonance energy transfer,SR-FRET) 成像技術(SISR-FRET) 可以通過解析活細胞內亞衍射區(qū)域的FRET 信號來研究細胞器精細結構上的分子結構與功能.SISR-FRET 成像中激發(fā)發(fā)射通道切換導致成像速度較慢,限制了SISR-FRET 在快速成像中的應用.針對此問題,本文提出一種雙通道結構光照明超分辨定量FRET 成像系統(tǒng)和方法,通過在成像光路中加入FRET 雙通道成像和配準模塊,實現(xiàn)了SISR-FRET 激發(fā)發(fā)射通道的空分切換以及通道復用.結合通道亞像素配準校正的圖像重建算法,雙通道SISR-FRET 可以在保持定量超分辨FRET 分析的同時提升了3.5 倍時間分辨率.利用搭建的多色SIM 系統(tǒng)進行了活細胞表達靶向線粒體外膜FRET 標準質粒的超分辨成像實驗,驗證了雙通道SISR-FRET 的時空分辨率增強和FRET 定量分析的保真度.

1 引言

熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET) 顯微成像術在活細胞中原位定量檢測生物大分子間動態(tài)相互作用及空間分布方面具有獨特優(yōu)勢.在細胞生命活動中,蛋白質與其他生物分子形成復雜相互作用和調節(jié)網絡,原位研究蛋白質-蛋白質相互作用的時空分布和功能關系是目前生命科學的重要課題之一[1,2].盡管熒光顯微成像技術和熒光標記技術的發(fā)展為研究蛋白質-蛋白質相互作用提供了有利的條件,目前已有的蛋白間互作研究方法仍無法在活細胞內同時實現(xiàn)蛋白結構功能和空間分布動態(tài)變化的解析[3].FRET 利用分子間共振能量轉移速率與距離6 次方反比的關系來度量1—10 nm 尺度分子的接近程度,該物理過程非常適合于表征分子構象變化和分子間相互作用[4].通過定量計算FRET 表觀效率(ED,EA) 和總受體與供體的濃度比(RC),定量FRET 實現(xiàn)了活細胞內動態(tài)蛋白互作的“可視化”,并為揭示蛋白復合物形成過程中親和力和化學計量比的測量提供了獨特見解[5,6].以上優(yōu)勢使得定量FRET 顯微成像技術正成為研究蛋白質調控網絡和信號轉導途徑、疾病機制和藥物篩選的重要工具[7-9].

超分辨FRET 顯微成像術(super resolution FRET,SR-FRET) 為研究亞細胞器精細結構上的分子結構及其功能開辟了新道路.受限于衍射極限對顯微成像空間分辨率的約束,FRET 顯微成像分辨能力存在瓶頸,這使得傳統(tǒng)FRET 顯微成像在觀測亞細胞區(qū)域內蛋白分子相互作用及空間定位時只能解析常規(guī)熒光顯微鏡分辨率約束下多分子事件的平均行為[10].近年來超分辨熒光顯微成像技術的發(fā)展極大提升了亞細胞器精細結構動態(tài)變化的解析力,因此將超分辨顯微與FRET 成像功能融合并實現(xiàn)SR-FRET 顯微成像獲得了學界的廣泛關注[11,12].實現(xiàn)超分辨FRET 顯微成像的難點主要包括:1) 如何從重新分布的超分辨光場中定量解析出FRET 信號;2)如何在有限光通量和光漂白條件下平衡時空分辨率提升與FRET 定量計算保真度.目前,基于單分子定位顯微術(single molecule localization microscopy,SMLM) 和受激發(fā)射耗盡顯微術(stimulated emission depletion microscopy,STED) 的SR-FRET 成像技術利用有機熒光染料標記的FRET 固定樣品實現(xiàn)了FRET信號的超分辨解析[13-15].然而基于SMLM 的SRFRET需要收集供體和受體分子同時處于光激發(fā)活化狀態(tài)時的FRET 信號,這對于互相獨立閃爍的供受體對來說十分困難,極長的成像時間也使得該技術與研究活細胞中發(fā)生的動態(tài)過程很難兼容[10].對于基于STED 的SR-FRET,STED 損耗光改變了供體的激發(fā)態(tài)壽命并導致供體和受體分子的不均勻光漂白,這種調制過程使得STED FRET 只能得到半定量的FRET 指數(shù)而不能完成定量FRET測量[15].針對以上問題,本課題組開展了結構光照明顯微術(structured illumination microscopy,SIM)和定量FRET 融合的探索[16].由于SIM 顯微術相比其他SR 成像技術具有照明光強度低、成像速度快的優(yōu)勢,融合SIM 和FRET 技術可能實現(xiàn)目前最佳平衡時空分辨率和光漂白影響的SR-FRET成像術[17-22].為了消除SIM 重建偽影對定量FRET的影響,本課題組設計了一種基于結構光照明超分辨FRET 兩步重建方法(SISR-FRET),該方法依次完成三通道SIM 圖像的線性重建和基于共同定位掩模濾波的FRET 定量解析.兩步過程可以確保重建的SR-FRET 信號的保真度,同時可以精確去除由SIM 偽影引起的假陽性FRET 信號.與傳統(tǒng)的寬場FRET 成像相比,SISR-FRET 保持了定量特性并實現(xiàn)了活細胞中120 nm 空間分辨率解析亞細胞器精細結構上的FRET 信號[23].

實現(xiàn)快速結構光照明超分辨定量FRET 成像是目前活細胞SR-FRET 研究的迫切需要.對于SISR-FRET,完成一次成像需要采集結構光調制下的三通道27 張原始圖像組,如果被成像的FRET樣本在拍攝總時間內移動距離超出了系統(tǒng)點擴散函數(shù)(point spread function,PSF) 范圍,則重建的超分辨圖像就會出現(xiàn)運動偽影并導致FRET 結果失真[24].盡管傳統(tǒng)基于濾光片轉輪的時分FRET三通道切換方案具有切換靈活、無需通道對準等優(yōu)點,機械轉盤切換速度慢的缺點限制了SISR-FRET快速成像[25].針對以上問題,本文提出一種雙通道結構光照明超分辨定量FRET 成像系統(tǒng)和方法,通過在成像光路中引入FRET 雙通道探測和對準模塊,雙通道SISR-FRET 系統(tǒng)實現(xiàn)了FRET 通道的空分切換.進一步地,通過優(yōu)化系統(tǒng)時序控制以及加入通道亞像素對準算法,雙通道SISR-FRET系統(tǒng)實現(xiàn)了快速三通道成像并保持通道亞像素精度對準,最終相比于基于濾光片轉輪的時分FRET三通道切換方案有效提升了3.5 倍的時間分辨率.利用該系統(tǒng)對活細胞表達靶向線粒體外膜的FRET標準質粒進行成像,驗證了雙通道SISR-FRET 的時空分辨率增強和FRET 定量分析的保真度.

2 雙通道SISR-FRET 系統(tǒng)與方法

2.1 成像系統(tǒng)設計與搭建

完成一次SISR-FRET 成像首先需要收集供體激發(fā)供體發(fā)射(DD 通道)、供體激發(fā)受體發(fā)射(DA 通道) 和受體激發(fā)受體發(fā)射(AA 通道) 3 個通道結構光照明調制的原始圖像組.每一個激發(fā)發(fā)射通道的原始圖像組由3 個不同結構光方向角,每個結構光方位角包含3 個不同相位差的余弦結構光調制的寬場熒光圖像構成.三通道原始數(shù)據(jù)的強度分布可以由下式表示:

其中下標θ(1,2,3)和n(-1,0,1) 表示余弦照明的方向角和相位差,上標X(=DD,DA,AA) 表示FRET 通道,S(r) 表示樣本熒光信號的空間分布,分別是余弦結構光場的調制深度、照明頻率矢量和初相位,HX(r) 表示不同F(xiàn)RET 通道X(=DD,DA,AA) 對應的點擴散函數(shù)(PSF).

圖1 雙通道SISR-FRET 系統(tǒng)光路示意圖Fig.1.Schematic diagram of dual-channel SISR-FRET system.

2.2 雙通道SISR-FRET 重構方法

在進一步FRET 計算之前,需要對三通道SRFRET 圖像進行預處理.由于雙通道成像系統(tǒng)存在通道配準的問題,除了在系統(tǒng)硬件配準模塊上進行像素級別的通道對準,還需要通過配準算法實現(xiàn)FRET 三通道進一步的亞像素級對準,以保證FRET逐像素計算時的精度.DA 和AA 通道圖像由于通道的復用關系不需要額外對準,因此配準算法以DD通道SR 重建圖像為基準,通過將DA,AA 通道圖像與仿射變換相乘來實現(xiàn)與DD 通道圖像的亞像素級對準.仿射變換矩陣T通過以下最優(yōu)化方法獲得:

其中xt,yt為仿射變換矩陣的平移參數(shù),θ,s分別表示旋轉和縮放補償參數(shù).

另一方面,FRET 定量計算需要考慮背景灰度的影響.實驗中對每個FRET 成像通道的超分辨圖像進行逐像素灰度值統(tǒng)計,并以灰度值直方圖中第1 個峰值對應的灰度值作為該視野的背景灰度值(XDD,DA,AA).接著對圖像進行背景修正并將負的像素灰度值置零,得到每個成像通道的修正圖像.具體過程表示為

FRET 三通道原始圖像組在采集過程中不可避免產生噪聲,這些噪聲會經過SR-SIM 線性重建放大產生重建偽影并嚴重影響FRET 定量分析.由于噪聲偽影是隨機疊加在FRET 三通道圖像上,其空間分布彼此獨立,因此這種偽影在三通道圖像間具有非常低的相關性.相反,當FRET 發(fā)生的必要條件是供受體熒光分子靠近到10 nm 尺度內,這樣供體和受體分布將展現(xiàn)出極強的共定位特征,即超過隨機噪聲圖像間的強相關性.因此可以利用以上先驗信息設計共同定位掩模來抑制重建偽影的干擾.為了定量表征FRET 信號和噪聲在不同成像通道之間差異,逐像素的共定位分析可以表示如下:

其中 PCCmap(r) 是供體和受體圖像中每個像素對皮爾遜相關系數(shù)(PCC)的權重分布圖,MOCmap(r)是供體和受體圖像中每個像素對曼德斯相關系數(shù)(MOC)的權重分布圖.是經過背景扣除后的DD 通道圖像的灰度平均值,經過背景扣除后的AA 通道圖像的灰度平均值.將 PCCmap(r) 和MOCmap(r)相乘得到混合共定位權重矩陣,并通過自適應閾值處理算法進行混合共定位權重矩陣的分割生成二值化掩膜板Bcolocalmask(r),可以如下表示:

經過以上圖像預處理后,SISR-FRET 計算供體為中心的FRET 表觀效率ED和總受體與供體的濃度比RC由如下公式得到:

其中,FcSIM為受體敏化發(fā)射熒光強度,G為敏化淬滅轉化因子,K為供受體濃度轉化因子,a,b,c,d為系統(tǒng)串擾系數(shù).

總結雙通道SISR-FRET 算法流程圖如圖2所示,實施SISR-FRET 需要以下3 個步驟:1)使用三通道原始數(shù)據(jù)重建三通道SR 圖像(XDD,DA,AA);2) 通過圖像預處理過程,對重建的三通道SR 圖像進行背景扣除,通道對準和共定位掩膜濾波模板生成;3) 對預處理后的三通道SR 圖像中定量計算FRET 效率(ED)和受供體濃度比(RC).

圖2 雙通道SISR-FRET 的算法流程圖Fig.2.Flow chart of dual-channel SISR-FRET algorithm.

2.3 控制系統(tǒng)的設計與優(yōu)化

根據(jù)2.1 和2.2 節(jié)的內容,完成一次SISRFRET 成像需要采集結構光調制下的三通道27 張原始圖像組.其中一組典型的FERT 三通道原始數(shù)據(jù)采集時序如圖3 所示.采集過程首先由上位機發(fā)送指令給下位機,隨后下位機發(fā)出精確同步控制信號給SLM、激光器、機械轉盤以及兩臺sCMOS相機.對于單通道SISR-FRET,下位機發(fā)出同步信號給SLM 進行結構化圖案顯示,同時開啟激光器并打開相機曝光完成一次拍攝.在等待相機讀出以及SLM 暗圖像刷新的時間內,下位機發(fā)送觸發(fā)信號關閉激光器并使能機械轉盤完成FRET 通道切換,重復以上過程3次,即可完成一組FERT 原始數(shù)據(jù)采集并將數(shù)據(jù)傳輸給上位機.為了加快轉盤切換速度,單通道SISR-FRET 采用快速機械轉盤(FW103,Throlabs),該器件的最小通道的切換時間為50 ms.根據(jù)經驗設定相機典型單幀曝光時間為10 ms,圖像采集區(qū)域大小為512×512@16 bit,此時轉盤完成切換的時間制約了整個系統(tǒng)成像速度,該方案可實現(xiàn)的一組FERT 三通道原始數(shù)據(jù)采集時間為140 ms(圖3(a)).由于雙通道SISRFRET 將基于濾光片轉輪的時分FRET 三通道切換方案替換為基于二項色鏡分光的空分方案,期間無需轉動機械轉輪來切換不同波長的發(fā)射濾光片,此時制約成像系統(tǒng)進行下一組曝光的等待時間則由相機的讀出時間和SLM 的負圖像顯示時間來確定.另一方面,由采用雙通道方案,一次激發(fā)可以在兩個發(fā)射通道實現(xiàn)同時成像(DD&DA).相比傳統(tǒng)基于濾光片轉輪的時分FRET 三通道切換方案需要切換3 次才能完成圖像采集,雙通道FRET成像系統(tǒng)只需兩次成像即可完成,從而將相機曝光讀出時間占比進一步減少了1/3.在此方案下,雙通道方案在曝光時間相同的情況下完成一組FRET三通道原始數(shù)據(jù)采集時間為40 ms,相應系統(tǒng)時間分辨率從原來的約1 幀/s 提升為3 幀/s,實現(xiàn)了約3.5 倍的時間分辨率提升.

圖3 雙通道SISR-FRET 與單通道SISR-FRET 時序圖對比(a)單通道SISR-FRET 在一個FRET 采集周期的時序圖;(b)雙通道SISR-FRET 相同周期的時序圖Fig.3.Comparison of timing sequence of dual-channel SISR-FRET and single-channel SISR-FRET:(a) Timing sequence of singlechannel SISR-FRET in one FRET acquisition cycle;(b) timing sequence of dual-channel SISR-FRET in the same cycle.

3 成像結果與討論

為了驗證雙通道SISR-FRET 系統(tǒng)在活細胞中超分辨FRET 成像能力,使用表達靶向線粒體外膜的FRET 標準質粒(ActA-G17M) 的MCF-7 細胞樣本進行系統(tǒng)測試.ActA-G17M 融合了線粒體外膜靶向蛋白ActA 和FRET 標準質粒G17M,其中G17M 由GFP 和mCherry 之間連接17 個氨基酸構成.該質粒的理論FRET 表觀效率(ED)為0.2,受體與供體的濃度比(RC) 為1.

利用該樣本首先對系統(tǒng)雙相機超分辨成像結果的通道對準進行標定,結果如圖4 所示.圖4(a)為樣本在DD 和AA 通道超分辨成像的偽彩圖,圖4(b)為DD 和AA 通道超分辨成像只經過系統(tǒng)硬件進行通道對準時的疊加效果圖,可以明顯觀察到AA 通道對比DD 通道圖像像素的整體向下的錯位.經過雙通道SISR-FRET 圖像對準算法處理后,可計算得到最優(yōu)對準效果的仿射變換矩陣T為[1,0,-0.85],[0,1,-3.32],[0,0,1].此時經過仿射變換矩陣校正后的DD&AA 疊加效果圖如圖4(c) 所示,其相比于圖4(b) 對準效果明顯提升,在整個視野內DD&AA 通道線粒體外膜精細結構表現(xiàn)出很好的重合,證明了對準算法在進行亞像素精度對準的有效性以及SISR-FRET 成像系統(tǒng)的成像質量.

圖4 雙通道SISR-FRET 通道對準效果(a) DD 通道和AA通道成像結果的偽彩圖,綠色為DD 通道,紅色為AA 通道;(b)未經過算法對準的DD 通道和AA 通道成像結果疊加圖;(c)經過仿射變換矩陣對準的DD 通道和AA 通道成像結果疊加圖.比例尺:2 μmFig.4.Dual-channel SISR-FRET alignment results:(a) Pseudo-color image of DD channel and AA channel imaging results,green is DD channel,red is AA channel;(b) overlay of the imaging results of DD channel and AA channel without algorithm alignment;(c) overlay of DD channel and AA channel imaging results after affine transformation matrix alignment.Scale bar:2 μm.

為了測試雙通道SISR-FRET 系統(tǒng)的超分辨成像能力,對表達ActA-G17M 質粒的MCF7 細胞進行了定量超分辨FRET 成像.為獲得采樣速度和收集光子計數(shù)之間的最佳平衡,單幀圖像的曝光時間設置為10 ms,相應總的雙通道SISR-FRET測量時間分辨率約360 ms.在此參數(shù)設置下,三通道超分辨圖像重建結果如圖5 所示.圖5(a)—(c)分別為DD,DA,AA 通道對ActA-G17 M 寬場成像結果,圖5(d)—(f) 分別為DD,DA,AA 通道對ActA-G17M 超分辨成像結果.一些在寬場成像中無法區(qū)分的相鄰線粒體外膜精細結構在超分辨圖像得到清晰解析.證明當前系統(tǒng)進行FRET 三通道超分辨成像時分辨率提升的有效性.

圖5 雙通道SISR-FRET 成像系統(tǒng)對ActA-G17 M 樣本成像結果(a)—(c) DD,DA,AA 通道寬場成像結果;(d)—(f) DD,DA,AA 通道超分辨成像結果.比例尺:2 μmFig.5.Imagingresultsofthedual-channelSISR-FRETimaging systemfor the ActA-G17Msample:(a)-(c)Wide-fieldimagingresults intheDD,DA,andAAchannels;(d)-(f)super-resolution imagingresults in theDD,DA,and AAchannels.Scalebar:2μm.

為了測試雙通道SISR-FRET 系統(tǒng)的超分辨定量FRET 分析能力,對圖5 中三通道超分辨FRET圖像進一步進行定量FRET 分析,結果如圖6 所示.圖6(a) 和圖6(c) 分別展示了寬場FRET 和超分辨FRET 效率ED和受供體濃度比RC的空間分布,可以清晰看到雙通道SISR-FRET 重建算法對FRET 空間分辨能力的提升.另一方面圖6(b),(d)分別展示了寬場FRET 和超分辨FRET 效率ED和受供體濃度比RC的逐像素統(tǒng)計結果,可以看出SISR-FRET 和寬場FRET 一樣可以正確解析ActA-G17 M 質粒的ED和RC,但是由于SISRFRET 組DA 通道的信噪比較低,最終導致SISRFRET 統(tǒng)計直方圖的半高全寬相比傳統(tǒng)寬場FRET 結果得到了展寬.

圖6 雙通道SISR-FRET 成像定量FRET 分析結果對比(a)寬場FRET 和超分辨FRET 效率ED 的偽彩圖;(b)圖(a)中結果的統(tǒng)計直方圖;(c)寬場FRET 和超分辨FRET 受供體濃度比 RC 的偽彩圖;(d) 圖(c)中結果的統(tǒng)計直方圖.比例尺:2 μmFig.6.Comparison of quantitative FRET analysis results from dual-channel SISR-FRET imaging:(a) Pseudo-color map of ED for wide-field FRET and super-resolution FRET;(b) corresponding statistical histograms;(c) pseudo-color plot of RC for wide-field FRET and super-resolution FRET;(d) corresponding statistical histograms.Scale bars:2 μm.

為了定量比較雙通道SISR-FRET 成像分辨率對比寬場FRET 的提升,現(xiàn)將圖5 和圖6 結果進行了重疊比較,結果如圖7(a),(b) 所示,線粒體外膜的結構分布和經過共定位掩膜濾波的FRET效率空間分布有著良好的重合,證明SISR-FRET具備在活細胞中定量解析精細結構上FRET 信號的能力.其中圖7(a),(b) 局部放大的線粒體外膜結構FRET 信號在寬場FRET 成像下無法分辨,而在SISR-FRET 成像下可以清晰區(qū)分(圖7(c)—(f)).

4 結論

本文提出和搭建了一套雙通道結構光照明超分辨定量FRET 成像系統(tǒng).該系統(tǒng)實現(xiàn)了SISRFRET 激發(fā)發(fā)射通道的空分切換以及通道復用,提升了約3.5 倍的時間分辨率.相比傳統(tǒng)的寬場FRET 技術,雙通道SISR-FRET 具有更高的時空分辨率,能夠更準確地定位和解析供受體之間的FRET 信號,從而提高解析活細胞內精細結構上分子互作的能力.通過將雙通道SISR-FRET 技術應用于亞細胞器尺度的蛋白相互作用過程的精確定量檢測中,可以直觀地展示亞細胞器的空間結構變化以及蛋白的定位關系.這對于揭示活細胞中細胞核、線粒體和內質網等生物大分子生成和執(zhí)行功能的場所精細結構上的分子結構及其功能具有重要意義.通過這項技術,能更深入地了解細胞內復雜的分子動態(tài)過程,為研究生物體的功能和機制提供有力的工具.