肉豆蔻化學(xué)成分及抗炎活性研究

肖雯雯，萬仁山，張紅林，曾天艷，白夢微，李大山，邵立東

（云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500）

肉豆蔻為肉豆蔻科（Myristicaceae） 肉豆蔻屬（Myristica）植物肉豆蔻（Myristica fragrans Houtt.）的干燥種仁，又名豆蔻、玉果、肉果等，為肉豆蔻科喬本植物，主要分布于巴西、馬來西亞、印度、印度尼西亞及西印度群島等熱帶地區(qū)，我國臺灣、廣西、海南、廣東、云南等地亦有引種栽培[1]。肉豆蔻為傳統(tǒng)中藥材，歷版《中國藥典》均有記載，其性溫，味辛，歸脾、胃、大腸經(jīng)，具有溫中行氣、澀腸止瀉等功效，用于治療脾胃虛寒，久瀉不止，脘腹脹痛，食少嘔吐等癥[2]。化學(xué)成分研究表明，肉豆蔻主要含有揮發(fā)油、苯丙素類、木脂素類、二芳基烷烴類、黃酮類等多種化學(xué)成分[3-10]?，F(xiàn)代藥理活性研究表明，肉豆蔻具有抗炎鎮(zhèn)痛[11-13]、抗氧化[4，13]、抗菌[14]、抗腫瘤[8]、降血糖[6，15]等多方面藥理活性。為深入開展對肉豆蔻化學(xué)成分的分離鑒定、藥理活性篩選研究，以期為肉豆蔻的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)對肉豆蔻的石油醚與乙酸乙酯部位進(jìn)行化學(xué)成分研究，從中分離得到15 個化合物，分別鑒定為化合物1：2-（4-烯丙基-2，6-二甲氧基苯氧基）-1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）丙烷[2-（4-allyl-2，6-dimethoxyphenoxy）-1-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）propane]、化合物2：肉豆蔻異木脂素（iso-lignan）、化合物3：4-（2-（4-烯丙基-2，6-二甲氧基苯氧基）-1-羥丙基）-2，6-二甲氧基苯酚[4-（2-（4-allyl-2，6-dimethoxyphenoxy）-1-hydroxypropyl）-2，6-dimethoxyphenol]、化合物4：（E）-4-（1-羥基-2-（2-甲氧基-4-（丙烯基）苯氧基）丙基）-2-甲氧基苯酚[（E）-4-（1-hydroxy-2-（2-methoxy-4-（propenyl）phenoxy）propyl）-2-methoxyphenol]、化合物5：（-）-miliusfragrin、化合物6：去氫二異丁香酚（dehydrodiisoeugenol）、化合物7：反式-2，3-二氫-7-甲氧基-2-（3，4-二甲氧基苯基）-3-甲基-5-（1-（E）-丙烯基）苯并呋喃 [trans-2，3-dihydro-7-methoxy-2-（3，4-dimethoxyphenyl）-3-methyl-5-（1-（E）-propenyl）benzofuran]、化合物8：（-）-eusiderin A、化合物9：acetyl oleiferin C、化合物10：補(bǔ)骨脂酚（psoralen）、化合物11：3-（4-羥基-3-甲氧苯基）丙烷-1，2-二醇[3-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）propane-1，2-diol]、化合物12：1-（3，4-二甲氧基苯基）丙烷-2-酮[1-（3，4-dimethoxyphenyl）propan-2-one]、化合物13：broussochalcone B、化合物14：bavachinin、化合物15：malabaricone C。化合物5，8～14 為首次從該屬植物中分離得到。通過LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7 巨噬細(xì)胞NO 釋放抗炎模型，對所得化合物進(jìn)行體外抗炎活性研究，結(jié)果表明，化合物13 和15 對LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞NO 釋放有較強(qiáng)抑制活性，其IC50分別為8.57 ± 0.11 和（12.01 ± 1.27）μmol·L-1?；衔? 和7 顯示一定抑制活性，其IC50分別為34.48 ± 3.05 和（42.76 ± 1.53）μmol·L-1。

圖1 化合物1～15 的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 Bruker AVANCE-III（500、600 MHz）型核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）；Agilent 6540 Q-TO 型質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司）；RPC18半制備色譜柱（10 mm × 250 mm，5 μm，美國Agilent 公司）；色譜硅膠（200～300 目，青島海洋化工廠）；GF254 薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠）；LH-20 羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20，美國Pharmacia 公司）；反相中壓和常壓材料（ODS，德國Merck 公司）；薄層色譜顯色劑（10% 硫酸乙醇溶液）；石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等試劑為重蒸的工業(yè)或化學(xué)純?nèi)軇?；色譜甲醇（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?/p>

藥材樣品采購于昆明市螺螄灣藥材市場，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)董發(fā)武副教授鑒定為肉豆蔻（Myristica fragrans Houtt.）的種仁，憑證標(biāo)本（YNYZ20190503）現(xiàn)存于云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)室。

1.2 提取與分離 粉碎過后的肉豆蔻種仁20 kg，先用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油大約150 mL，剩余的藥渣用70%的乙醇浸泡提取2 次，每次48 h，將兩次的提取液進(jìn)行合并，減壓回收至無醇味，剩余的水相分別使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取。分別合并3 部位的萃取液，減壓濃縮后分別得到石油醚部位萃取物790 g，乙酸乙酯部位萃取物240 g，正丁醇部位萃取物220 g。

將石油醚部位萃取物（790 g） 過中壓反相，以（70%、80%、95%和100%）甲醇-水梯度洗脫，得到9 個流分段（Fr.1～Fr.9）。Fr.3（48.6 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯（100 ∶1～1 ∶1）梯度洗脫，得到6 個流分段（Fr.3.1～Fr.3.6）。Fr.3.6（690.3 mg）經(jīng)反復(fù)的制備薄層、半制備液相得到化合物1（8.3 mg）、2（9.7 mg）、3（6.1 mg）、4（6.9 mg）。Fr.4（56 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯（100 ∶1～1 ∶1）梯度洗脫，得到6 個流分段（Fr.4.1～Fr.4.6）。Fr.4.4（2.8 g）經(jīng)Sephadex LH-20 色譜，氯仿-甲醇（3 ∶2），反復(fù)制備薄層，得到化合物5（9 mg）。Fr.5（20.2 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯（30 ∶1 ∶1～1 ∶1 ∶1）梯度洗脫，得到7 個流分段（Fr.5.1 ～ Fr.5.7）。Fr.5.4（861.6 mg）經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠色譜，氯仿-甲醇（3 ∶2），制備薄層得到化合物6 （18.2 mg）、7（10.6 mg）。Fr.5.6（1.8 g）經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠色譜，氯仿-甲醇（3 ∶2）、制備薄層得到化合物8（5.7 mg）。Fr.6（52.2 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯（40 ∶1～1 ∶1）梯度洗脫，得到7 個流分段（Fr.6.1～Fr.6.7）。Fr.6.4（2 g）經(jīng)Sephadex LH-20 色譜、硅膠柱色譜、反復(fù)制備薄層得到化合物9（8 mg）、10（27.7 mg）。

將乙酸乙酯部位（240 g）過中壓反相，以（20%～100%）甲醇-水梯度洗脫，得到12 個流分段（Fr.1～Fr.12）。Fr.2（2.2 g）經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠色譜，氯仿-甲醇（3：2），得到6 個流分段（Fr.2.1～Fr.2.6）。Fr.2.1（161.6 mg）經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-二氯甲烷-丙酮（2 ∶1 ∶1） 為洗脫劑得到化合物11 （37.3 mg）。Fr.4（10.8 g）經(jīng)Sephadex LH-20 色譜，氯仿-甲醇（3 ∶2），得到3 個流分段（Fr.4.1～Fr.4.3）。Fr.4.1（2.4 g）經(jīng)反相柱色譜、Sephadex LH-20 凝膠色譜，氯仿-甲醇（3 ∶2）、硅膠柱色譜得到化合物12（10.1 mg）。Fr.10（19 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯（50 ∶1 ∶1～1 ∶1 ∶1） 梯度洗脫，得到7 個流分段（Fr.10.1～Fr.10.7）。Fr.10.6（552.5 mg）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠色譜，氯仿-甲醇（3 ∶2）、制備薄層得到化合物13（10.1 mg）、14（10 mg）。Fr.10.7（3.2 g）經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠色譜，氯仿-甲醇（3 ∶2）、制備薄層得到化合物15（85 mg）。

1.3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色油狀物，ESI-MS m/z：381.1672[M+Na]+，分子式為C21H26O5。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：6.81（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.76（1H，d，J=1.7 Hz，H-2），6.69 （1H，dd，J=8.0 Hz，1.7 Hz，H-6），6.40（2H，s，H-3’，H-5’），5.93～6.01 （1H，m，H-8’），5.47（1H，s，4-OH），5.08～5.13 （2H，m，H-9’），4.29～4.35（1H，m，H-8），3.86（3H，s，3-OCH3），3.79（6H，s，2’-OCH3，6’-OCH3），3.34 （2H，d，J=6.7 Hz，H-7’），3.12（1H，dd，J=13.5，5.1 Hz，H-7b），2.72 （1H，dd，J=13.5 Hz，8.3 Hz，H-7a），1.19 （3H，d，J =6.2 Hz，H-9）；13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ：153.6（C-2’，C-6’），146.1（C-3），143.8 （C-4），137.3 （C-8’），135.5 （C-1’），134.3（C-1），131.0（C-4’），122.1（C-6），116.0（C-9’），113.9（C-5），112.2（C-2），105.5（C-3’，C-5’），80.2（C-8），56.0（OCH3），55.9（OCH3），42.9（C-7），40.6（C-7’），19.6（C-9）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[16]，故鑒定化合物1 為2-（4-烯丙基-2，6-二甲氧基苯氧基）-1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）丙烷。

化合物2：無色油狀物，ESI-MS m/z：397.1622[M+Na]+，分子式為C21H26O6。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：6.88 （1H，s，H-4），6.84 （2H，s，H-2，H-6），6.44 （2H，s，H-3’，H-5’），5.97 （1H，m，H-8’），5.60（1H，s，5-OH），5.09-5.14（2H，m，H-9’），4.94（1H，s，7-OH），4.61（1H，d，J=8.6 Hz，H-7），3.92（1H，dq，J=8.5 Hz，6.3 Hz，H-8），3.87（3H，s，3-OCH3），3.86（6H，s，2’-OCH3，6’-OCH3），3.35（2H，d，J=6.7 Hz，H-7’），1.18（3H，d，J=6.3 Hz，H-9）；13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ：152.8（C-2’，C-6’），146.6（C-3），145.4（C-5），137.2（C-8’），136.0（C-4’），135.4（C-1），132.9（C-1’），120.8（C-6），116.3（C-9’），114.1（C-4），109.6（C-2），105.6（C-3’，C-5’），86.8（C-7），79.2（C-8），56.1 （2’-OCH3，6’-OCH3），56.1 （3-OCH3），40.7（C-7’），17.7（C-9）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[17]，故鑒定化合物2 為肉豆蔻異木脂素。

化合物3：無色油狀物，ESI-MS m/z：427.1723[M+Na]+，分子式為C22H28O7。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：6.55（2H，s，H-2，H-6），6.46（2H，s，H-3’，H-5’），5.94～6.02 （1H，m，H-8’），5.43 （1H，s，7-OH），5.11～5.15 （2H，m，H-9’），4.78 （1H，d，J=2.7 Hz，H-7），4.31 （1H，dq，J=2.9 Hz，6.4 Hz，H-8），3.87（12H，s，OCH3× 4），3.37（2H，d，J=6.7 Hz，H-7’），1.11（3H，d，J=6.4 Hz，H-9）；13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ：153.7（C-2’，C-6’），147.0（C-3，C-5），137.2（C-8’），136.3（C-1’），133.7（C-1），133.2（C-4），131.3（C-4’），116.4（C-9’），105.7（C-3’，C-5’），102.9（C-2，C-6），82.5（C-7），73.2（C-8），56.5（OCH3× 2），56.3（OCH3×2），40.7（C-7’），12.9（C-9）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[16]，故鑒定化合物3 為4-（2-（4-烯丙基-2，6-二甲氧基苯氧基）-1-羥丙基）-2，6-二甲氧基苯酚。

化合物4：黃色油狀物，ESI-MS m/z：367.1519[M+Na]+，分子式為C20H24O5。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：6.74～6.98（6H，m，Ar-H），6.36（1H，dd，J=15.7 Hz，1.5 Hz，H-7’），6.12 ～6.19 （1H，m，H-8’），5.57（1H，s，7-OH），4.82 （1H，d，J =2.9 Hz，H-7），4.33（1H，dq，J=3.1 Hz，6.4 Hz，H-8），3.89 （6H，s，OCH3×2），3.53 （1H，s，4-OH），1.88 （3H，dd，J =6.6 Hz，1.6 Hz，H-9’），1.17（3H，d，J=6.4 Hz，H-9）；13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ：151.7（C-6’），146.8（C-3），145.8（C-1’），144.9（C-4），133.9（C-4’），132.0（C-1），130.6（C-7’），125.2（C-8’），120.1（C-6），119.3（C-3’），119.2（C-2’），114.1（C-5），109.5（C-5’），109.0（C-2），82.7（C-7），73.7（C-8），56.1（OCH3），56.0（OCH3），18.5（C-9’），13.5（C-9）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[18]，故鑒定化合物4 為（E）-4-（1-羥基-2-（2-甲氧基-4-（丙烯基）苯氧基）丙基）-2-甲氧基苯酚。

化合物5：無色油狀物，ESI-MS m/z：343.1550[M +H]+，分子式為C20H22O5。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：6.94（1H，d，J=8.0 Hz，H-3），6.87（1H，dd，J =8.9，0.8 Hz，H-2），6.85 （1H，s，H-6），6.47 （1H，d，J=1.3 Hz，H-2’），6.37（1H，d，J=1.5 Hz，H-6’），5.95（1H，ddt，J =16.8 Hz，10.0 Hz，6.8Hz，H-8’），5.69（1H，s，4-OH），5.05-5.11（2H，m，H-9’），4.57（1H，d，J=7.9 Hz，H-7），4.06-4.12（1H，m，H-8），3.91（3H，s，5’-OCH3），3.89（3H，s，3’-OCH3），3.29（2H，d，J =6.7 Hz，H-7’），1.24（3H，d，J=6.4 Hz，H-9）；13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ：148.7（C-5’），147.0（C-5），146.4（C-4），144.6（C-3’），137.5（C-8’），132.5（C-1’），131.5（C-4’），129.1（C-1），121.2（C-2），115.9（C-9’），114.6（C-3），109.8（C-6），109.6（C-2’），104.7（C-6’），81.0（C-7），74.4（C-8），56.3（3-OCH3），56.2（5-OCH3），40.2（C-7’），17.4（C-9）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[19]，故鑒定化合物5 為（-）-miliusfragrin。

化合物6：白色固體，ESI-MS m/z：349.1410 [M+Na]+，分子式為C20H22O4。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：6.98 （1H，s，H-2’），6.90 （2H，s，H-5 ’，H-6’），6.79（1H，s，H-4），6.77 （1H，s，H-6），6.37 （1H，dd，J =15.7，1.5 Hz，H-8），6.08 ～6.15 （1H，m，H-9），5.67（1H，s，4’-OH），5.10 （1H，d，J =9.5 Hz，H-2），3.90（3H，s，OCH3），3.88（3H，s，OCH3），3.42 ～3.48（1H，m，H-3），1.87（3H，dd，J=6.6，1.5 Hz，10-CH3），1.38（3H，d，J =6.8 Hz，3-CH3）；13C NMR （CDCl3，125 MHz）δ：146.8（C-3’），146.6（C-7a），145.9（C-4’），144.2（C-7），133.4（C-3a），132.3（C-5），132.2（C-1’），131.0（C-8），123.6（C-9），120.1（C-6’），114.2（C-5’），113.4（C-4），109.2（C-6），109.0（C-2’），93.9（C-2），56.1（OCH3），56.0（OCH3），45.7（C-3），18.5（10-CH3），17.6（3-CH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[20]，故鑒定化合物6 為去氫二異丁香酚。

化合物7：黃色油狀物，ESI-MS m/z：363.1567[M+Na]+，分子式為C21H24O4。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：6.98（1H，d，J=1.8 Hz，H-2’），6.95（1H，dd，J=8.2，1.9 Hz，H-6’），6.84（1H，d，J=8.2 Hz，H-5’），6.79（1H，s，H-6），6.77（1H，s，H-4），6.36（1H，dd，J =15.7，1.3 Hz，H-8），6.07～6.15（1H，m，H-9），5.12（1H，d，J=9.7 Hz，H-2），3.88（3H，s，OCH3），3.87（3H，s，OCH3），3.85 （3H，s，OCH3），3.43-3.50 （1H，m，H-3），1.87（3H，d，J=5.7 Hz，10-CH3），1.38（3H，d，J=6.8 Hz，3-CH3）；13C NMR （CDCl3，125 MHz）δ：149.2 （C-3’，C-4’），146.7（C-7a），144.3（C-7），133.4（C-3a），132.7（C-1’），132.3（C-5），131.0（C-8），123.7（C-9），119.4（C-6’），113.4（C-6），110.8（C-5’），109.6（C-4），109.3（C-2’），93.8（C-2），56.0（OCH3× 3），45.7（C-3），18.5（10-CH3），17.6（3-CH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[21]，故鑒定化合物7 為反式-2，3-二氫-7-甲氧基-2-（3，4-二甲氧基苯基）-3-甲基-5-（1-（E）-丙烯基）苯并呋喃。

化合物8：無色油狀物，ESI-MS m/z：409.1623[M+Na]+，分子式為C22H26O6。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：6.57（2H，s，H-2，H-6），6.49（1H，d，J=1.1 Hz，H-2’），6.38（1H，d，J=1.3 Hz，H-6’），5.91～5.98（1H，m，H-8’），5.05～5.11 （2H，m，H-9’），4.56 （1H，d，J=7.9 Hz，H-7），4.07 ～4.12 （1H，m，H-8），3.89（3H，s，OCH3），3.88（6H，s，2’-OCH3，6’-OCH3），3.86（3H，s，OCH3），3.30（2H，d，J =6.7 Hz，H-7’），1.26（3H，d，J =6.4 Hz，H-9）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）δ：153.6（C-3，C-5），148.7（C-5’），144.4（C-3’），138.4（C-4），137.4（C-8’），132.6（C-1，C-1’），131.3（C-4’），116.0（C-9’），109.7（C-2’），104.7（C-6’），104.4（C-2，C-6），81.1 （C-7），74.2 （C-8），61.0 （OCH3× 2），56.3（OCH3× 2），40.2（C-7’），17.5（C-9）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[22]，故鑒定化合物8 為（-）-eusiderin A。

化合物9：無色油狀物，ESI-MS m/z：385.1656[M+H]+，分子式為C22H24O6。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：6.44-6.73（6H，m，Ar-H），5.95（2H，s，-OCH2O-），5.92（2H，s，-OCH2O-），5.51（1H，d，J=9.7 Hz，H-7），2.39（2H，dd，J=7.7，3.5 Hz，H-7’），2.00（3H，s，OAc），1.89～1.93 （1H，m，H-8），1.51-1.57 （2H，m，H-8’），0.92（3H，d，J=6.8 Hz，H-9），0.78（3H，d，J=6.8 Hz，H-9’）；13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ：170.5（C=O），147.8（C-3），147.6（C-3’），147.3（C-4），145.7（C-4’），134.7（C-1’），133.7（C-1），121.9（C-6’），121.4（C-6），109.4（C-5’），108.1（C-5，C-2’），107.7（C-2），101.2（-OCH2O-），100.9（-OCH2O-），79.4（C-7），41.5（C-7’），39.9 （C-8），34.8 （C-8’），21.4（OCH3），14.0（C-9’），9.9（C-9）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[23]，故鑒定化合物9 為acetyl oleiferin C。

化合物10：無色油狀物，ESI-MS m/z：255.1747[M －H]-，分子式為C18H24O。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.27 （2H，d，J=8.6 Hz，H-2，H-6），6.79（2H，d，J=8.5 Hz，H-3，H-5），6.28 （1H，d，J=16.2 Hz，H-7），6.08 （1H，d，J =16.2 Hz，H-8），5.91 （1H，dd，J =17.5，10.7 Hz，H-17），5.12～5.15（1H，m，H-12），5.02～5.07（2H，m，H-18），4.95（1H，s，4-OH），1.98（2H，dd，J =16.4，7.5 Hz，H-11），1.70 （3H，s，15-CH3），1.62（3H，s，14-CH3），1.50～1.54（2H，m，H-10），1.22（3H，s，16-CH3）；13C NMR （CDCl3，125 MHz）δ：154.8 （C-4），146.1（C-17），136.0（C-8），131.4（C-13），131.1（C-1），127.5（C-2，C-6），126.6（C-7），125.0（C-12），115.5（C-3，C-5），112.0（C-18），42.7（C-9），41.4（C-10），25.8（15-CH3），23.5（16-CH3），23.4（C-11），17.8（14-CH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[24]，故鑒定化合物10 為補(bǔ)骨脂酚。

化合物11：無色油狀物，ESI-MS m/z：197.0809[M－H]-，分子式為C10H14O4。1H-NMR（（CD3）2CO，600 MHz）δ：7.33 （1H，s，4’-OH），6.86 （1H，d，J=1.8 Hz，H-2’），6.72（1H，d，J=8.0 Hz，H-5’），6.67（1H，dd，J=8.0，1.9 Hz，H-6’），3.81（3H，s，OCH3），3.75～3.79（1H，m，H-2），3.48～3.50（1H，m，H-1b），3.39～3.43（1H，m，H-1a），2.72（1H，dd，J=13.7，5.6 Hz，H-3b），2.60（1H，dd，J =13.7，7.3 Hz，H-3a）；13C NMR（（CD3）2CO，150 MHz）δ：148.1（C-3’），145.7（C-4’），131.4（C-1’），122.7（C-6’），115.5（C-5’），113.9（C-2’），74.1（C-2），66.5（C-1），56.2（3-OCH3），40.4（C-3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[25]，故鑒定化合物11 為3-（4-羥基-3-甲氧苯基）丙烷-1，2-二醇。

化合物12：黃色油狀物，ESI-MS m/z：195.1009[M +H]+，分子式為C11H14O3。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：6.83（1H，d，J=8.1 Hz，H-5’），6.75（1H，dd，J=8.1，1.7 Hz，H-6’），6.70（1H，d，J=1.7 Hz，H-2’），3.86（6H，s，OCH3），3.62（2H，s，H-1），2.14（3H，s，3-CH3）；13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ：206.9（C-2），149.3（C-3’），148.3（C-4’），126.9（C-1’），121.7（C-2’），112.6（C-5），111.6（C-6’），56.0（OCH3），56.0（OCH3），50.7（C-1），29.2（C-3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[26]，故鑒定化合物12 為1-（3，4-二甲氧基苯基）丙烷-2-酮。

化合物13：黃色固體，ESI-MS m/z：325.1434 [M+H]+，分子式為C20H20O4。1H-NMR（（CD3）2CO，500 MHz）δ：13.50 （1H，s，2’-OH），7.95 （1H，s，H-6’），7.82（1H，d，J=15.4 Hz，H-8），7.73（1H，d，J=15.4 Hz，H-7），7.70（2H，d，J=8.6 Hz，H-2，H-6），6.93（2H，d，J=8.6 Hz，H-3，H-5），6.41 （1H，s，H-3’），5.34（1H，dddt，J=8.5，5.6，2.8，1.3 Hz，H-8’），3.30（2H，d，J=7.1 Hz，H-7’），1.73（3H，s，H-11’），1.72（3H，s，H-10’）；13C NMR（（CD3）2CO，125 MHz）δ：191.8（C =O），165.0（C-4’），162.5（C-2’），160.1（C-4），143.9（C-8），131.5（C-9’），131.3（C-6’），130.7（C-2，C-6），126.7（C-1），123.0（C-8’），120.4（C-5’），117.5（C-7），115.9 （C-3，C-5），113.4（C-1’），102.6 （C-3’），27.9（C-7’），24.9（C-10’），17.0（C-11’）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[27]，故鑒定化合物13 為broussochalcone B。

化合物14：黃色油狀物，ESI-MS m/z：361.1407[M+Na]+，分子式為C21H22O4。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.68（1H，s，H-5），7.34（2H，d，J=8.5 Hz，H-2’，H-6’），6.90（2H，d，J=8.6 Hz，H-3’，H-5’），6.44（1H，s，H-8），5.88 （1H，s，4’-OH），5.38 （1H，dd，J=13.4，2.8 Hz，H-2），5.27（1H，t，J=8.0 Hz，H-2”），3.84（3H，s，7-OCH3），3.24 （2H，d，J=7.3 Hz，H-1”），3.04（1H，dd，J=16.9，13.4 Hz，H-3b），2.78 （1H，dd，J=16.9，2.9 Hz，H-3a），1.73（3H，s，H-4”），1.69（3H，s，H-5”）；13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ：191.6（C-4），164.4（C-7），162.6（C-9），156.5（C-4’），133.2（C-3”），131.0（C-1’），128.1（C-2’，C-6’），127.2（C-5），125.1（C-6），121.8（C-2”），115.8（C-3’，C-5’），114.0（C-10），99.0（C-8），79.9（C-2），55.9（7-OCH3），44.2（C-3），27.9（C-1”），26.0（C-4”），17.9（C-5”）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[28]，故鑒定化合物14 為bavachinin。

化合物15：黃綠色油狀物，ESI-MS m/z：359.1852[M+H]+，分子式為C21H26O5。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.20（1H，t，J=8.2 Hz，H-19），6.67（1H，d，J=8.0 Hz，H-14），6.61（1H，d，J=1.4 Hz，H-11），6.49（1H，dd，J=8.0，1.5 Hz，H-15），6.35（2H，d，J=8.2 Hz，H-18，H-20），3.12（2H，t，J=7.4 Hz，H-2），2.45（2H，t，J=7.6 Hz，H-9），1.65～1.71 （2H，m，CH2-3），1.54～1.59（2H，m，CH2-8），1.29～1.38（8H，m，CH2-4，5，6，7）；13C NMR（CD3OD，125 MHz）δ：209.7（C-1），163.4（C-17，C-21），146.0（C-12），144.0（C-13），136.8（C-19），135.8（C-10），120.6（C-15），116.5（C-11），116.2（C-14），111.4（C-16），108.3（C-18，C-20），45.7（C-2），36.3（C-9），32.9（C-8），30.6（C-5，C-6），30.5（C-4），30.3（C-7），25.8（C-3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[29]，故鑒定化合物15 為malabaricone C。

1.4 抗炎活性實(shí)驗(yàn) 采用MTT 法檢測化合物對細(xì)胞活力影響，將RAW 264.7 細(xì)胞按密度為4 × 104/孔接種于96 孔板，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入含不同濃度的化合物繼續(xù)培養(yǎng)24 h。設(shè)置正常對照組和空白對照組，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)3.5 h 后，吸去板內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min 使其混勻，多功能讀扳機(jī)490 nm 處測量吸光度值[30]。

采用Griess 法進(jìn)行體外抑制一氧化氮作用篩選，取生長狀態(tài)良好的RAW 264.7 細(xì)胞，按密度為4 ×104/孔接種于96 孔板，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，設(shè)置對照組、模型組和給藥組并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集上清后加入Griess 試劑，多功能讀扳機(jī)540 nm 處測量吸光度值[31]。

活性篩選結(jié)果見表1。

表1 分離化合物對LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞NO 生成抑制活性（±s，n=3）

表1 分離化合物對LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞NO 生成抑制活性（±s，n=3）

注：a 化合物2～6、8～12、14 未顯示抑制活性；b 單位為μg/mL

化合物a IC50 /(μmol·L-1) CC50 / (μmol·L-1)石油醚部位萃取物b 61.08±5.76 >100乙酸乙酯部位萃取物b 22.53±2.84 >100揮發(fā)油b >100 >100 34.48±3.05 >100 7 42.76±1.53 >100 13 8.57±0.11 69.633±12.03 15 12.01±1.27 25.53±3.47 L-NMMAb 11.18±0.46 >100 1

1.5 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)利用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）統(tǒng)計，統(tǒng)計結(jié)果P<0.05，P<0.01，P<0.001 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

本研究綜合運(yùn)用硅膠柱色譜、薄層制備、中壓及常壓反相ODS 柱色譜、Sephadex LH-20 凝膠柱色譜、半制備HPLC 等多種分離純化技術(shù)，結(jié)合核磁共振、質(zhì)譜等波譜鑒定技術(shù)對肉豆蔻的化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離鑒定了15 個化合物?；衔?～9 為木脂素類化合物，化合物1～4 為8-O-4’型木脂素，化合物6～7 為苯并呋喃型木脂素，是肉豆蔻中的主要成分類型；化合物5 和8 為二氧六環(huán)型木脂素，首次從該屬植物中報道；化合物9 為二芐基丁烷型木脂素，首次從該屬植物中分離得到；化合物10 為異戊二烯基酚萜類化合物，首次從該屬植物中分離得到；化合物11～12 為簡單苯丙素，首次從該屬植物中分離得到；化合物13～14 為黃酮類化合物，首次從該屬植物中分離得到；化合物15 為二芳基烷烴類化合物。該研究結(jié)果進(jìn)一步揭示肉豆蔻的化學(xué)成分，為活性研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

抗炎活性結(jié)果表明，化合物13 和15 對LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞NO 釋放有較強(qiáng)抑制活性，其IC50分別為（8.57 ± 0.11）和（12.01 ± 1.27）μmol·L-1。化合物1 和7 顯示一定抑制活性，其IC50分別為（34.48 ±3.05）和（42.76 ± 1.53）μmol·L-1。以上結(jié)果豐富了肉豆蔻的抗炎活性，為進(jìn)一步開發(fā)利用肉豆蔻的藥用價值和開展后續(xù)研究提供了參考。