陳壽輝,吳 俐,孫鈞政,肖志勇,李怡彬*
[1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 福建 福州 350003; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶特色果蔬菌加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 福州 350003; 3.國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心,福建 福州 350003; 4.福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 福州 350003;5.福建拓天生物科技有限公司, 福建 福州 350003]
猴頭菇Hericiumerinaceus(Bull.)Pers.,為齒菌科,屬真菌,在自然界中分布廣泛,既是食用珍品也是重要的藥用菌[1]。猴頭菇多糖具有增強(qiáng)免疫力[2]、抗氧化[3]、抗衰老[4]、降血糖[5]等多方面的功能,在醫(yī)藥保健行業(yè)[6]、食品加工行業(yè)等有著廣泛應(yīng)用,因此,如何高效制備猴頭菇多糖成了其商業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟。前人研究表明,超聲提取法、微波提取法與益生菌發(fā)酵法能顯著提高多糖提取率。張浩然等[7]利用超聲法提取猴頭菇多糖,能顯著提高多糖提取率;和法濤等[8]利用微波超聲波組合提取猴頭菇多糖,在最優(yōu)工藝條件下,多糖提取率為6.44%,顯著高于熱水浸提法;趙玉潔等[9]發(fā)現(xiàn)經(jīng)乳酸桿菌發(fā)酵后,顯著提高半枝蓮、甘草的多糖提取率;劉濤等[10]利用酵母菌發(fā)酵貓抓草,發(fā)現(xiàn)貓爪草多糖產(chǎn)量顯著提高;Pei等[11]利用益生菌發(fā)酵藍(lán)金銀花,使其多糖分子量降低,并表現(xiàn)出更強(qiáng)的ABTS自由基清除能力。猴頭菇具有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),制約著細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的多糖、蛋白質(zhì)、脂類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有效萃取和產(chǎn)品加工。因此,建立省時(shí)、節(jié)能、高效的猴頭菇細(xì)胞破壁技術(shù)是多糖等高值天然化合物萃取及其商業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。同時(shí),猴頭菇含有蛋白質(zhì)、脂肪、多糖及單糖等成分,去除猴頭菇中的脂肪和單糖等物質(zhì)是實(shí)現(xiàn)高效提取多糖的關(guān)鍵技術(shù)。本研究探討不同益生菌發(fā)酵處理猴頭菇對(duì)其粗多糖提取率的影響,采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化益生菌發(fā)酵工藝條件,獲得最佳發(fā)酵工藝,并考察益生菌發(fā)酵對(duì)猴頭菇粗多糖總抗氧化能力與紅外光譜結(jié)構(gòu)的影響,以期為高效制備猴頭菇多糖提供科學(xué)依據(jù)。
猴頭菇為市售優(yōu)質(zhì)猴頭菇,購(gòu)自福建省古田縣。
主要試劑:葡萄糖、苯酚、無(wú)水乙醇、溴化鉀、濃硫酸等,均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,嗜酸乳桿菌(1000 cfu·mg-1)、長(zhǎng)雙歧桿菌(1000 cfu·mg-1)購(gòu)自西安米先爾生物科技有限公司;酵母菌(高糖型)購(gòu)自安琪酵母股份有限公司;總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京萊寶科技有限公司。
主要儀器:熱泵烘干機(jī)組ZWH-KFX-BT12Ⅱ(福建雪豐制冷設(shè)備有限公司);高效粉碎機(jī)GFSJ-8(江陰市瑰寶制藥機(jī)械廠);微波光波超聲波萃取儀SCIENTZ-11DW(寧波新芝生物科技有限公司);高速離心機(jī)GL10MD(湘儀離心機(jī)公司);糖度計(jì)PAL-1(秋佐科技ATago愛拓有限公司);電子天平ME2002E/02[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];紫外可見光分光光度計(jì)TU-1810(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);傅里葉紅外光譜iCAN9(天津市能譜科技有限公司)。
1.3.1猴頭菇水提物與粗多糖提取工藝流程 猴頭菇水提物與粗多糖提取工藝流程見圖1。
圖1 猴頭菇水提物與粗多糖提取工藝流程
1.3.2猴頭菇預(yù)處理 將猴頭菇放入50℃熱泵干燥中烘干,用粉碎機(jī)粉碎后利用索氏提取法抽出猴頭菇粉末內(nèi)的油脂,烘干至恒重,備用。
1.3.3不同提取方式對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響 參考賈冬舒等[12]、樊偉偉等[13]的方法稍做修改,取預(yù)處理后的猴頭菇粉末與純凈水按1∶25的料液比混勻,分為無(wú)處理、超聲波處理、微波處理與超聲波-微波協(xié)同處理4組,設(shè)定超聲功率為400 w、時(shí)間10 min,微波功率90 w、時(shí)間30 s、提取4次,經(jīng)不同處理后采用熱水浸提法在90℃下浸提30 min,經(jīng)6000 r·min-1離心10 min,合并上清液,共提取1次,濃縮后部分冷凍干燥得到猴頭菇水提物,部分經(jīng)醇沉后冷凍干燥得到猴頭菇粗多糖。測(cè)定猴頭菇水提物與粗多糖提取率,并計(jì)算提取物中粗多糖含量,并挑選出最佳工藝。
1.3.4不同益生菌發(fā)酵對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響 分別稱取3 g預(yù)處理后的猴頭菇粉末按1∶25的料液比與純凈水混勻后,分為酵母菌(高糖型)發(fā)酵、長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵、嗜酸乳桿菌發(fā)酵與未加菌種4組,在對(duì)應(yīng)組加入0.3 g酵母菌(高糖型)、長(zhǎng)雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌,放入不同溫度搖床中震蕩并調(diào)試其pH值,其中,酵母菌(高糖型)發(fā)酵環(huán)境為pH 4.7、發(fā)酵溫度28℃;長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵環(huán)境為pH 6.7、發(fā)酵溫度39℃;嗜酸乳桿菌發(fā)酵環(huán)境為pH 5.8、發(fā)酵溫度37℃。搖床轉(zhuǎn)速為60 r·min-1,培養(yǎng)24 h后,取出在100℃下滅菌10 min后超聲波處理,超聲功率400 w、超聲時(shí)間10 min,超聲后其余步驟按1.3.3處理,研究不同益生菌對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響,并挑選出最佳益生菌。
1.3.5單因素試驗(yàn) (1)料液比對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。稱取3 g猴頭菇樣品粉末設(shè)定料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35,調(diào)節(jié)溶液pH為6.7,長(zhǎng)雙歧桿菌添加量為0.3 g,在溫度為39℃下,發(fā)酵16 h,其余步驟同1.3.4,研究料液比對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。(2)發(fā)酵時(shí)間對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。稱取3 g猴頭菇樣品粉末按1∶30的料液比與純凈水混勻,調(diào)節(jié)溶液pH為6.7,長(zhǎng)雙歧桿菌添加量為0.3 g,在溫度為39℃下,分別設(shè)定發(fā)酵時(shí)間為4、8、12、16 h,其余步驟同1.3.4,研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。(3)發(fā)酵溫度對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。分別稱取3 g猴頭菇樣品粉末按1∶30的料液比與純凈水混勻,調(diào)節(jié)溶液pH為6.7,長(zhǎng)雙歧桿菌添加量為0.3 g,分別設(shè)定培養(yǎng)溫度為36℃、39℃、42℃、45℃,發(fā)酵16 h,其余步驟同1.3.4,研究發(fā)酵溫度對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。(4)長(zhǎng)雙歧桿菌添加量對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取的影響。稱取3 g猴頭菇樣品粉末按1∶30的料液比與純凈水混勻,調(diào)節(jié)溶液pH至6.7,分別設(shè)定長(zhǎng)雙歧桿菌添加量為0.15、0.3、0.45、0.6 g,在溫度為39℃下,發(fā)酵16 h,其余步驟同1.3.4,研究長(zhǎng)雙歧桿菌添加量對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。
1.3.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)采用L9(33)正交設(shè)計(jì)(表1),根據(jù)前期單因素試驗(yàn)固定料液比為1∶20,確定單因素分別為長(zhǎng)雙歧桿菌添加量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度,且確定各因素的3個(gè)水平,分析各因素水平對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。
表1 猴頭菇粗多糖提取正交試驗(yàn)因素水平
1.3.7猴頭菇粗多糖總抗氧化能力 在前期研究中,發(fā)現(xiàn)不同提取方法與益生菌發(fā)酵后猴頭菇水提物提取率和水提物中粗多糖含量有著顯著的影響,總抗氧化能力(T-AOC)是體現(xiàn)人體抗氧化能力非常重要的指標(biāo),其可以很好地表示人體清除自由基的總能力,測(cè)定猴頭菇粗多糖的總抗氧化能力以佐證其具有較高的價(jià)值,旨為猴頭菇深加工與功能評(píng)價(jià)提供參考。
根據(jù)索萊寶總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行總抗氧化能力的測(cè)定,所得到的回歸方程為Y=0.3329x+0.0008,R2=0.9932,線性關(guān)系良好。
總抗氧化能力(μmol·g-1)= 34×x÷w
式中,x為Fe2+終濃度值,w為樣品質(zhì)量。
1.3.8猴頭菇粗多糖傅里葉紅外光譜分析 通過(guò)不同益生菌發(fā)酵猴頭菇粗多糖的總抗氧化能力的影響可知,不同益生菌發(fā)酵后其總抗氧化能力各不相同,為了解是否因菌種發(fā)酵導(dǎo)致其官能團(tuán)出現(xiàn)變化,采用傅里葉紅外光譜對(duì)其進(jìn)行分析。
取一定量不同處理的猴頭菇多糖與溴化鉀混合均勻后,在瑪瑙研缽中磨至成粉末,壓片,采用傅里葉紅外光譜在4000~400 cm-1范圍內(nèi)共掃描32次,分辨率為4 cm-1,以空氣作為空白背景。
1.4.1猴頭菇水提物提取率測(cè)定 將冷凍干燥后的猴頭菇水提物重量為m,計(jì)算猴頭菇水提物提取率。
水提物提取率(%)=m÷M×100
式中:m冷凍干燥后的猴頭菇水提物質(zhì)量,g;M為猴頭菇樣品質(zhì)量,g。
1.4.2猴頭菇水提物中粗多糖含量與粗多糖提取率的測(cè)定 參照SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定 苯酚-硫酸法》測(cè)定猴頭菇粗多糖含量。所得到的回歸方程為Y=0.0107X+0.0232,R2=0.9971,線性關(guān)系較好。
樣品的測(cè)定:取1 mg的猴頭菇水提物與猴頭菇粗多糖,用蒸餾水分別定容至10 mL,配置為100 ug·mL-1的猴頭菇水提物溶液與粗多糖溶液,如上方法測(cè)定吸光度值,參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品多糖含量,進(jìn)而計(jì)算猴頭菇粗多糖提取率:
水提物中粗多糖含量(%)=m1÷m2×V1×0.9×10-4×100%
猴頭菇粗多糖提取率(%)=m3÷m4×V2×0.9×10-4×100%
式中:m1為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得猴頭菇水提物溶液中含糖量,單位為ug;m2為猴頭菇水提物質(zhì)量,單位為g;V1為猴頭菇水提物溶液定容體積,單位為mL;m3為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得猴頭菇粗多糖溶液中含糖量,單位為ug;m4為猴頭菇樣品質(zhì)量,單位為g;V2為猴頭菇水提物溶液定容體積,單位為mL;0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。
采用Excel 2021 、SPSS Statistics 26對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖。
由圖2可知,與無(wú)處理組比較,微波處理組、超聲波處理組、超聲波-微波協(xié)同處理組猴頭菇水提物提取率與粗多糖含量顯著增加(P<0.05),超聲波處理組水提物提取率顯著高于其他處理,超聲波-微波協(xié)同處理組水提物中粗多糖含量最高,但與超聲波處理組無(wú)顯著差異。超聲波處理組猴頭菇粗多糖提取率達(dá)4.19%,與黃越等[14]用超聲波輔助提取法相比粗多糖提取率提高0.27%。因此后續(xù)試驗(yàn)選擇超聲輔助提取方法提取猴頭菇粗多糖。
注:不同字母表示差異顯著(P<0.05),下同。
由圖3可知,與未加菌種組相比較,嗜酸乳桿菌發(fā)酵組與酵母菌(高糖型)發(fā)酵組水提物提取率顯著減小(P<0.05),長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵組水提物提取率相較未加菌種組無(wú)顯著差異。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌與酵母菌(高糖型)發(fā)酵后,猴頭菇水提物中粗多糖含量與粗多糖提取率都顯著提高(P<0.05),其中粗多糖提取率分別提高5.31%、7.36%和3.15%。因此后續(xù)試驗(yàn)選擇長(zhǎng)雙歧桿菌來(lái)發(fā)酵猴頭菇。
由圖4可知,隨著料液比的增加,猴頭菇水提物與粗多糖提取率都隨之降低,料液比為1∶20時(shí)粗多糖提取率最高,達(dá)到9.43%,這可能是由于水增加導(dǎo)致溶液中長(zhǎng)雙歧桿菌濃度下降,發(fā)酵作用減小,溶出效率變慢。料液比為1∶25時(shí)溶液黏稠且猴頭菇粉末不易溶解易掛壁,結(jié)合水提物含量與水提物中多糖含量的結(jié)果可知1∶20的料液比最佳,得到的多糖含量最多。
圖4 料液比對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響
由圖5可知,隨著發(fā)酵時(shí)間增加,猴頭菇水提物提取率無(wú)顯著變化,而粗多糖含量與粗多糖提取率呈先上升后下降趨勢(shì),這可能因?yàn)殚L(zhǎng)雙歧桿菌在發(fā)酵前期主要消耗猴頭菇中的還原糖、蛋白質(zhì),隨著時(shí)間延長(zhǎng),長(zhǎng)雙歧桿菌開始分解猴頭菇多糖,導(dǎo)致水提物中粗多糖含量減少[15],在發(fā)酵8 h時(shí),猴頭菇粗多糖提取率達(dá)到最大值為13.55%。
圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響
由圖6可知,隨著發(fā)酵溫度的增加,猴頭菇水提物提取率的影響相對(duì)較小,且沒有顯著關(guān)系。而水提物中粗多糖含量與粗多糖提取率呈先升高后降低的趨勢(shì),當(dāng)發(fā)酵溫度為42℃時(shí),猴頭菇粗多糖溶出率最高,最高值為13.01%。溫度過(guò)低會(huì)使長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)緩慢,溫度過(guò)高會(huì)使長(zhǎng)雙歧桿菌活性降低,生長(zhǎng)代謝能力下降,適宜的溫度會(huì)使得菌種活性提高,溶液中脂肪、單糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗大,使得水提物中粗多糖含量增加[15]。
圖6 發(fā)酵溫度對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響
由圖7可知,在長(zhǎng)雙歧桿菌添加量5%~20%范圍內(nèi),隨著添加量增加,猴頭菇水提物提取率及其多糖含量都顯著提高,當(dāng)長(zhǎng)雙歧桿菌添加量為20%時(shí),猴頭菇粗多糖提取率達(dá)到14.56%。這可能是增加長(zhǎng)雙歧桿菌數(shù)量后,發(fā)酵作用強(qiáng)度增大,使猴頭菇的細(xì)胞壁酶解速度加快,粗多糖更易溶出[16],猴頭菇粗多糖提取率增加。
圖7 長(zhǎng)雙歧桿菌添加量對(duì)猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響
由表2可知,影響猴頭菇水提物提取率的主次因素依次為添加量>發(fā)酵溫度=發(fā)酵時(shí)間,通過(guò)極差分析初步得到猴頭菇水提物提取率最佳方案為A3B3C2,水提物提取率為28.70%。影響水提取物中粗多糖含量的主次因素依次為添加量>發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度,通過(guò)極差分析初步得到提取液中粗多糖含量最佳方案為A3B1C2,水提物中粗多糖含量為64.00%。影響猴頭菇粗多糖提取率的主次因素依次為添加量>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間,通過(guò)極差分析初步得到粗多糖提取率最佳方案為A3B1C2,猴頭菇粗多糖提取率17.28%。
表2 長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵猴頭菇L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果
對(duì)比最優(yōu)組合A3B3C2與A3B1C2,猴頭菇水提物提取率分別為28.70%與27.00%,水提取物中粗多糖含量分別為52.18%與64.00%,粗多糖提取率分別為14.98%與17.28%,A3B3C2水提物提取率略微高于A3B1C2,其余指標(biāo)都低于A3B1C2,因此選擇A3B1C2為最佳發(fā)酵工藝,在此最佳工藝條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn),測(cè)得水提物提取率平均值為27.85%,水提取物中粗多糖含量平均值為62.87%,粗多糖提取率平均值為17.51%,都與正交試驗(yàn)中各項(xiàng)結(jié)果吻合,表明最佳發(fā)酵工藝條件穩(wěn)定,重復(fù)性好。因此最佳發(fā)酵工藝如下:長(zhǎng)雙歧桿菌添加量為20%、發(fā)酵時(shí)間4 h、發(fā)酵溫度42℃。
由圖8可知,酵母菌發(fā)酵后的多糖總抗氧化能力最高,達(dá)到6.07 umol·g-1。除酵母菌組外的其他3組之間沒有顯著關(guān)系,表明長(zhǎng)雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌發(fā)酵對(duì)猴頭菇粗多糖的總抗氧化能力沒有顯著影響。益生菌在發(fā)酵過(guò)程中可水解一些結(jié)合酚,釋放游離酚,提高生物利用率,同時(shí)降低多糖分子量,從而提高抗氧化能力[17],而不同菌種水解效率不同,導(dǎo)致總抗氧化能力各不相同。
圖8 添加不同益生菌猴頭菇多糖的總抗氧化能力
由圖9可知,4個(gè)處理粗多糖的紅外光譜在500~2200 cm-1和3000~4000 cm-1處基本相似,說(shuō)明具有相似的官能團(tuán),在3300 cm-1~3500 cm-1附近處出現(xiàn)吸收峰,說(shuō)明在多糖中含有O-H伸縮振動(dòng)吸收峰,說(shuō)明其存在分子內(nèi)或分子間的氫鍵[18]。在1587 cm-1附近出現(xiàn)C=O吸收峰,說(shuō)明該物質(zhì)中含有酯酰基結(jié)構(gòu)[19]。在1357 cm-1附近出現(xiàn)C-H變角振動(dòng)吸收峰,在1075 cm-1附近出現(xiàn)由酯鍵(-COOR)中C-O伸縮振動(dòng)引起的吸收峰,說(shuō)明其含有糖醛酸基團(tuán)。在770 cm-1附近出現(xiàn)α構(gòu)型C-H面外彎曲振動(dòng)吸收峰[20]。不同猴頭菇粗多糖的紅外光譜之間沒有明顯的差異,只是峰的位置與強(qiáng)度略微改變,但未使得吸收峰出現(xiàn)變化,這與溫雅慧[21]提取的猴頭菇多糖紅外光譜圖中特征峰的位置相似。這可能是因?yàn)橐嫔l(fā)酵后的多糖分子量減少導(dǎo)致的[22],有研究表明多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[23],這可能改善多糖的生物活性。
益生菌菌株嗜酸乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和酵母(高糖型)發(fā)酵猴頭菇后降低了猴頭菇水提取物的提取率,但水提物中粗多糖含量與粗多糖提取率顯著增加,其中長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵猴頭菇后其粗多糖提取率最高(11.55%)。益生菌發(fā)酵猴頭菇的最佳工藝為:長(zhǎng)雙歧桿菌添加量為20%、發(fā)酵時(shí)間4 h、發(fā)酵溫度42℃,在此最佳工藝條件下水提物提取率為27.85%,提取物中粗多糖含量為62.87%,粗多糖提取率為17.51%。不同益生菌發(fā)酵后制備的猴頭菌粗多糖都具有一定抗氧化能力,是天然抗氧化劑的良好來(lái)源,其中酵母發(fā)酵后猴頭菌粗多糖提取物具有最高的總抗氧化能力,達(dá)6.07 umol·g-1,長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵后的多糖總抗氧化能力與未經(jīng)益生菌發(fā)酵的多糖沒有顯著差異(P<0.05)。傅里葉變換紅外光譜分析顯示,不同益生菌發(fā)酵后與未發(fā)酵的猴頭菇粗多糖的傅立葉紅外光譜圖基本相似,峰位置略微偏移,具有相似的官能團(tuán)。
本研究表明長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵可以顯著增加猴頭菌粗多糖提取率,具有良好的抗氧化能力,這為益生菌在食用菌多糖的應(yīng)用提供了參考,也為進(jìn)一步開發(fā)猴頭菌多糖作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品和制藥工業(yè)提供科學(xué)依據(jù)。