石斛多糖對膠原誘導關節(jié)炎小鼠免疫活性的影響

阮崇潔 李勇 黃裳

武漢市中醫(yī)醫(yī)院針灸風濕病科,湖北 武漢 430014

類風濕性關節(jié)炎(RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病,伴有滑膜炎癥,其病理學主要是由關節(jié)滑膜內(nèi)免疫細胞的不適當浸潤和激活驅(qū)動的[1]。如果不加以控制,可能會導致腦、肝、肺和心臟的關節(jié)外并發(fā)癥,使RA患者的死亡率與無RA患者相比增加了1.5倍[2]。RA的發(fā)病機制復雜,涉及遺傳、環(huán)境和免疫因素。輔助T細胞(Th17)和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)在調(diào)節(jié)組織炎癥和維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。在關節(jié)炎小鼠實驗中,調(diào)節(jié)Treg和Th17細胞失衡和抑制破骨細胞生成,減輕細胞炎癥,能顯著改善膠原誘導關節(jié)炎(CIA)[3]。

研究表明,石斛可有效減輕CIA小鼠的關節(jié)腫脹、滑膜增生,重塑Th17和Treg細胞的平衡,通過抑制炎癥信號通路改善小鼠RA[4]。石斛多糖(DSP)是鐵皮石斛主要生物活性成分之一,具有多種生物學作用,包括免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、降血糖、保肝等,能抑制炎癥相關通路的激活,減少炎癥細胞的浸潤和促炎介質(zhì)的產(chǎn)生[5]。然而,關于鐵皮石斛的多糖緩解CIA小鼠炎癥的研究較少。因此,本研究采用CIA小鼠研究DSP對RA炎癥反應的影響,為DSP的應用開發(fā)和RA治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:7周齡41只雄性C57BL/6小鼠,來源于湖南斯萊克景達,于無特定病原體條件下,22～26 ℃,相對濕度為50 %～60 %,人工光照明暗各12 h飼養(yǎng),實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2018-0104。

1.1.2試劑:戊巴比妥鈉、牛鼻中隔II型膠原蛋白、弗氏完全佐劑、佛波酯購于Sigma公司,60 %的石斛多糖購于源葉生物公司,伊紅、中性樹脂、DAB濃縮型試劑盒、胰蛋白酶、Penicillin-Streptomycin Solution、鈣離子霉素、莫能菌素鈉購于Solarbio公司,蘇木精、Tris-EDTA修復液購于Servicebio公司。兔抗IL-7抗體購于Bioswamp公司,MaxVisionTManti-Mouse/Rabbit IHC Kit購于邁新公司,DMEM購于Hyclone公司,Collagenase II購于Gibco公司,CD4抗體、CD25抗體、FOXP3抗體、IL-17抗體購于Ebioscience公司,CD28抗體、PD-1抗體、OX40抗體購于ThermoFisher公司,固定破核劑購于BD bioscience公司。小鼠白細胞介素6(IL-6)、小鼠白細胞介素10(IL-10)購于武漢基因美生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1CIA模型構建及鑒定:適應喂養(yǎng)7 d后,隨機選取31只小鼠進行CIA誘導[6]。將II型膠原蛋白與弗氏完全佐劑充分混勻,制成2 mg/mL乳劑,每只小鼠右足墊注射0.1 mL,1 周后加強免疫。剩余小鼠作為對照組,分別于第0 d和第21 d在注射生理鹽水。在造模第3 周每組取3只,通過小鼠后肢足趾拍照和HE染色進行模型鑒定。

1.2.2石斛多糖干預和實驗分組:將小鼠分為5組,每組7只,分別為對照組、模型組、DSP低濃度組、DSP中濃度組、DSP高濃度組。在造模第4周,對照組和模型組小鼠灌胃10 mL/kg生理鹽水。DSP低濃度組、DSP中濃度組和DSP高濃度組分別給予100、200和300 mg/kg進行灌胃處理[7]。每天1次,連續(xù)3 周,期間自由飲水進食。采用1 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死小鼠,獲取外周血、脾臟和踝關節(jié)組織進行進一步研究。

1.2.3小鼠踝關節(jié)骨組織HE染色:將收集的小鼠踝關節(jié)骨組織按常規(guī)步驟脫水浸蠟包埋,制片后脫蠟至水、水洗、蘇木精和伊紅液染色,酒精脫水,中性樹膠封固后通過顯微鏡拍照觀察組織病理變化。

1.2.4流式細胞術檢測各組小鼠脾臟中Th17和Treg細胞數(shù)量:0.08 %的胰酶和0.1 % II型膠原酶(1∶1)重懸小鼠脾臟組織塊,37 ℃消化。用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液輕輕吹打制成細胞懸液,200目孔徑不銹鋼網(wǎng)除去未消化組織,離心后加紅細胞裂解液重懸沉淀,離心PBS重懸制備脾臟單細胞。

檢測Th17(CD4+IL-17)細胞比例:收集各組細胞加入佛波酯、離子酶素和莫能菌素鈉培養(yǎng)6 h,離心棄上清,加入流式染色緩沖液洗滌。離心重懸,加入CD4抗體孵育,固定劑和破膜劑處理后加入IL-17抗體,避光孵育,檢測Th17細胞比例。

檢測Tregs(CD4+CD25+Foxp3+)細胞比例:收集各組細胞加入CD4和CD25抗體,避光孵育,離心棄上清。固定劑和破膜劑處理后,加入Foxp3抗體避光孵育,檢測Tregs細胞比例。

檢測Tregs(CD4+CD28-PD-1lowOX40+T)細胞:收集各組細胞加入CD4、CD28、PD-1、OX40抗體,避光孵育,離心后PBS重懸上機檢測Tregs細胞變化。

1.2.5免疫組化法檢測各組小鼠右肢膝關節(jié)中IL-7和Foxp3的表達水平:取各組小鼠右肢膝關節(jié)組織進行脫水、浸蠟及包埋,制片后二甲苯浸泡脫蠟,梯度酒精浸泡水化,Tris-EDTA緩沖溶液中高壓處理進行抗原修復。然后,將玻片置于3 % H2O2中,濕盒孵育消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,山羊血清封閉。滴加一抗IL-7和Foxp3(稀釋比例1∶200),4 ℃孵育過夜。復溫后滴加maxvision二抗,37 ℃孵育1 h。DAB和蘇木精染色,酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。通過顯微鏡拍照,進行圖像采集分析。

1.2.6ELISA檢測小鼠血清和右肢膝關節(jié)IL-6、IL-10的表達水平:在不同時間點(0、14、28、42 d)通過尾靜脈用注射器取20 μg外周血,3 000 r/min離心20 min去除凝塊,保留上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說明書在酶標包被板上設標準品孔、空白孔、樣本孔分別加入不同濃度的標準品、樣品和純水。除空白孔外,每孔加入酶標試劑室溫孵育30 min,洗滌加入顯色劑避光顯色10 min后終止反應。測量各孔450 nm處吸光度,計算出標準曲線的二次回歸方程式,從而計算出0、14、28、42 d小鼠血清IL-6、IL-10的表達水平。

取小鼠右肢膝關節(jié)組織,加入pH值7.4的PBS均質(zhì)化,3 000 r/min離心20 min后,收集上清液,ELISA試劑盒測定IL-6和IL-10表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 模型鑒定

對照組小鼠關節(jié)完整,軟骨邊緣光滑,無淋巴細胞浸潤與軟骨缺失;后肢右爪無紅腫現(xiàn)象。模型組小鼠關節(jié)滑膜重度增生變厚,軟骨破壞嚴重,出現(xiàn)淋巴細胞和中性粒細胞浸潤;后肢右爪包括踝關節(jié)在內(nèi)的全部腳趾腫脹。

注:A:HE染色;B:后肢右爪腫脹圖。圖1 模型鑒定Fig.1 Model identification

2.2 各組小鼠后肢右爪病理形態(tài)變化

對照組小鼠關節(jié)滑膜組織結(jié)構完好,細胞排列整齊,無炎性細胞浸潤,后肢右爪無紅腫現(xiàn)象。模型組小鼠滑膜組織增生明顯,細胞排列紊亂,伴有炎性細胞浸潤出現(xiàn),后肢右爪包括踝關節(jié)在內(nèi)的全部腳趾腫脹,病理損傷顯著。與模型組相比,DSP處理后小鼠關節(jié)滑膜組織病理損傷明顯減輕,腫脹緩解,高濃度DSP作用效果最為顯著。見圖2。

注:A:HE染色;B:后肢右爪腫脹圖。圖2 DSP對小鼠后肢右爪病理形態(tài)的影響Fig.2 Effect of DSP on the pathological morphology of the right paw of the hind limb of mice

2.3 流式細胞術檢測各組小鼠脾臟中Th17和Treg細胞比例

與對照組相比,模型組中Th17細胞比例增大(P<0.05),Treg細胞比例下降(P<0.05),Th17/Treg比例增大(P<0.05)。與模型組相比,DSP處理后Th17細胞比例下降(P<0.05),Treg細胞比例增大P<0.05),Th17/Treg比例下降(P<0.05),其中高濃度DSP處理效果最佳。見圖3,表1。

表1 DSP對各組小鼠脾臟中Th17和Treg細胞比例的影響

圖3 DSP對各組小鼠脾臟中Th17細胞(A)和Treg細胞(B)比例的影響Fig.3 Effect of DSP on the ratio of Th17 cells (A) and Treg cells (B) in the spleen of each group of mice

2.4 免疫組化檢測各組小鼠右肢膝關節(jié)中IL-7和Foxp3的表達

與對照組相比,模型組IL-7陽性表達增加(P<0.05),Foxp3陽性表達下降(P<0.05)。與模型組相比,DSP處理后IL-7陽性表達減少(P<0.05),Foxp3陽性表達增加(P<0.05),其中高濃度DSP處理后IL-7陽性表達接近對照組。見圖4,表2。

表2 DSP對各組小鼠右肢膝關節(jié)中IL-7和Foxp3表達水平的影響

圖4 DSP對各組小鼠右肢膝關節(jié)中IL-7和Foxp3表達水平的影響Fig.4 Effect of DSP on the expression level of IL-7 and Foxp3 in the right limb knee joint of mice in each group

2.5 流式細胞學檢測法檢測小鼠脾臟中CD4+CD28-PD-1lowOX40+T細胞的變化

與對照組相比,模型組CD4+CD28-PD-1lowOX40+T細胞比例下降(P<0.05)。與模型組相比,DSP處理后CD4+CD28-PD-1lowOX40+T細胞比例增加(P<0.05),其中高濃度DSP處理組CD4+CD28-PD-1lowOX40+T細胞比例最高。見圖5,表3。

表3 DSP對各組小鼠脾臟中CD4+CD28-PD-1lowOX40+T細胞表達水平的影響

圖5 DSP對各組小鼠脾臟中CD4+CD28-PD-1lowOX40+T細胞表達水平的影響Fig.5 Effect of DSP on the expression level of CD4+CD28-PD-1lowOX40+T cells in the spleen of mice in each group

2.6 ELISA檢測不同時間各組小鼠血清IL-6的表達水平

與對照組相比,不同時間點(0、14、28、42 d)模型組IL-6水平增加(P<0.05),IL-10水平下降(P<0.05)。與模型組相比,DSP處理后IL-6水平下降(P<0.05),IL-10水平上升(P<0.05),其中高濃度DSP處理效果最佳。見表4,表5。

表4 DSP對各組小鼠血清IL-6表達水平的影響Table 4 Effect of DSP on serum IL-6 expression level in each group of n=7)

表5 DSP對各組小鼠血清IL-10表達水平的影響Table 5 Effect of DSP on serum IL-10 expression level in each group of n=7)

2.7 ELISA檢測各組小鼠右肢膝關節(jié)組織IL-6和IL-10表達水平

與對照組相比,模型組IL-6水平增加(P<0.05),IL-10水平下降(P<0.05)。與模型組相比,DSP處理后IL-6水平下降(P<0.05),IL-10水平上升(P<0.05),其中高濃度DSP處理效果最佳。見表6。

表6 DSP對小鼠右肢膝關節(jié)組織IL-6和IL-10表達水平的影響

3 討論

鐵皮石斛藥用歷史悠久,藥理功效突出,能抑制炎癥因子分泌,平衡免疫抑制小鼠體內(nèi)脾T淋巴細胞亞群,參與機體免疫活動[8]。且鐵皮石斛對正常小鼠無毒害作用,長期食用對其器官及功能無不良影響[9]。多糖是鐵皮石斛中含量較高的化合物,在體外可以抑制RANKL誘導的破骨細胞形成,明顯降低炎癥因子水平,具有較好的免疫活性[10]。在笈文娜等[11]研究中,鐵皮石斛粗多糖可以調(diào)節(jié)T淋巴細胞分布,調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡,抑制炎癥信號通路。

研究表明,自身反應性CD4+T細胞被認為在RA的發(fā)病機制中起關鍵作用,其功能或數(shù)量失衡會導致免疫異常,進而導致T和B細胞的過度激活,造成持續(xù)性滑膜炎和關節(jié)破壞[12]。Th17細胞是重要促炎性CD4+T細胞亞群,在RA中產(chǎn)生各種促炎細胞因子促進滑膜炎,Tregs細胞是介導免疫耐受的主要T細胞類型,對自身成分具有免疫不反應性和負性控制炎癥,減輕RA的進展[13]。這會導致RA患者的滑膜組織發(fā)生病理學改變,出現(xiàn)炎癥細胞浸潤和血管翳[14]。本研究中,CIA小鼠后肢右爪包括踝關節(jié)在內(nèi)的全部腳趾腫脹,炎癥細胞浸潤滑膜組織,Treg/Th17細胞比例失衡。因此,抑制炎癥和維持Treg/Th17細胞比例平衡是治療CIA的重要靶點。

對比RA患者的Th17和Treg細胞的分化平衡,發(fā)現(xiàn)其水平遠高于健康人群[15]。Th17細胞是以分泌IL-17為特征,IL-17刺激小鼠成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞分泌IL-6和IL-8,誘導T細胞增殖,并通過趨化因子的釋放誘導中性粒細胞募集[16]。在體外IL-17能夠誘導IL-6等促炎因子產(chǎn)生,引起組織炎癥和骨侵蝕,從而導致RA患者慢性炎癥和關節(jié)損傷[17]。Treg細胞是由未成熟T淋巴細胞產(chǎn)生的,通過分泌具有抗炎功能的細胞因子IL-10和TGF-β,抑制IL-17的分泌,發(fā)揮免疫調(diào)控作用[18]。FOXP3是Treg細胞的主要轉(zhuǎn)錄因子,能增加Tregs的分化和穩(wěn)定作用,實現(xiàn)抗關節(jié)炎和免疫調(diào)節(jié)特性[19]。Zhao等[20]發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比,在CIA模型小鼠中,Foxp3的表達水平明顯降低,而IL-17的表達水平明顯升高,用甘草附子湯方劑治療后CIA小鼠脾臟中Th17細胞比例、血清IL-17、IL-6水平降低,而脾臟中Treg細胞比例、Foxp3和IL-10的表達水平升高。中醫(yī)藥雖然在治療RA方面取得了一定的成效,但DSP對RA的治療數(shù)據(jù)較少,還需進一步深入。本研究中,不同濃度的DSP作用后,CIA小鼠的病理損傷減輕,IL-17的水平降低,Foxp3的水平升高,Th17細胞表達比例下降,Treg細胞表達比例上升,免疫細胞CD4+CD28-PD-1lowOX40+T細胞表達比例增加。同時,小鼠脾臟和膝關節(jié)中IL-6水平下降,IL-10水平上升,呈濃度依耐性,且高濃度DSP作用效果最佳。這提示DSP能通過調(diào)控CIA小鼠體內(nèi)Th17/Treg細胞比例平衡,抑制炎癥因子產(chǎn)生和促進抗炎因子分泌,發(fā)揮對RA的治療作用。

綜上所述,DSP能調(diào)節(jié)CIA小鼠體內(nèi)的免疫活性,維持Th17/Treg細胞比例平衡,緩解炎癥損傷,這為DSP的藥用開發(fā)及RA的治療提供了理論支持。