絞股藍(lán)皂苷對(duì)C2C12細(xì)胞成肌分化的影響

唐子佳 東智卓瑪 吳建軍 林適 楊彬彬 陳桐瑩 黃佳純 林燕平 黃幸儒 黃宏興*

1． 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510405

2． 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510378

絞股藍(lán)皂苷(gypenoside)是葫蘆科屬草本植物絞股藍(lán)的重要生物活性成分之一[1],基于Cite Space軟件的文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn),絞股藍(lán)皂苷類成分是國(guó)內(nèi)外近年來(lái)有關(guān)絞股藍(lán)的研究熱點(diǎn)[2]。相關(guān)藥理學(xué)研究表明,作為絞股藍(lán)中的高營(yíng)養(yǎng)成分,絞股藍(lán)皂苷具有抗炎、抗衰老、降糖調(diào)脂、護(hù)心護(hù)肝等多方面作用[3-5]。課題組的前期實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),絞股藍(lán)皂苷不僅能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化,而且對(duì)H2O2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用[6-7]。然而,有關(guān)絞股藍(lán)活性成分在C2C12細(xì)胞成肌分化方面的研究相對(duì)較少;因此,本研究以小鼠C2C12細(xì)胞株為研究對(duì)象,擬探尋絞股藍(lán)皂苷對(duì)其成肌分化的影響,旨在從細(xì)胞層面豐富肌骨同治的理論內(nèi)涵[8]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

C2C12細(xì)胞購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)(目錄號(hào)GNM26),它是小鼠成肌細(xì)胞株的亞克隆,在一定條件下能夠分化為可伸縮的肌管并生成特征性的肌蛋白。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

絞股藍(lán)皂苷購(gòu)自曼斯特生物科技有限公司(成都),規(guī)格20 mg,批號(hào)MUST-21070818,純度為98.00 %。

1.3 主要儀器與試劑

徠卡倒置熒光顯微鏡SOP(型號(hào):DMI 3000B),全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(型號(hào):Multiskan GO),全能凝膠成像儀(型號(hào):ChemiDoc MP),奧林巴斯倒置熒光顯微鏡(型號(hào):IX73)。

DMEM培養(yǎng)基(含4.5 g/LD-葡萄糖)、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗(Gibco),Horse Serum(VivaCell),4 %多聚甲醛、PBST緩沖液(biosharp),抗體MYF5、抗體MyoD1(Affinity),Triton?X-100(biofroxx),山羊抗兔IgG H&L(Abcam),β-Actin Rabbit mAb(CST),CCK-8試劑、BSA、PVDF膜、抗熒光淬滅封片劑含DAPI(Beyotime),改進(jìn)型促凝劑、快速封閉液、RIPA裂解液、彩色凝膠快速試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(新賽美)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1溶液配制:完全培養(yǎng)基:89 % DMEM培養(yǎng)基+10 %胎牛血清+1 %雙抗;成肌分化培養(yǎng)基:96 % DMEM培養(yǎng)基+3 % Horse Serum+1 %雙抗[9];絞股藍(lán)皂苷稀釋液:20 mg的絞股藍(lán)皂苷溶解于二甲基亞砜(DMSO)成為母液,鑒于DMSO對(duì)細(xì)胞可能的毒性作用及前期研究基礎(chǔ),將上述溶液至少稀釋200倍,設(shè)置濃度梯度為160 mg/L、80 mg/L、40 mg/L、20 mg/L和10 mg/L。

1.4.2C2C12細(xì)胞培養(yǎng):將預(yù)先分裝于液氮罐儲(chǔ)存的C2C12細(xì)胞取出1管復(fù)蘇,培養(yǎng)皿中用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)復(fù)蘇的C2C12細(xì)胞,置于37 ℃、含5 % CO2的培養(yǎng)箱中孵育,固定倍數(shù)鏡下觀察細(xì)胞的貼壁及生長(zhǎng)狀況,待細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)皿面積的70 %～80 %再予以傳代,每?jī)商鞊Q液1次。

1.4.3C2C12細(xì)胞分化:胰酶消化C2C12細(xì)胞后,以5×104/mL的密度接種于96孔板和6孔板,培養(yǎng)基以鋪滿孔底為宜,分別為100 μL/孔和1 mL/孔;隔日在顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況,再更換為含不同濃度絞股藍(lán)皂苷的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化,96孔板中各濃度均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,每?jī)商鞊Q液1次,5 d后觀察細(xì)胞分化形態(tài),CCK-8法檢測(cè)各濃度下細(xì)胞的分化活力。

1.4.4Western Blot檢測(cè):顯微鏡下觀察6孔板細(xì)胞分化形態(tài)后,棄培養(yǎng)基,PBS清洗2次,加入預(yù)先配制好的裂解液后于冰上裂解,10 min后用刮板分別刮取各孔,收集蛋白于1.5 mL的EP管中,再經(jīng)超聲、離心等步驟后取上清,測(cè)定各蛋白濃度,最后使用PCR儀煮蛋白后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體、顯影等一系列操作完成Western blot檢測(cè)。

1.4.5免疫熒光檢測(cè):胰酶消化C2C12細(xì)胞后,以3×104/mL的密度接種于48孔板,含培養(yǎng)基量150 μL/孔;細(xì)胞貼壁后即予以含不同濃度絞股藍(lán)皂苷的分化培養(yǎng)基培養(yǎng),每?jī)商鞊Q液1次,待細(xì)胞分化為肌管后即行免疫熒光染色(5 d)。首先進(jìn)行固定、通透、封閉等步驟,然后用一抗于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜,PBS漂洗3次,暗環(huán)境下加入熒光二抗,室溫避光孵育1 h,最后用含DAPI的封片液染色1 min,倒置熒光顯微鏡下觀察目的蛋白的表達(dá),Image J軟件進(jìn)行熒光定量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì),并繪制柱狀圖,各組間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C2C12細(xì)胞分化活力

預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用160 mg/L濃度的絞股藍(lán)皂苷干預(yù)細(xì)胞時(shí),顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞大面積死亡,故舍棄該濃度,再按濃度梯度增加5 mg/L的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞分化活力,即在96孔板中每孔加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h,最后在設(shè)置OD值為450 nm的酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔的吸光度,按照細(xì)胞活力計(jì)算公式[10]計(jì)算各濃度的活力百分比。如圖1顯示,相較于空白對(duì)照組,80 mg/L濃度下的細(xì)胞活力偏低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 細(xì)胞活力(OD)Fig.1 Cell viability(OD)

2.2 C2C12細(xì)胞分化形態(tài)

用含不同濃度絞股藍(lán)皂苷的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化C2C12細(xì)胞,第5天可見(jiàn)細(xì)胞分化為辨識(shí)度較高的肌管形態(tài)[11]。鏡下見(jiàn)80 mg/L濃度下細(xì)胞的分化較少,形態(tài)不夠典型,其余濃度絞股藍(lán)皂苷干預(yù)下的C2C12細(xì)胞則呈現(xiàn)出較為明顯的分化。詳見(jiàn)圖2。

圖2 細(xì)胞分化Fig.2 Cell differentiation

2.3 Western blot檢測(cè)

由于80 mg/L濃度下的C2C12細(xì)胞活力及分化程度較低,故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中舍棄該濃度。收集分化第5天的細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè),選用具有代表性的成肌標(biāo)志物MYF5和MyoD1作為一抗[12],β-actin為內(nèi)參,全能凝膠成像儀上顯影,結(jié)果見(jiàn)圖3。經(jīng)Image J和GraphPad Prism軟件統(tǒng)計(jì)分析,MYF5和MyoD1相對(duì)于β-actin的蛋白表達(dá)量如圖4所示,其中10 mg/L和5 mg/L濃度下的相對(duì)表達(dá)量相較于Control組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其余各組間的差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 Western Blot 結(jié)果Fig.3 The results of Western Blot

圖4 相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression

2.4 免疫熒光染色

48孔板上用分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化C2C12細(xì)胞,顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞分化為肌管形態(tài)即行免疫熒光染色,每個(gè)濃度設(shè)1個(gè)復(fù)孔,奧林巴斯倒置熒光顯微鏡下觀察目的蛋白MyoD1的表達(dá)及細(xì)胞核的染色情況,見(jiàn)圖5。計(jì)算各個(gè)濃度下的融合指數(shù)(fusion index),即位于陽(yáng)性肌管內(nèi)的細(xì)胞核數(shù)與總細(xì)胞核數(shù)的比值[13]。如圖6顯示,10 mg/L和5 mg/L濃度干預(yù)下的肌管融合指數(shù)均明顯高于Control組,且10 mg/L和40 mg/L濃度之間的融合指數(shù)差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖6 肌管融合指數(shù)(%)Fig.6 Fusion index of myotube(%)

3 討論

研究結(jié)果表明,10 mg /L和5 mg/L濃度的絞股藍(lán)皂苷能夠明顯促進(jìn)C2C12細(xì)胞的成肌分化;不僅表現(xiàn)為分化的肌管形態(tài)清晰典型、融合指數(shù)更高,而且相關(guān)成肌標(biāo)志物的表達(dá)也最為顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,本研究還補(bǔ)充了課題組前期絞股藍(lán)作用于骨骼肌相關(guān)實(shí)驗(yàn)的空白,從而在體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明了單體絞股藍(lán)皂苷對(duì)成肌成骨的分化均有一定的促進(jìn)作用。

成肌細(xì)胞是骨骼肌的前體細(xì)胞,具備較強(qiáng)的增殖分化能力,而小鼠的C2C12細(xì)胞株經(jīng)Horse Serum誘導(dǎo)可分化為多核的肌管形態(tài),并表達(dá)相關(guān)的蛋白標(biāo)志物;因此,C2C12細(xì)胞株是研究成肌分化的優(yōu)越模型之一[12,14]。研究發(fā)現(xiàn),肌源性調(diào)節(jié)因子(myogenic regulator factors,MRFs)在骨骼肌的增殖及分化過(guò)程中起著重要作用,它包括成肌調(diào)節(jié)因子5(myogenic factor 5,MYF5)、肌分化因子(myogenic differentiation,MyoD)和肌生成素(myogenin,MyoG)等[15]。其中MyoG一般在肌細(xì)胞的分化末期表達(dá),而MYF5和MyoD主要參與初期分化的調(diào)控[16-17],并且MYF5表達(dá)最早,還能進(jìn)一步激活MyoD的表達(dá),從而標(biāo)志著肌衛(wèi)星細(xì)胞分化周期的開(kāi)始[18]。肌衛(wèi)星細(xì)胞是C2C12細(xì)胞在骨骼肌中的主要存在形式,經(jīng)過(guò)增殖分化等過(guò)程可融合為肌管,最終變?yōu)榧±w維形態(tài)[19-20]。本研究專注于表征肌細(xì)胞分化早期的MYF5和MyoD兩種因子,通過(guò)Western blot和免疫熒光檢測(cè)等手段說(shuō)明了一定濃度的絞股藍(lán)皂苷能夠促進(jìn)相關(guān)肌源性因子的表達(dá),從而有利于成肌分化;尤其是MyoD代表著肌細(xì)胞分化進(jìn)程的開(kāi)端,在骨骼肌的分化中扮演關(guān)鍵角色[21],加用肌管融合指數(shù)等分化參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,具有較強(qiáng)的說(shuō)服力。且有研究表明,若下調(diào)MyoD的水平會(huì)導(dǎo)致分化抑制[15],更加突出了MyoD的重要性。但是本研究未涉及象征分化終期MyoG因子的相關(guān)指標(biāo),后續(xù)可以進(jìn)一步檢測(cè)證明。

絞股藍(lán)最早僅被作為食用,直至《本草綱目》始逐漸發(fā)現(xiàn)其藥用價(jià)值,2002年被我國(guó)收錄為藥食同源保健品后便引發(fā)諸多學(xué)者的關(guān)注與研究[22-23]。絞股藍(lán)的活性成分包括皂苷類、多糖和黃酮類等,其中尤以皂苷類成分為研究熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn),絞股藍(lán)皂苷的相關(guān)活性成分可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移,有一定的抗腫瘤作用[24-25];周文超[26]在絞股藍(lán)中發(fā)現(xiàn)了一種三萜皂苷類物質(zhì),并發(fā)現(xiàn)其具有抗炎活性;雷婧等[27]發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)皂苷能有效降低大鼠的血脂水平,萬(wàn)俊陽(yáng)等[28]通過(guò)對(duì)ApoE-/-小鼠的研究提出了絞股藍(lán)皂苷可以調(diào)控鐵死亡降低肝臟的脂質(zhì)沉積。除此以外,還有研究發(fā)現(xiàn),絞股藍(lán)皂苷類成分可以抑制活性氧的產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡標(biāo)志物的表達(dá),從而起到抗衰老作用[29];或通過(guò)調(diào)控lnc RNA/miRNA相關(guān)通路延緩骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的損傷[30]。然而,目前對(duì)于絞股藍(lán)在肌肉組織方面的相關(guān)研究較少,本研究及課題組前期研究在細(xì)胞層面為單體絞股藍(lán)皂苷對(duì)成肌成骨的作用提供了一定的參考價(jià)值,但是其濃度設(shè)置仍可優(yōu)化,分子機(jī)制也有待闡明與論證。