褐藻寡糖的制備工藝研究

◎ 尹宗美，劉曉菊，劉海燕，李群飛，孫占一

（1.青島明月海藻生物健康科技集團有限公司，海洋食品加工與安全控制全國重點實驗室，山東 青島 266400；2.上海質(zhì)量體系審核中心青島分中心，山東 青島 266400）

褐藻膠是一種酸性直鏈多糖，主要是由β-D-甘露糖醛酸（縮寫為M）和α-L-古洛糖醛酸（縮寫為G）通過1,4-糖苷鍵連接形成的線性、水溶性、酸性多糖[1]。褐藻寡糖（Alginate Oligosaccharides，AOS）是褐藻膠的寡聚物，一般可通過物理降解法、化學(xué)降解法、生物降解法等降解褐藻膠而獲得。褐藻寡糖的聚合度一般在2 ～10，解聚后其水溶性增強、易被機體吸收，是一種安全、無毒的化合物。研究表明，褐藻寡糖是一種具有多重生物功能的海洋活性寡糖，具有增強免疫力[2]、抗腫瘤[3]、保護神經(jīng)元[4]、促進植物生長[5]等功能，在功能食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[6-7]。

1 褐藻寡糖的制備方法

1.1 物理降解法

制備褐藻寡糖的物理降解法有紫外照射法、γ 射線輻照法、微波輻照法和超聲波法。在二氧化鈦存在的條件下，海藻酸鈉水溶液被紫外線照射3 h 以上，可降解產(chǎn)生AOS，且其相對分子質(zhì)量較低，G/M 比值接近于酸降解法產(chǎn)物[8]。γ 射線照射不會受溫度、環(huán)境、添加劑等條件的影響，且從能源效率的角度考慮，是目前最有效的物理降解法之一[9]。微波輻照法可避免脫鹽，被認為是一種方便、環(huán)保、快速獲得褐藻寡糖的方法[10]。物理法反應(yīng)快速、無環(huán)境污染，但一般成本較高、效率偏低，其作用機理不明確，有待于進一步深入研究。物理法在提取工藝中，單獨使用的情況較少，一般作為其他制備方法的輔助手段，同其他方法聯(lián)合使用。

1.2 化學(xué)降解法

制備褐藻寡糖的化學(xué)降解法有酸降解法、堿降解法、氧化降解法3 種。酸降解法使用比較普遍，是制備AOS 的傳統(tǒng)方法，一般用到草酸、甲酸和鹽酸等[11]。酸法降解褐藻膠的主要反應(yīng)步驟是共軛酸接收糖苷氧給予的質(zhì)子，形成的非還原端基末端、碳-正氧鎓離子斷裂，接著向碳-氧離子快速給水，可形成還原端基[12]。在反應(yīng)過程中，褐藻膠的來源、組成以及反應(yīng)條件等對AOS 的聚合度大小均有較大的影響。LARSEN 等[13]發(fā)現(xiàn)，使用1 mol·L-1草酸制備AOS，100 ℃條件下，褐藻膠發(fā)生降解反應(yīng)的比例約為30%。褐藻膠有一定的耐酸性，因此在一般的工藝條件下，不會完全被無機酸降解[14]。CHANDIA 等[15]發(fā)現(xiàn)，使用90%濃度的甲酸、100 ℃條件下水解6 h，再使用1.5 mol·L-1的甲酸、相同溫度條件下水解2 h，褐藻膠就可以被完全降解。胡博旸等[16]先以褐藻膠為原料，提取出聚甘露糖醛酸、聚古羅糖醛酸兩種物質(zhì)，再利用鹽酸降解這兩種聚糖，時間分別是1 h、2 h和6 h，分別獲得了甘露糖醛酸組分（M1、M2 和M3）和古羅糖醛酸組分（G1、G2 和G3），最后評估甘露糖醛酸、古羅糖醛酸兩種物質(zhì)對超氧化自由基、DPPH 自由基的清除效果，結(jié)果顯示清除作用均較好，且清除效果與寡糖中還原糖的含量成正相關(guān)，說明褐藻寡糖的抗氧化作用與聚合度有關(guān)，這對褐藻寡糖的制備工藝提出了更高的要求。

堿降解法是通過β-消除反應(yīng)，使褐藻膠的糖苷鍵斷裂，但褐藻膠的結(jié)構(gòu)也易因此發(fā)生變化，因此此種方法對生產(chǎn)過程的控制要求比較嚴苛，一般不建議使用這種方法。

酸、堿降解法的優(yōu)點是提取成本低、操作方便，經(jīng)過一次降解就可獲得不同聚合度范圍的寡糖，但對中間過程的控制要求較嚴格，極易產(chǎn)生有毒、有害的降解產(chǎn)物，不僅會腐蝕儀器，還會造成環(huán)境污染。

氧化降解法是先利用H2O2對褐藻膠進行降解，繼而利用醇沉技術(shù)獲得AOS，其副產(chǎn)物是H2O。這種方法的回收率較高，獲得的產(chǎn)品純度也更高，可以避免其他雜質(zhì)對環(huán)境造成污染[17]。但H2O2對褐藻膠的降解機理尚不清晰，有待于繼續(xù)確認及研究。

1.3 生物降解法

生物降解法產(chǎn)褐藻寡糖是以褐藻膠為底物，利用特異性褐藻膠裂解酶進行酶解，或利用微生物對其進行發(fā)酵，包括酶促降解法、產(chǎn)酶微生物全細胞發(fā)酵法，該降解技術(shù)的關(guān)鍵是尋找合適的酶[18]。

在自然界中，褐藻膠裂解酶主要來源于海洋動物類、海洋微生物、病毒和真菌等[19]，分布較廣泛。根據(jù)作用底物不同，褐藻膠裂解酶包括3 種類型，分別是Poly-M 特異性裂解酶、Poly-G 特異性裂解酶（可分別作用于M 段、G 段）、雙功能的褐藻膠裂解酶（對M 段和G 段都可起作用）[10,20-21]。裂解酶作用是以褐藻膠為底物，經(jīng)過β-消除機制，切斷β-1,4-糖苷鍵，并在C4、C5 之間形成雙鍵，從而獲得不同聚合度范圍的AOS 混合物[22-23]。其作用過程主要包含3 個步驟[24]。①中和羧基上的負電荷。②從C5 位上獲得質(zhì)子。③羧基提供電子，在C4、C5 之間形成雙鍵，導(dǎo)致β 消除反應(yīng)。褐藻膠裂解酶具有底物專一性，因此是制備特殊結(jié)構(gòu)物質(zhì)的首選。

陳淑瓊等[25]以質(zhì)量濃度8 g·L-1的海藻酸鈉為底物，調(diào)節(jié)pH 值至8.4、溫度為30 ℃，采用褐藻膠裂解酶酶解16 h，產(chǎn)物中還原糖的質(zhì)量濃度可達到1 660 mg·L-1。功效實驗結(jié)果顯示，獲得的褐藻寡糖在清除2,2’-聯(lián)氮雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽自由基（ABTS+）以及抑菌能力方面具有較強的作用，對蝦多酚氧化酶的活性具有有效抑制作用，為對蝦的貯藏保鮮研究提供一定的理論依據(jù)。

褐藻膠裂解酶具有特異性降解作用，因此在酶法制備褐藻寡糖的過程中，酶的獲得顯得非常重要。近年來，對褐藻膠裂解酶的研究逐漸增多，此酶的制備也實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，但受制于成本較高問題，仍需對此酶的獲得工藝進行深入研究。青島大學(xué)高華教授團隊、中國海洋大學(xué)的江曉璐教授團隊都已將優(yōu)選褐藻膠裂解酶產(chǎn)酶菌株以及褐藻寡糖作為獨立的課題進行研究，其中江曉璐教授團隊的褐藻膠裂解酶法制備褐藻寡糖現(xiàn)已在青島明月海藻生物產(chǎn)業(yè)基地實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[26]。

產(chǎn)酶微生物全細胞發(fā)酵法無須進行酶的分離及純化，可利用產(chǎn)酶微生物直接進行反應(yīng)，制備獲得AOS，該方法比直接酶降解工藝簡單，且生產(chǎn)條件可控，生產(chǎn)周期也更短，更利于規(guī)?；a(chǎn)，產(chǎn)品品質(zhì)可控。例如，利用微生物混合菌對北方海帶（Laminaria hyperborea）葉柄中的褐藻膠進行降解[27]。以海帶下腳料為原料，利用產(chǎn)褐藻膠裂解酶棒狀桿菌（XS1412C）對其進行發(fā)酵（粗酶經(jīng)分離濃縮后，酶活可由230 U·mL-1提升至1 000 U·mL-1），可得到高純度AOS 溶液，AOS 總量占比大于80%[28]。以海帶為原料，將酶降解和發(fā)酵技術(shù)相結(jié)合，發(fā)酵72 h，上清液中AOS 的回收率約為91.7%，純度為92.6%[29]。

1.4 合成法

合成法中，對酶促合成法的研究較多，利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生酶，以一定的底物為原料，合成AOS。假單胞菌（Pseudomonas mendocina）NK-01 在限制氮源的條件下，以葡萄糖為底物，可以合成AOS 及中鏈聚羥基烷酸[30]。門多薩假單胞菌NK-01 可以葡萄糖為底物，通過發(fā)酵技術(shù)合成AOS[29]。生物合成法使用的原料比較廉價，可準確控制產(chǎn)物的立體化學(xué)鍵形成以及區(qū)域選擇性，但合成成本較高，暫時無法用于工業(yè)化生產(chǎn)[31]。

2 褐藻寡糖的主要功能

2.1 抗氧化活性

褐藻寡糖可有效清除自由基，具有抗氧化活性，其活性大小與G/M、空間排列無關(guān)，可能與制備方法、濃度和分子量有關(guān)[22,32]。ZHAO 等[33]發(fā)現(xiàn)，低分子量褐藻寡糖（小于10 kDa）具有更高的抗氧化活性。在抗氧化活性及作用機理方面，酸降解法制備得到的AOS 與未降解的褐藻膠相似。在抗氧化方面，酶降解法制備獲得的AOS 具備共軛烯酸結(jié)構(gòu)，因此具有較好的活性[22]。在抗氧化功能應(yīng)用領(lǐng)域，酶降解法獲得的AOS 效果更優(yōu)。褐藻寡糖作為抗氧化劑可應(yīng)用于人類健康等領(lǐng)域[22]。PAN 等[34]發(fā)現(xiàn)，褐藻寡糖可激活核因子紅素-2 相關(guān)因子2（Nuclear Factor Erythrogen-2 Associated Factor 2，Nrf2），提升內(nèi)源性的抗氧化劑防御系統(tǒng)，顯著減輕D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠腎臟的衰老程度。

2.2 抗腫瘤活性

褐藻寡糖在抗腫瘤方面的相關(guān)報道可追溯到1985年，但目前作用機制依然不明晰[35]。CHEN 等[36]研究了褐藻寡糖（聚合度2 ～5）對抗骨肉瘤的作用效果，其通過提高患者血清中超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）及谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的含量，降低血清中IL-1β 和IL-6 的水平，從而介導(dǎo)抗腫瘤作用，且五糖對骨肉瘤細胞的生長抑制作用顯著。近年來，對褐藻寡糖抗腫瘤活性的研究不斷增多且更深入，但若要用于治療腫瘤，還需進行更深入的研究及更多臨床試驗。

2.3 其他活性

褐藻寡糖除具有上述生物活性外，還具有抗菌、抗炎、抗高血壓、抗哮喘、抗糖尿病、抗凝血、抗肥胖及神經(jīng)調(diào)節(jié)等活性[37-38]。以白消安誘導(dǎo)的小腸黏膜炎小鼠為模型，AOS 通過提高其小腸細胞簇的數(shù)量及比例，增強小腸細胞的發(fā)育及功能，達到緩解患者細胞損傷的效果[39]。以從新鮮海帶中提取得到的海藻酸鈉為原料，通過酸降解法技術(shù)制備得到平均聚合度為5 ～23 的褐藻寡糖，其在一定濃度下，對于體外的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有一定的抑制效果，并且隨著濃度的增加，抑制作用增強[40]。YANG 等[41]實驗發(fā)現(xiàn)，AOS 通過調(diào)節(jié)JNK-IRS1/PI3K 信號通路，可刺激胰島素的分泌、控制體內(nèi)葡萄糖水平升高、提高葡萄糖耐量，不僅可以控制體重，而且對HepG2 細胞具有較強的抗糖尿病活性。

3 結(jié)語

AOS 結(jié)構(gòu)較為獨特，其生物活性與制備方法、分子量、M/G 比例等多種因素有關(guān)。對于AOS 制備技術(shù)，酶降解法與其他兩種降解方法相比，具有更明顯的優(yōu)勢。①酶反應(yīng)在溫和的條件下進行，幾乎不需要任何化學(xué)試劑，更安全。②酶降解法制備的AOS 屬于不飽和寡糖，具有較強的抗氧化功能。但酶解制備技術(shù)也存在一定的問題，因其作用底物多為褐藻來源的褐藻膠，產(chǎn)量、性質(zhì)會因褐藻生長狀況、季節(jié)等的差異而不同，加上酶的不同也會影響產(chǎn)品的性質(zhì)等，所以褐藻寡糖的品質(zhì)難以保持穩(wěn)定。對于AOS 活性的研究仍主要集中在混合物上，且體內(nèi)研究較少，結(jié)構(gòu)與生物活性之間的關(guān)系研究也有待于進一步深入與明確，這些都是褐藻寡糖進一步開發(fā)和應(yīng)用的阻礙。酸降解法采用的是非選擇性的斷裂方式[42]，生物活性較低。

褐藻寡糖具有多種生物活性，有著廣闊的應(yīng)用前景，尤其是在海藻肥料領(lǐng)域，褐藻寡糖可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生激素，促進作物生長，提高產(chǎn)能，且可以抗病毒等。如果可以提高褐藻寡糖的成本優(yōu)勢，那么其在海藻肥料領(lǐng)域的應(yīng)用比例將大幅提升，更有助于海藻肥料對農(nóng)業(yè)發(fā)展的貢獻。隨著研究的進一步深入，褐藻寡糖在提高人類健康水平、提升人類生活質(zhì)量以及提升農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量方面，可以做出更大貢獻。