金柑磷酸蔗糖磷酸酶的基因克隆、表達(dá)與蛋白結(jié)構(gòu)分析

龍凌云 黃秋嵐 黃秋偉 檀小輝 李慧敏 劉功德 單 彬 毛立彥

（廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西亞熱帶特色水果質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001）

蔗糖是植物維持正常生命活動(dòng)必需的碳水化合物，在平衡植株內(nèi)“庫-源-流”關(guān)系［1-2］、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶活性，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控組織分化和發(fā)育等過程中發(fā)揮著重要作用［3-6］。植物的蔗糖生物合成是由蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）催化尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖形成蔗糖-6-磷酸，再由磷酸蔗糖磷酸酶（sucrose phosphate phosphatase，SPP）進(jìn)一步水解蔗糖-6-磷酸形成蔗糖，其中SPP 催化蔗糖生物合成的酶反應(yīng)是不可逆的［7］。早期研究認(rèn)為植物SPS 是蔗糖生物合成途徑的關(guān)鍵酶，SPP 并非主要調(diào)節(jié)點(diǎn)［2］。Chen 等［8］對(duì)煙草SPP基因進(jìn)行RNA干擾沉默表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中隨SPP表達(dá)量的大幅度降低，蔗糖和六碳糖含量同步大幅度下降，淀粉含量則高出正常植株3～5 倍，表明SPP基因可影響光合碳在不同儲(chǔ)能物質(zhì)間的分配。Maloney 等［9］借助酵母雙雜和雙分子熒光互補(bǔ)（bimolecular fluorescent complimentary，BiFC）發(fā)現(xiàn)擬南芥（Arabidopsis thaliana）的SPS 和SPP 蛋白存在互作關(guān)系，可形成二聚體復(fù)合物，將35SP：SPP-SPS-YFP 載體轉(zhuǎn)化入擬南芥和楊樹進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)SPP-SPS 融合體可使蔗糖等可溶性糖含量升高和淀粉含量下降，促進(jìn)植株生長(zhǎng)。上述研究表明，SPP 也可作為關(guān)鍵酶調(diào)控蔗糖生物合成過程，影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育。

現(xiàn)已從擬南芥（A.thaliana）［10］、水稻（Oryza sativa）［11］、玉米（Zea mays）［3］、小麥（Triticum aestivum）［12-13］等植物中鑒定出眾多SPP基因。這些植物SPP蛋白與HAD超家族成員在含有催化酶活性位點(diǎn)的保守基序上存在同源性，其磷酸酶/水解酶催化活性位點(diǎn)位于N 末端的S6PP 結(jié)構(gòu)域，而C 末端存在1 個(gè)不具催化作用的S6PP_C 結(jié)構(gòu)域［3，11，14］，單子葉與雙子葉植物SPP 蛋白均含有S6PP 和S6PP_C 結(jié)構(gòu)域，但兩者進(jìn)化趨勢(shì)差別明顯，結(jié)構(gòu)域部分序列的突變可能使單子葉和雙子葉植物SPP 蛋白在酶活力、穩(wěn)定性等功能上產(chǎn)生微小變化［15］。因此，酶基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)是決定其活性功能和催化效率的決定因素之一［16］，探究植物SPP基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)差異和進(jìn)化演變規(guī)律，對(duì)開展SPP的基因工程研究具有重要意義。

金柑（Fortunella crassifioliaSwingle）是可帶皮食用的蔗糖積累型柑橘類水果［17-19］，果實(shí)內(nèi)可溶性糖積累以蔗糖為主，蔗糖含量高低很大程度上影響了金柑果實(shí)的甜味品質(zhì)［20-22］。為進(jìn)一步研究金柑蔗糖生物合成分子機(jī)理，本研究基于廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所廣西名特優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品加工研究團(tuán)隊(duì)（本課題組）前期獲得的四倍體品種脆蜜金柑（F.crassifioliaSwingle cv.Cuimi）果肉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，克隆得到金柑的1 個(gè)SPP基因，并對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)和組織特異表達(dá)，及編碼蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)等分析，以期為后續(xù)金柑分子植物育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所（北緯22°90'，東經(jīng)180°34'）收集保存的四倍體金柑品種脆蜜金柑，2019 年種植于廣西亞熱帶特色水果質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)大棚（北緯22°90'53″，東經(jīng)180°34'18″），植株為嫁接苗，砧木為枳殼。脆蜜金柑是從二倍體滑皮金柑（F.crassifioliaSwingle cv.Huapi）的芽變單株選育而成的高糖新品種，花期為6 月上旬至7 月上旬，果實(shí)成熟期在11 月下旬至12 月中旬，全年開花2～3 批次［23］。根據(jù)脆蜜金柑果實(shí)物候期，本試驗(yàn)樣品采集于2022 年6 月至12 月，選擇第一批次花的果實(shí)作為試驗(yàn)對(duì)象，并對(duì)結(jié)果枝綁定標(biāo)簽牌記錄開花時(shí)間，分別按花開放后15 d（初果期，DAF15）、60 d（生長(zhǎng)期，DAF60）、120 d（膨大期，DAF120）和180 d（成熟期，DAF180）采集樣品，第二批和第三批次花進(jìn)行人工摘除。按標(biāo)簽牌所記錄開花時(shí)間，從果樹東、南、西、北4 個(gè)方向采集無病蟲害、無機(jī)械損傷的新鮮果實(shí)，每個(gè)時(shí)期采集20個(gè)果實(shí)，均分為4份，隨后將果實(shí)樣品放入自封袋，每個(gè)時(shí)期均按1～4 號(hào)進(jìn)行編號(hào)，其中1～3 號(hào)樣品用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR），4 號(hào)樣品用于基因克隆。在廣西亞熱帶特色水果質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品前處理，除15 d（DAF15）采摘時(shí)期的樣品果實(shí)較小，無法分離果肉和果皮外，其他時(shí)期樣品均去除果皮、種子保留果肉組織，按對(duì)應(yīng)編號(hào)將樣品進(jìn)行液氮速凍和研磨，分裝到10 mL 離心管并編號(hào)，-80 ℃超低溫冰箱保存，用于后續(xù)基因的克隆和表達(dá)分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA 提取和cDNA 第一鏈合成 參照RNAiso plus RNA 提取試劑盒（大連TaKaRa 生物技術(shù)有限公司）說明書提取金柑果肉樣品總RNA。提取的RNA 用ND5000 超微量紫外可見分光光度儀（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）上，測(cè)定260和280 nm的吸收值，確保抽提樣品的OD260/OD280在1.8～2.0 范圍，并用濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性和DNA 污染情況，確保條帶清晰。隨后將符合質(zhì)量的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以提取的總RNA 為模板，按HiScriptⅢ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司）說明書合成cDNA第一鏈，于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 金柑FcSPP基因cDNA 全長(zhǎng)克隆 根據(jù)本課題組前期脆蜜金柑果肉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選的Unigene（ID：sjg218640），經(jīng)開放閱讀框（open reading frame，ORF）預(yù)測(cè)分析并設(shè)計(jì)ORF 序列引物FcSPP-5CDS 和FcSPP-3CDS（如表1 所示），經(jīng)PCR 的擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后，參照pMDTM19-T Vector Cloning Kit 克隆載體試劑盒（TaKaRa 生物技術(shù)有限公司，大連）說明書連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選鑒定陽性克隆并進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，測(cè)序結(jié)果與篩選的Unigene進(jìn)行序列比對(duì)，確認(rèn)擴(kuò)增序列為FcSPP基因編碼序列（coding sequence，CDS），重組質(zhì)粒命名為pMD19T-FcSPP。根據(jù)擴(kuò)增獲得的CDS，按Vazyme HiScript-TS 5'/3' RACE Kit RACE 試劑盒（南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司）說明書的反應(yīng)體系和程序，分別合成5'/3'RACE-Ready cDNA。然后設(shè)計(jì)RACE 擴(kuò)增的5'-RACE 引物FcSPP-5GSP1 和3'-RACE 引物FcSPP-3GSP1（如表1 所示），分別將獲得的5'/3'RACE-Ready cDNA 產(chǎn)物經(jīng)Dilution Buffer 以1∶1 體積進(jìn)行稀釋并作為模板，按RACE 試劑盒操作流程進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果參照RACE 試劑盒中可選的巢式PCR（nested PCR）流程，設(shè)計(jì)巢式PCR 引物，即5'-RACE 引物FcSPP-5GSP2 和3'-RACE 引物FcSPP-3GSP2（如表1 所示）。將第一次RACE擴(kuò)增產(chǎn)物按1∶49 ddH2O稀釋后作為模板，分別擴(kuò)增5'/3'RACE 產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 試驗(yàn)中所用FcSPP基因的引物序列、名稱及用途Table 1 Olionucleotide primer names，sequences and function in the amplification of FcSPP genes

切膠回收產(chǎn)物，參照pMDTM19-T Vector Cloning Kit 克隆載體試劑盒（TaKaRa 生物技術(shù)有限公司，大連）說明書，將回收產(chǎn)物分別連接到pMD19-T 載體上，隨后進(jìn)行大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在抗性平板上挑選陽性克隆送南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序。

利用DNAMAN 8.0 軟件將上述PCR 擴(kuò)增獲得的FcSPP基因CDS，以及5'末端和3'末端cDNA 序列進(jìn)行拼接獲得的FcSPP基因cDNA 全長(zhǎng)序列，在NCBI 數(shù)據(jù)庫中的ORF Finder 功能查找ORF，并在基因兩端UTR區(qū)域設(shè)計(jì)引物FcSPP-5UTR 和FcSPP-3UTR（如表1所示），以總RNA 的反轉(zhuǎn)錄cDNA 為模板，參照PCR 擴(kuò)增試劑盒（TransTaq?High Fidelity （HiFi） PCR SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司）說明書的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后送南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行ORF 分析，并將拼接的目的基因全長(zhǎng)序列與擴(kuò)增測(cè)序序列進(jìn)行比對(duì)，確定所拼接的序列是否為目的基因cDNA序列。

1.2.3FcSPP基因及編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 利用在線分析工具Translate（https：//web.expasy.org/translate/）將FcSPP基因CDS翻譯成蛋白序列；ProParam（https：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)。SignalP 4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽；NetPhos 3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）預(yù)測(cè)蛋白磷酸化位點(diǎn)；SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；Pfam（http：//pfam-legacy.xfam.org/）在線軟件分析蛋白結(jié)構(gòu)域；借助在線軟件CD Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和本地軟件CLUSTAL X 2.1、GeneDOC 2.7 對(duì)FcSPP 蛋白序列進(jìn)行保守序列分析，并將其與擬南芥、水稻、玉米等物種的SPP蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）在MEGA11繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4FcSPP基因的原核表達(dá) 以獲得的重組質(zhì)粒pMD19T-FcSPP為模板，在FcSPP基因CDS 的FcSPP-5CDS 和FcSPP-3CDS 上添加NdeⅠ（CATATG）和XbaⅠ（TCTAGA）酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR 獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)電泳檢測(cè)回收擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)T4DNA 連接酶連接到空pCZN1 載體，連接產(chǎn)物經(jīng)16 ℃過夜培養(yǎng)轉(zhuǎn)化到Arctic Express（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素（Amp）的平板培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選，菌液PCR 擴(kuò)增篩選陽性克隆，并送公司測(cè)序鑒定，鑒定正確的表達(dá)載體重命名為pCZN1-FcSPP。

挑取轉(zhuǎn)化平板上測(cè)序正確的陽性克隆菌株接種到TB 培養(yǎng)液（含50 mg·L-1Amp），37 ℃、220 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)過夜；次日按1∶100 比例轉(zhuǎn)接于含Amp 的TB培養(yǎng)液，37 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜；待OD600值在0.6～0.8時(shí)，吸取1 mL培養(yǎng)液經(jīng)離心、棄上清后，加入100 μL上樣緩沖液重懸菌體沉淀，備用；剩余培養(yǎng)物中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl beta-Dthiogalactopyranoside，IPTG）并調(diào)整濃度至0.2 mmol·L-1，15 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，次日吸取1 mL培養(yǎng)液，經(jīng)離心、棄上清后，加入100 μL上樣緩沖液重懸菌體沉淀，備用；剩余培養(yǎng)液經(jīng)離心、棄上清，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）重懸菌體沉淀，重懸液隨后經(jīng)超聲波破碎，分別吸取取上清液和沉淀液體加入上樣緩沖液重懸。采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對(duì)上述重懸液進(jìn)行電泳檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)染色顯帶。

1.2.5 FcSPP 蛋白的制備和純化 將最適IPTG 濃度和溫度條件下誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)菌液，經(jīng)低溫離心后，收集菌體沉淀加入裂解液重懸，重懸液經(jīng)超聲破碎、離心，收集沉淀。使用包涵體洗滌液清洗包涵體3 次，并用溶解緩沖液按一定比例溶解包涵體，4 ℃放置過夜。利用低壓層析系統(tǒng)，將包涵體溶液以0.5 mL·min-1流速上樣至Ni-IDA-Sepharose Cl-6B 親和層析柱，并用Ni-IDA 緩沖液洗脫目的蛋白，收集洗脫液。將洗脫液裝入透析袋，4 ℃環(huán)境下經(jīng)PBS 溶液透析過夜，獲得FcSPP 純化蛋白。采用12% SDS-PAGE 對(duì)上述純化蛋白進(jìn)行電泳檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)染色顯帶檢測(cè)純度，并采用0.5 mg·mL-1牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)純化蛋白進(jìn)行分子量鑒定。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè) 每個(gè)時(shí)期均取1～3號(hào)樣品作為生物學(xué)重復(fù)，分別制備總RNA和反轉(zhuǎn)錄，以FcSPP基因的CDS序列片段設(shè)計(jì)定量表達(dá)引物FcSPP-F和FcSPPR，參照魏清江等［24］已發(fā)表的Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因設(shè)計(jì)引物actin-F 和actin-R（表1），經(jīng)qRT-PCR 檢測(cè)金柑FcSPP基因在果實(shí)發(fā)育4 個(gè)時(shí)期的果肉組織表達(dá)情況。qRT-PCR 擴(kuò)增體系為20μL：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，F(xiàn)cSPP-F 引物1 μL，F(xiàn)cSPP-R 1 μL，cDNA 模板1 μL，RNase-free ddH2O 7μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用2-ΔΔct方法計(jì)算結(jié)果，每個(gè)時(shí)期每個(gè)編號(hào)樣品均重復(fù)測(cè)試3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 金柑FcSPP基因的克隆

根據(jù)前期脆蜜金柑果肉組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，經(jīng)差異表達(dá)分析篩選Uingene 序列（ID：sjg218640）并按該Unigene 預(yù)測(cè)的CDS 序列設(shè)計(jì)引物，以脆蜜金柑果肉組織提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1 200 bp；擴(kuò)增條帶經(jīng)測(cè)序顯示片段長(zhǎng)度為1 191 bp（圖1-A），與預(yù)期結(jié)果基本符合。利用5'-RACE 引物擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為262 bp 的片段，3'-RACE 引物擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為283 bp 的片段（圖1-B）。利用DNAMAN 軟件拼接上述CDS 擴(kuò)增片段、5'-RACE 和3'-RACE 擴(kuò)增片段，獲得金柑FcSPP基因cDNA 全長(zhǎng)序列1 638 bp（圖2）。根據(jù)拼接的cDNA 全長(zhǎng)序列兩端UTR 區(qū)設(shè)計(jì)引物，PCR 擴(kuò)增獲得一條長(zhǎng)度為1 537 bp 的片段（圖1-C 和圖2）。將獲得的片段測(cè)序后與拼接的全程序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，結(jié)果顯示該片段包含基因的ORF 區(qū)域，且UTR 區(qū)域與拼接序列一致，表明成功獲得金柑FcSPP基因cDNA 全長(zhǎng)序列，并將其命名為FcSPP。

圖1 金柑FcSPP基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of FcSPP from Fortunella crassifiolia Swingle

圖2 RACE擴(kuò)增產(chǎn)物拼接的金柑FcSPP基因cDNA全長(zhǎng)序列Fig.2 Full-length cDNA sequence of FcSPP gene in Fortunella crassifiolia Swingle

2.2 金柑FcSPP 基因及編碼蛋白序列的生物信息學(xué)分析

經(jīng)NCBI的ORF Finder分析后，發(fā)現(xiàn)克隆基因含有一個(gè)1 191 bp 的ORF，編碼396 個(gè)氨基酸（圖3）。通過ProParam 在線預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)可知，F(xiàn)cSPP 蛋白分子質(zhì)量為44 519.93，理論等電點(diǎn)（pI）為6.57，包含6 271 個(gè)原子，分子式為C1984H3139N543O590S15，如表2 所示該蛋白序列中數(shù)量排名前三的氨基酸分別為L(zhǎng)eu（9.10%）、Lys（7.80%）、Ser（7.60%），數(shù)量最少的為Cys（1.80%）。帶負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）53 個(gè)，帶正電殘基（Arg+Lys）51 個(gè)，脂肪系數(shù)為88.13，不穩(wěn)定指數(shù)為34.70，總平均親水性值為-0.337，預(yù)測(cè)蛋白為穩(wěn)定的親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，推測(cè)該蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖3），該蛋白中發(fā)現(xiàn)23個(gè)潛在的Ser磷酸化位點(diǎn)、10個(gè)潛在的Thr磷酸化位點(diǎn)和4個(gè)潛在的Tyr 磷酸化位點(diǎn)。二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和無規(guī)則卷曲所占比例較大，分別占比為38.89%和38.64%（圖4-A）。如圖4-B、C 所示，信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示該蛋白的C-MAX為0.173，Y-MAX 為0.161，S-MAX 為0.321，均小于閾值0.5，且跨膜結(jié)構(gòu)分析顯示該蛋白無明顯的疏水區(qū)域和跨膜結(jié)構(gòu)，推測(cè)該蛋白為親水性蛋白。

圖3 金柑FcSPP蛋白的磷酸化位點(diǎn)分析Fig.3 Analysis of phosphorylation sites of FcSPP protein in Fortunella crassifiolia Swingle

圖4 FcSPP蛋白親疏水性、信號(hào)肽和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Hydrophobicity or hydrophilia，signal peptide and secondary structure analysis of FcSPP protein

保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果如圖5-A 所示，金柑FcSPP蛋白含有2 個(gè)屬于植物SPP 家族特征的保守結(jié)構(gòu)域，從N 端到C 端分別為S6PP（殘基9～261）和S6PP_C（殘基262～394）。對(duì)FcSPP 的保守基序（Motif）分析結(jié)果如圖5-B 和圖6 所示，該蛋白的S6PP 保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有3 個(gè)與L-2-鹵代酸脫鹵酶HAD 超家族同源的保守基序，分別為Motif Ⅰ：DLDNTM（殘基15～20）、Motif Ⅱ：LVFSTGR（殘基48～54）和Motif Ⅲ：KG（23x）GDSGND（殘基176～206），其中Motif Ⅰ中D（Asp-15）、L（Leu-16）、D（Asp-17）、H（His-18）和T（Thr-19），Motif Ⅱ的T（Thr-51），Motif Ⅲ的K（Lys-176）、G（Gly-201）、D（Asp-202）、D（Asp-206）均預(yù)測(cè)與HAD 超家族成員的蛋白催化或活性位點(diǎn)的氨基酸殘基同源匹配。

圖5 金柑FcSPP的保守結(jié)構(gòu)域（A）與保守基序（B）分析Fig.5 Conserved domains （A） and conserved motif （B） analysis of FcSPP in Fortunella crassifiolia Swingle

圖6 金柑與其他高等植物的SPP蛋白序列比較分析Fig.6 Comparative analysis of SPP protein sequences between Fortunella crassifiolia Swingle and other higher plants

從NCBI和UniProt數(shù)據(jù)庫中獲得擬南芥（A.thaliana）、水稻（O.sativa）、玉米（Zea mays）、甜橙（Citrus sinensis）等物種的25 個(gè)SPP 蛋白序列，并與克隆基因FcSPP編碼蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，從圖7 可知，F(xiàn)cSPP 蛋白與同為蕓香科柑橘亞科的甜橙（C.sinensis）、克萊門柚（C.clementina）的進(jìn)化關(guān)系最近，首先聚為一支，與擬南芥、蘋果（Malus domestica）、蓖麻（Ricinus communis）、獼猴桃（Actinidia chinensis）等雙子葉植物聚為一個(gè)大分支，親緣關(guān)系較近，而與玉米、甘蔗（Saccharum officinarum）、水稻、大麥（Hordeum vulgare）等單子葉植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。來源于雙子葉植物的SPP蛋白均聚為一大分支，來源于單子葉植物的劃分為另一大分支，表明單子葉植物和雙子葉植物的SPP 蛋白在進(jìn)化過程出現(xiàn)了明顯的分化。為了進(jìn)一步探究單子葉植物和雙子葉植物SPP 蛋白出現(xiàn)明顯進(jìn)化變異的因素，本研究對(duì)供試的26 個(gè)SPP 蛋白分別進(jìn)行了全序列和結(jié)構(gòu)域序列的比對(duì)分析。比對(duì)結(jié)果顯示26 個(gè)SPP 蛋白的全序列比對(duì)平均相似度為72.06%，表明植物SPP 蛋白的氨基酸全長(zhǎng)序列較為保守；而S6PP結(jié)構(gòu)域的平均相似度高達(dá)82.03%，S6PP_C 保守結(jié)構(gòu)域的平均相似度僅為53.94%，故推測(cè)S6PP_C 結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性低于S6PP 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域序列上的突變是導(dǎo)致單子葉植物和雙子葉植物SPP蛋白的進(jìn)化趨勢(shì)出現(xiàn)明顯差異的重要因素。

圖7 金柑與其他高等植物的SPP蛋白進(jìn)化樹分析Fig.7 Evolutionary tree analysis of SPP proteins in higher plants and Fortunella crassifiolia Swingle

2.3 金柑FcSPP基因的原核表達(dá)與蛋白純化

將重組質(zhì)粒pCZN1-FcSPP轉(zhuǎn)化至Arctic Express（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌液PCR 驗(yàn)證和陽性克隆菌株測(cè)序驗(yàn)證，篩選成功插入表達(dá)載體的陽性重組菌株。以空載pCZN1 質(zhì)粒的菌株為陰性對(duì)照，將陽性重組菌株和陰性對(duì)照菌株在最適IPTG 濃度0.2 mmol·L-1和15 ℃溫度誘導(dǎo)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)菌液和菌株破碎裂解后的上清液與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。由圖8-A可知，陰性對(duì)照菌株誘導(dǎo)表達(dá)后菌液和未經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌株菌液在45 kDa 處均無明顯條帶，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌株的菌液及其菌株破碎裂解后收集的上清液與沉淀均在45 kDa處有明顯蛋白條帶，其大小與預(yù)期FcSPP 重組蛋白條帶大小相符合，且收集的沉淀所顯示的條帶單一、明顯，表明重組蛋白主要以包涵體形式存在。隨后對(duì)收集的重組蛋白包涵體進(jìn)行溶解、Ni 親和層析柱洗脫和PBS 溶液透析純化，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品分子量鑒定顯示FcSPP 純化蛋白的分子量為45.96 kDa（圖8-C），與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的分子量相近。

圖8 金柑FcSPP蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化、鑒定Fig.8 Induced expression，purification，and identification of FcSPP protein in Fortunella crassifiolia Swingle

2.4 金柑FcSPP基因的表達(dá)分析

用qRT-PCR 檢測(cè)脆蜜金柑發(fā)育4 個(gè)時(shí)期即初果期（DAF15）、生長(zhǎng)期（DAF60）、膨大期（DAF120）和成熟期（DAF180）的果肉組織中FcSPP基因表達(dá)量。如圖9所示，熔解曲線顯示目的基因FcSPP有一個(gè)特異峰，表明試驗(yàn)所用引物具有較好的特異性，排除了引物二聚體、非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。定量數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，在脆蜜金柑果實(shí)發(fā)育4 個(gè)時(shí)期FcSPP基因相對(duì)表達(dá)量呈逐步上升趨勢(shì)，果實(shí)膨大期、成熟期的基因表達(dá)量顯著高于果實(shí)發(fā)育初期和生長(zhǎng)期（P＜0.05）。

3 討論

3.1 金柑FcSPP蛋白的結(jié)構(gòu)特征

SPP 是生物體蔗糖生物合成途徑的末端酶，具有一個(gè)特征性的磷酸水解酶結(jié)構(gòu)域，廣泛存在于光合細(xì)菌、藍(lán)藻、苔蘚、裸子植物和被子植物［25-27］，依據(jù)結(jié)構(gòu)域種類可將SPP蛋白分為3種類型，低等植物如藍(lán)藻僅含有具備磷酸水解酶功能的S6PP 結(jié)構(gòu)域（Ⅰ型： S6PP），高等植物含有S6PP 結(jié)構(gòu)域和位于C 末端的S6PP_C 結(jié)構(gòu)域（Ⅱ型： S6PP～S6PP_C），而細(xì)菌含有糖基轉(zhuǎn)移酶功能結(jié)構(gòu)域和S6PP 結(jié)構(gòu)域（Ⅲ型：GT～S6PP）［15，28］。本研究基于前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，從脆蜜金柑果實(shí)中成功克隆到1個(gè)磷酸蔗糖磷酸酶基因FcSPP。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，該基因編碼蛋白存在S6PP和S6PP_C這2個(gè)結(jié)構(gòu)域，共含有37個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，表明克隆基因編碼蛋白中含有發(fā)揮磷酸酶/水解酶催化功能的核心元件，屬于高等植物磷酸蔗糖磷酸酶家族成員。前人研究表明，大多數(shù)被子植物存在多個(gè)SPP異構(gòu)體，且不同異構(gòu)體編碼基因的表達(dá)隨植株發(fā)育、組織類型和環(huán)境信號(hào)的變化而變化［25］。在擬南芥［10］、水稻［11］、玉米［3］、小麥［12-13］等作物中均鑒定出多個(gè)SPP 異構(gòu)體。本研究中僅克隆了1個(gè)磷酸蔗糖磷酸酶基因FcSPP，金柑是否還存在其他構(gòu)型的磷酸蔗糖磷酸酶基因FcSPP有待進(jìn)一步研究。

3.2 金柑FcSPP蛋白S6PP_C結(jié)構(gòu)域序列變化的意義

不同植物物種的細(xì)胞內(nèi)蔗糖代謝水平存在明顯差異，造成這種差異可部分歸因于SPP、SPS 等參與蔗糖生物合成的關(guān)鍵酶在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)中的活性、穩(wěn)定性、pH值的變化，而這些變化又由關(guān)鍵酶基因及其編碼蛋白的序列變化差異造成的［15］。前人研究認(rèn)為，植物SPP的S6PP 結(jié)構(gòu)域是由共同的細(xì)菌祖先通過基因分裂和融合進(jìn)化而來，作為催化活性中心的S6PP結(jié)構(gòu)域?yàn)榫S持其催化機(jī)制、空間結(jié)構(gòu)折疊穩(wěn)定的需求，在跨物種間的進(jìn)化速率較低，而S6PP_C結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化上形成的時(shí)間晚于S6PP 結(jié)構(gòu)域，兩者的進(jìn)化壓力存在較大差異，S6PP_C 結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出較高的序列變化率［15，29］。本研究中金柑、擬南芥、水稻等17個(gè)物種的26個(gè)SPP蛋白，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中可劃分為單子葉植物和雙子葉植物兩大類，而這兩大類SPP 蛋白的S6PP_C 結(jié)構(gòu)域的序列相似度明顯低于S6PP結(jié)構(gòu)域，推測(cè)單子葉和雙子葉植物的SPP蛋白在進(jìn)化上的進(jìn)化速率與方向出現(xiàn)分化，主要來自于S6PP_C 結(jié)構(gòu)域序列變化的影響。此外，Tomás等［10］將擬南芥SPP2 （Q9SJ66）蛋白的S6PP_C 結(jié)構(gòu)域去除后，形成的單體酶且活性顯著低于完整的SPP2蛋白，并將藍(lán)藻（Synechocystissp.PCC 6803）SPP（僅含有S6PP 結(jié)構(gòu)域）與去除了S6PP_C 結(jié)構(gòu)域的擬南芥SPP2蛋白進(jìn)行重組融合，經(jīng)凝膠過濾和BiFC 分析發(fā)現(xiàn)S6PP_C 可促進(jìn)融合蛋白的二聚化。推測(cè)植物SPP 蛋白的S6PP_C 結(jié)構(gòu)域可能通過氨基酸殘基的變化影響SPP的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響酶活力變化。

3.3 金柑FcSPP基因在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)變化

擬南芥［10］、水稻［11］、玉米（Z.mays）［3］、小麥（T.aestivum）［12-13］、芒果（Mangifera indicaL.）［30］、辣椒（Capsicum annumm）［31］、橡膠樹（Hevea brasiliensis）［32］等植物中已鑒定的SPP基因表達(dá)模式研究顯示，該基因表達(dá)水平在植物不同組織和發(fā)育過程中存在明顯的變化。此外，前人研究表明植物中的SPP 活性與SPS 活性相似，兩者有可能相互結(jié)合形成一個(gè)多酶復(fù)合體，提高蔗糖-6-磷酸的合成速率，在蔗糖合成過程中發(fā)揮著重要作用［9-10］。本研究克隆的FcSPP基因，在金柑果實(shí)從初果期到成熟期的表達(dá)量呈現(xiàn)逐步上升趨勢(shì)，膨大期和成熟期的表達(dá)量顯著高于初果期和生長(zhǎng)期，推測(cè)克隆的FcSPP基因可能參與調(diào)控了金柑果實(shí)中后期的糖代謝和分配過程，從而影響果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育。但金柑的SPP和SPS基因編碼蛋白之間是否可形成復(fù)合體或存在互作關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究從脆蜜金柑果肉中成功克隆到1 個(gè)磷酸蔗糖磷酸酶基因FcSPP，可在異源的大腸桿菌中順利誘導(dǎo)表達(dá)，為后期開展細(xì)胞工程制備SPP 蛋白酶提供了可用的目標(biāo)基因。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了可能影響金柑FcSPP 蛋白催化效率的10 個(gè)活性殘基位點(diǎn)D（Asp-15）、L（Leu-16）、D（Asp-17）、H（His-18）、T（Thr-19）、T（Thr-51）、K（Lys-176）、G（Gly-201）、D（Asp-202）和D（Asp-206）；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明負(fù)責(zé)SPP 蛋白二聚化作用的S6PP_C 結(jié)構(gòu)域的堿基突變頻率較高，對(duì)SPP 蛋白的酶活力變化具有重要影響。故而后期開展金柑FcSPP基因的基因編輯等工程研究中，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注上述活性位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域序列堿基突變區(qū)域。