60Co-γ輻射誘變李新品種福紅的差異性狀及果實品質分析

周丹蓉 葉新福 方智振 林炎娟 陳文光

（福建省農業(yè)科學院果樹研究所，福建 福州 350013）

李（Prunus salicinaLindl.）為薔薇科李屬多年生喬木果樹，世界上重要的核果類果樹之一。我國李占全球李生產的70%以上，從南到北皆有種植，而華東、華南、西南等產區(qū)的李種植面積和產量均占全國的60%以上［1］，是我國李的主產區(qū)。近年來，李果不僅對豐富果品市場發(fā)揮了重要作用，而且市場價位持續(xù)走高，成為很多地區(qū)農村鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的支柱產業(yè)，市場前景廣闊。

福建是南方李的主產區(qū)，有700 多年的種植歷史，其面積和產量均居福建省落葉果樹之首。目前，福建李的主栽品種仍為傳統(tǒng)品種芙蓉李，其為鮮食與加工兼用優(yōu)良品種，但該品種需冷量較高（660～720 h，猶他模型）［2］，需在冬季經歷足夠的低溫期才能解除休眠并正常開花結果。需冷量是限制李等落葉果樹種植分布的關鍵因素［3-5］，而隨著全球氣候變暖加劇，暖冬現(xiàn)象頻發(fā)，芙蓉李在福建低海拔地區(qū)已無法正常開花結果，嚴重影響了種植效益。目前，冬季低溫不足已逐漸成為影響福建乃至我國南方李產業(yè)發(fā)展的重要問題，選育需冷量低的品種是保障我國南方李產業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的關鍵。

三月李是從三華李類群中馴化選擇出的紅皮黃肉類栽培種［1，6］，在福建漳州、福州等地均有種植。有研究指出，三月李具有耐高溫、需冷量低等特點［1，7-8］，在北回歸線低海拔地區(qū)都可栽培；三月李成熟期早，在福建福州5月下旬至6月上旬即可成熟，是福建省內成熟期最早的李品種；但三月李果小、可溶性固形物含量低、味酸，鮮食品質較差。若能通過三月李選育得到需冷量低、早熟、鮮食品質優(yōu)異的新品種，不僅可成為低海拔地區(qū)芙蓉李的替代品種，又可與芙蓉李錯開上市期，將對推動福建李產業(yè)發(fā)展具有重要意義。

在育種方法上，除傳統(tǒng)的雜交育種外，輻射誘變育種是育成新品種的重要方法，其中60Co-γ 是輻射誘變中最常見的輻射源［9］，并在果樹育種中取得了明顯的效果［10］。鑒于此，本研究采用輻射育種技術，選擇低需冷量、早熟的品種三月李的成熟1 年生枝為材料進行60Co-γ 輻射（50 Gy），通過表型鑒定篩選優(yōu)異變異株，以期選育適宜在福建及南方相似生態(tài)區(qū)推廣種植的優(yōu)質李新品種，助力李產業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇低需冷量、早熟的品種三月李的成熟一年生枝為材料進行60Co-γ輻射，輻射劑量為50 Gy；輻射后，取單芽嫁接，砧木為3年生實生毛桃；高接樹結果后發(fā)現(xiàn)一株果色、成熟期等發(fā)生明顯變異的突變株。以該突變株福紅及三月李為材料，進行差異性狀和果實品質分析和評價。

1.2 形態(tài)特征與生物學特性鑒定

根據(jù)《李種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》［11］、《GB/T 19557.8-2004 植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 李》［12］對福紅及三月李植物形態(tài)特征、農藝性狀、品質性狀等方面的性狀進行觀測、描述、記載，分析其相似性及差異。

1.3 低需冷量調控基因的驗證

對三月李基因組的研究發(fā)現(xiàn)，PsDAM6是控制李需冷量性狀的關鍵基因，該基因的低表達是決定三月李花芽低需冷量的關鍵，且該基因的第五個外顯子存在一個長片段插入，導致外顯子缺失［7］。為確定福紅是否保留了PsDAM6第五個外顯子的插入片段，根據(jù)三月李PsDAM6序列將插入片段分為3 個帶有重疊區(qū)域的片段，并設計引物（表1）進行擴增。隨后，采用I-5 2X High-Fidelity Master Mix （MCLAB，美國）進行片段擴增和測序。PCR 體系參照說明書，PCR 擴增條件為：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)。

1.4 品質特性鑒定

利用HP-200 色差儀（3nh 310，深圳）記錄福紅及三月李果皮果肉顏色信息，測定L*、a*、b*、C*。亮度值L*越大，樣品表面越亮；a*表示紅綠偏差，數(shù)值越大越紅；b*表示藍黃偏差，數(shù)值越大越黃；色澤飽和度C*值越大，代表果皮色彩越鮮明，反之越黯淡?；ㄉ蘸坎捎胮H 值示差法測定［13］。福紅及三月李的單果質量、可食率、可溶性總糖、還原糖、蔗糖、總糖、抗壞血酸、可滴定酸、可溶性固形物含量及固酸比等指標的數(shù)據(jù)采集和整理均參照《李種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》［11］。顏色信息每個品種測定50 個果實后取平均值；單果質量、可食率每個品種取15 個果實測定后取平均值；其他指標由每個品種取10 個果實混合榨汁過濾后測定。

1.5 抗病性鑒定

褐腐病、炭疽病、煤煙病、細菌性穿孔病、紅點病等由區(qū)試點田間觀察鑒定。2021—2022 年，在福建省福州市永泰縣蓋洋鄉(xiāng)前湖村開展抗病性調查，隨機選取3 株，從每株樹東南西北四面及上中下部隨機取樣調查，其中葉片共抽取100片、果實抽取50個。果實主要調查褐腐病、炭疽?。蝗~片主要調查煤煙病、炭疽病、細菌性穿孔病以及紅點病。試驗地株行距3.5 m×3.5 m，樹形為自然開心形。2 月底謝花，4 月先后兩次進行疏果，4 月底施壯果肥，株施均衡型復合肥1 kg。整形修剪以疏除直立旺枝為主，保證樹體通風透光。冬季修剪、深翻、刷白；日常及時人工割除田間雜草，保證園內通透。

1.6 產量表現(xiàn)

選擇排灌良好、土壤肥力好、通風透光的李園，小苗定植時定植穴0.8 m×0.8 m×0.6 m，每穴施入25 kg的有機肥做基肥。大樹高接換種嫁接部位在二級分枝以上，一般離地面高70～80 cm，株嫁接芽數(shù)3～5個。試驗植株均采用開心形樹形，常規(guī)管理。

福建省福州市永泰縣蓋洋鄉(xiāng)前湖村于2018 年采用小苗種植的方式種植福紅李，株行距3.5 m×3.5 m；對照三月李30株，株行距3.5 m×3.5 m。

福建省漳州市長泰區(qū)枋洋鎮(zhèn)枋洋村于2015 年采用高接換種的方式，在7年生珠李上高接福紅李，株行距3.5 m×4.5 m；高接對照三月李20株，株行距3.5 m×4.5 m。

福建省南平市順昌縣埔上鎮(zhèn)河墩村于2017 年小苗種植福紅李，株行距3 m×3.5 m（約60 株/畝）；種植對照三月李株50株，株行距3 m×3.5 m。

測定產量時，隨機選取3株進行測定。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應用Excel 2007 軟件對數(shù)據(jù)進行初始記錄、平均值計算；利用SPSS 12.0 軟件進行方差分析、并采用Duncan’s 新復極差法（sum of squares of the regression，SSR）進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 李新品種福紅選育

2012年5月，以需冷量低、早熟的品種三月李成熟一年生枝為材料進行60Co-γ 射線輻射，輻射劑量為50 Gy。輻射后，取單芽在三年生毛桃上高位嫁接84株，用于芽變選種。2013 年成活的嫁接株部分開花，均未結果；2014 年嫁接株部分開花并有少量果，觀察發(fā)現(xiàn)其中一株的成熟期、果實顏色等均發(fā)生明顯變異，表現(xiàn)為成熟期推遲40 d左右，果皮顏色由紅色變?yōu)樽霞t色、果肉顏色由黃色變?yōu)樽霞t色；該變異株編號為141，初定名為南方李141。

2015—2016年，在福州福建省農業(yè)科學院果樹研究所基地種植，對南方李141進行跟蹤觀察，南方李141果實成熟期為7月上中旬，三月李為6月上旬；南方李141果皮為紫紅色，果肉為紫紅色，三月李果皮為紅色、果肉為淡黃色。課題組將南方李141命名為福紅（圖1）。

圖1 李新品種福紅Fig.1 Mature fruit of Fuhong plum

2015 年起，先后在福建省福州市永泰縣、漳州市長泰區(qū)、南平市順昌縣、三明市建寧縣、泉州市南安縣、寧德市古田縣、寧德市壽寧縣等地，以及貴州、廣西、云南、廣東、重慶、江西等省（區(qū)、市）采用小苗種植、高接等方式進行試驗，系統(tǒng)開展福紅李生物學特征特性觀察、區(qū)域生態(tài)適應性研究、果實分析鑒評及配套栽培技術研究等。2018—2021年，在試驗點隨機選擇福紅李與三月李作為觀察記載樹，重點觀察植物學特征特性、物候期、果實經濟性狀，在果實成熟期隨機取樣進行果實品質測定與分析，重點檢測果實單果質量、可溶性固形物、總糖、還原糖、蔗糖、可滴定酸、Vc等指標。根據(jù)區(qū)試結果，福紅李在各試驗點均表現(xiàn)出質優(yōu)、早結、豐產等優(yōu)點。

2021年，福紅獲植物新品種權（CNA20191004821），通過全國熱帶作物品種審定（熱品審2022009）、福建省林木良種審定（閩S-SV-PS-017-2021）、貴州省非主要農作物品種認定（黔認果2021004）。

2.2 福紅形態(tài)特征與生物學特性

2.2.1 福紅與三月李形態(tài)特征與生物學特性比較 對福紅及三月李植物形態(tài)特征、農藝性狀、品質性狀等三個方面的必測性狀進行觀測、描述，分析其相似性及差異，結果見表2。由結果可知，福紅在樹姿、枝條、葉、花、果核等多方面的形態(tài)均與三月李相似，無明顯差異性。對照《GB/T 19557.8-2004 植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 李》中關于品種特異性的要求，對福紅與三月李的性狀進行分析，差異主要表現(xiàn)在果實大小、果色、果實起始成熟時間等方面，具體表現(xiàn)為：福紅果實大小中等，而三月李果實大小為極小到?。桓＜t果皮基色黃綠、蓋色紫紅，果肉顏色紫紅，三月李果皮基色黃、蓋色紅，果肉顏色黃；福紅果實起始成熟時間為早到中，三月李為極早。

表2 福紅與三月李主要性狀比較Table 2 Comparison of main characters between Fuhong and Sanyueli

2.2.2 福紅與三月李物候期比較 進一步對兩者的物候期進行對比（表3），在福州種植，福紅始花期為1月下旬，盛花期為2月上中旬，落花期為2月下旬；展葉期為3 月上旬，落葉期為12月中下旬；鮮食成熟期為7月上中旬。三月李與福紅的開花時間相近，但兩者的果實成熟期相差40 d左右。

表3 福紅與三月李的物候期比較Table 3 Comparison of the phenological period between Fuhong and Sanyueli

2.2.3 福紅與三月李的果實色澤分析 由圖3 可知，三月李在6 月上旬已完全成熟，此時福紅幾乎還未開始轉色，福紅的成熟期比三月李晚40 d 左右。對福紅與三月李發(fā)育過程中果實的花色苷含量進行測定和分析，其變化趨勢見圖4。由結果可知，福紅和三月李在成熟過程中，果皮中的花色苷均呈逐漸增加趨勢，到完全成熟時達到最大值，且在完全成熟時，三月李果皮中的花色苷含量高于福紅；由于福紅的成熟期較三月李大幅推遲，在三月李完全成熟時，福紅果皮還未開始轉色，因此在早期的福紅果皮中未檢測到花色苷。在果肉中，三月李中的花色苷幾乎檢測不到，與果皮相似，在三月李完全成熟時，福紅果肉還未開始轉色，其果實中未檢測到花色苷；隨著福紅果肉逐漸呈紅色，其花色苷的含量逐漸增加。

圖3 福紅與三月李果實發(fā)育情況對比Fig.3 Comparison of fruit development between Fuhong and Sanyueli

圖4 福紅和三月李成熟過程中花色苷含量的變化Fig.4 Changes of anthocyanins content during ripening process of Fuhong and Sanyueli

進一步取福紅和三月李成熟果實，利用色差計測定其果皮色澤和果肉色澤（圖5）。從果皮來看，在色澤亮度L*上，福紅果皮的對應值較大，且極顯著高于三月李（P＜0.01），即福紅果皮表面較亮；在紅綠色差a*上，三月李果皮的對應值極顯著高于福紅（P＜0.01），表明三月李成熟果實果皮更紅；在藍黃色差b*上，兩者的對應值均較小且差異不顯著（P＞0.05），表明兩者果皮的黃色均不明顯；在色澤飽和度C*上，三月李果皮對應的值極顯著高于福紅（P＜0.01），果皮顏色的色彩更鮮艷。從果肉來看，福紅的a*、C*值均較高，且a*值極顯著高于三月李（P＜0.01），表明福紅果肉色澤更紅艷；而三月李b*值較高且a*值極顯著高于福紅（P＜0.01），表明三月李果肉色澤以黃色為主；兩者果肉色澤的亮度也有差異，表現(xiàn)為三月李較亮。

圖5 福紅與三月李成熟果實的色澤Fig.5 Chromatic values of Fuhong and Sanyueli at ripening stages

2.3 福紅低需冷量調控基因的驗證

低需冷量調控基因PsDAM6的第五個外顯子插入片段在福紅中的驗證結果見圖6。由結果可見，福紅完整保留了三月李需冷量相關基因PsDAM6第五個外顯子上的長片段插入序列。

圖6 福紅PsDAM6外顯子5長片段插入序列驗證Fig.6 Confirmation of the long insertion in exon5 of PsDAM6 in Fuhong plum.

2.4 福紅品質特性鑒定

2.4.1 福紅與三月李主要品質特性比較 根據(jù)《李種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》［11］，對福紅及三月李的主要品質特性進行比較，結果見表4。福紅總體表現(xiàn)為果實整齊度好，果肉顏色紫紅、汁多、松脆，風味酸甜可口，澀味無，纖維少，鮮食品質上。其綜合品質特性優(yōu)于三月李。

表4 福紅與三月李主要品質特性比較Table 4 Comparison of quality characteristic between Fuhong and Sanyueli

2.4.2 福紅與三月李品質指標比較 糖酸含量的差異是影響福紅與三月李鮮食品質和口感差異的重要原因。由圖7 可知，隨著果實成熟，兩者可溶性固形物含量不斷增加，但福紅增加的幅度遠大于三月李。至完全成熟時，福紅的單果質量可達48.30 g，三月李的單果質量僅為18.10 g，果實增大了2.67 倍。福紅可溶性固形物含量14.20%，而三月李可溶性固形物含量僅為11.40%，提高2.80 個百分點。取二者的成熟果進行其他品質成分的測定，結果見表5，福紅總糖（以葡萄糖計）為9.96%，可溶性糖（以葡萄糖計）為9.94%，蔗糖為3.45%，還原糖（以葡萄糖計）為6.31%，Vc 為2.30 mg·100 g-1，這些指標均高于三月李；福紅可滴定酸（以蘋果酸計）含量為0.80%，低于三月李的0.95%；福紅的糖酸比遠高于三月李。這些指標中，福紅的單果質量、可溶性總糖、還原糖、總糖、可溶性固形物含量、糖酸比均極顯著高于三月李（P＜0.01）。

圖7 福紅和三月李成熟過程中單果質量和可溶性固形物含量的變化Fig.7 Changes of fruit mass and soluble solids content during ripening process of Fuhong and Sanyueli

表5 福紅品質測試結果Table 5 Quality test report of Fuhong and Sanyueli

2.5 福紅抗病性分析

福紅在永泰縣蓋洋鄉(xiāng)前湖村正常管理情況下表現(xiàn)出較好的抗性（表6），果實病害僅有輕微的褐腐病發(fā)生，未見炭疽病的發(fā)生；葉片有輕微的煤煙病，零星有細菌性穿孔病、紅點病發(fā)生。

2.6 福紅產量分析

福紅在福建省各區(qū)試點的產量表現(xiàn)見表7。從結果可知，在2019—2021年各試驗點的產量比較中，福紅李的產量均高于對照品種，表現(xiàn)出較好的豐產性。對福紅李在不同區(qū)試點的比較結果可知，在相同樹齡情況下，各試驗點的產量有差異，4 年生樹在永泰株產為40 kg，在長泰為34.3 kg，在順昌為35.3 kg；5年生樹在長泰為48.3 kg，在順昌為46.1 kg；6 年生樹株產可達51.4 kg；各地歷年產量表現(xiàn)均高于相同樹齡的三月李。

3 討論

輻射誘變育種技術是指利用X 射線、γ 射線、β 射線及中子等物理因素誘導生物體遺傳物質發(fā)生變異，從中篩選優(yōu)異突變體，進而育成新品種的育種方法。20 世紀80—90 年代，60Co-γ 輻射誘變技術已在蘋果、柑橘、梨、山楂等果樹育種中取得了一定的效果，獲得了一批具有特異性狀的新品種［10，14-15］。此后，由于輻射誘變的突變方向難掌握、突變體的篩選和鑒定技術不完善、突變性狀難以穩(wěn)定遺傳等因素的影響，該技術在果樹育種上的發(fā)展速度有所放緩［16-18］，僅在柑橘［19-21］、梨［22］、獼猴桃［23］等樹種上有較多報道。但是，輻射誘變育種技術也具有提高突變頻率、縮短育種年限等優(yōu)勢，仍廣受育種者青睞，是重要的育種手段。

本研究選擇60Co-γ 誘變選育李新品種，育種材料的選擇是本研究關注的重點。為使選育的品種適應南方李產區(qū)的氣候條件，選擇需冷量低的三月李作為材料進行研究。選育出的福紅在生產試驗中表現(xiàn)出和三月李相似的低需冷量特性，而低需冷量調控基因的驗證結果為保留這一性狀奠定了遺傳基礎。通過對福紅進行形態(tài)學、生理生化、品質分析等鑒定發(fā)現(xiàn)，福紅在色澤、大小和成熟期等性狀上發(fā)生了明顯且能穩(wěn)定遺傳的變異，多數(shù)變異的表現(xiàn)優(yōu)于三月李，這為南方李產業(yè)的發(fā)展提供了良好的品種支撐。

目前，李的栽培品種多以黃肉為主，優(yōu)質紅肉品種較少。李果實紅色是由花色苷的種類和含量決定的，花色苷不僅是決定李果實顏色的天然色素，更是具有抗氧化、抗凝血等多種作用的生物活性物質［24-25］，因此，培育富含花色苷的紅肉李品種也是李育種領域的一大熱點。本研究中，與三月李相比，福紅性狀差異的表現(xiàn)之一為色澤的改變，果皮色澤、果肉色澤均為紫紅色；花色苷含量的測定結果也表明福紅中花色苷含量更高，可見色澤的變異是具有重要價值的優(yōu)異突變。目前，關于誘變導致果實色澤變異的品種尚鮮見報道。Fang等［26-27］對控制李果實花色苷合成的基因進行了研究，指出轉錄因子PsMYB10.2對李果肉花色苷合成具有調控作用；進一步研究發(fā)現(xiàn)，該轉錄因子和花色苷合成基因的表達量在福紅成熟過程中顯著提高，而在三月李中表達量較低，可知PsMYB10.2 是引起二者果肉色澤差異的主要轉錄因子。但輻射如何導致福紅和三月李中轉錄因子PsMYB10.2的差異表達還需進一步研究。

由于輻射誘變育種不定向變異的特性，果實大小、成熟期等易于發(fā)現(xiàn)的性狀也是學者關注的重點。已有報道中，60Co-γ 輻射后甜橙、山楂、蘋果等的成熟期推遲，表現(xiàn)為早熟突變［10］，而福紅相對于三月李則為大果、晚熟。在前期的研究中，方智振等［28］研究了Aux/IAA 家族基因在福紅及三月李果實成熟過程中的表達模式，發(fā)現(xiàn)PsIAA19 和PsIAA25 在福紅果肉中的表達量高于三月李果肉中的表達量，推測其可能參與了果實大小調控，是引起果實大小差異的重要基因；同時也發(fā)現(xiàn)PsIAA11 和PsIAA13 在三月李果肉中的表達量隨著果實的成熟而迅速上升，但在福紅果肉中的表達量始終維持在很低的水平，不過，這兩個基因表達模式的差異是否與果實成熟期變異有關還有待進一步探討。

福紅是通過60Co-γ 輻射育種選育的李新品種，但目前對福紅的研究還停留在形態(tài)學觀察、生理生化鑒定、簡單的分子標記［29］以及色澤變異機理［26-27］等方面，對其誘變發(fā)生的機理、遺傳機制、突變基因鑒定等方面還有待進一步深入研究。

4 結論

通過60Co-γ輻射育種選育的李新品種福紅與輻射材料三月李相比，具有果大、紅皮紅肉等優(yōu)點，并保留了三月李低需冷量的特性，適應范圍廣；福紅的成熟期比三月李晚40 d 左右，較長的果實發(fā)育期有利于內含物質的積累，福紅在可溶性固形物含量、糖酸比等方面均優(yōu)于三月李，形成了優(yōu)良的鮮食品質。福紅在福建不同生態(tài)區(qū)的試驗結果均表現(xiàn)出豐產穩(wěn)產的特性，抗性較強，綜合表現(xiàn)優(yōu)異，具有較好的市場推廣前景。