結(jié)腸癌患者血清miR-370-3p、ANO1表達(dá)變化及其臨床意義

張樂，李昊澤，劉凱東，白月奎

北京市海淀醫(yī)院普外科，北京 100091

近年來，結(jié)腸癌發(fā)病率較直腸癌有增多趨勢，尤其在41～65 歲人群中［1-2］。腹腔鏡手術(shù)是治療結(jié)腸癌的有效手段，但仍有部分患者術(shù)后復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者預(yù)后［3］。術(shù)后殘留腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展是結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的重要原因［4］。研究表明，微小RNA（miRNA）能調(diào)控多種靶基因參與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展［5］。miR-370-3p 是一種與腫瘤相關(guān)miRNA，其異常表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲有關(guān)［6］。有研究證實，miR-370-3p 與急性髓系白血病復(fù)發(fā)有關(guān)［7］。茴香胺1（ANO1）是一種鈣激活氯通道蛋白，能通過激活多條信號通路促進(jìn)結(jié)腸癌惡性進(jìn)展［8］，且與非小細(xì)胞肺癌復(fù)發(fā)有關(guān)［9］。本研究探討血清miR-370-3p、ANO1 表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征及術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，以期為改善患者預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年12月本院收治的94 例結(jié)腸癌患者為結(jié)腸癌組，均接受腹腔鏡手術(shù)治療，男55例、女39例；年齡42～75（59.75 ±8.42）歲；腫瘤最大徑≥5 cm 26 例、＜5 cm 68 例；腫瘤分化程度：低分化41 例、中高分化53 例；TNM 分期［10］：Ⅰ期25 例、Ⅱ期16 例、Ⅲ期42 例、Ⅳ期13 例；侵犯漿膜36 例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢查確診為結(jié)腸癌，符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［10］；初次確診；具備腹腔鏡術(shù)適應(yīng)證（TNM分期Ⅰ～Ⅲ期根治性切除手術(shù)、Ⅳ期局部根治性手術(shù)）［11］。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院前已接受抗腫瘤治療患者；年齡＜18 歲患者；院內(nèi)死亡患者；合并其他部位惡性腫瘤患者；腹腔鏡術(shù)禁忌證（不能耐受二氧化碳?xì)飧?、妊娠期、?yán)重心肝腎疾病不能耐受手術(shù)、術(shù)前不能糾正的全身狀況不良、合并急性梗阻或穿孔）患者［12］；合并急慢性感染患者；合并血液系統(tǒng)損害患者；拒絕隨訪或失訪患者。同期另選取50例結(jié)腸息肉患者為良性病變組，男29例、女21 例；年齡27～75（57.50 ± 9.39）歲。選取同期50名健康體檢者為對照組，男28例、女22例；年齡18～72（56.80 ± 11.10）歲。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；各項生理指標(biāo)檢測正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：有腫瘤病史者；近期使用血液制品者；既往心、肝、腎等重要臟器功能損害者。三組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。各組患者或家屬知情同意，且簽署知情同意書；本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 血清miR-370-3p、ANO1 表達(dá)檢測 采用實時熒光PCR法。收集結(jié)腸癌組術(shù)前和良性病變組、對照組體檢時空腹靜脈血3 mL，3 000 r/min 離心10 min（半徑10 cm），留取血清，TRIzol試劑盒（沈陽萬類生物科技有限公司）提取血清總RNA，微量分光光度計（武漢艾維斯特科技有限公司）鑒定RNA濃度和純度合格后，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（廣州東盛生物科技有限公司）合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 1 h、80 ℃ 5 s。用實時熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL：cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、2×TransStart?Top Green qPCR SurperMix 10 μL、無核酸酶水8.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃30 s、72 ℃ 15 s 循環(huán)40 次。分別以U6 和GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計算血清miR-370-3p、ANO1 相對表達(dá)量。miR-370-3p上游引物序列5'-GCCTGCTGGGGTGGAACCTGGT-3'，下游引物序列5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；U6上游引物序列5'-CGCAAGGATGACACGCAAAT-3'，下游引物序列5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；ANO1上游引物序列5'-CAGGCGGTGCCTATGTCTCA-3'，下游引物序列5'-GCTCCTCCACTTGGTGGTTT-3'；GAPDH 上 游 引 物 序 列5'-GACCTGACCTGCCGTCTAG-3'，下游引物序列5'-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3'。

1.3 術(shù)后復(fù)發(fā)統(tǒng)計及分組 結(jié)腸癌患者入院后均參考《腹腔鏡結(jié)直腸癌根治術(shù)操作指南（2018版）》［11］接受腹腔鏡手術(shù)治療，術(shù)后通過門診復(fù)查或電話進(jìn)行定期隨訪，以手術(shù)時間為起點(diǎn)隨訪3年（第1 年3 個月/次，后2 年6 個月/次），隨訪至復(fù)發(fā)或2022年12月。術(shù)后復(fù)發(fā)定義為術(shù)后出現(xiàn)新的腫瘤，包括腹腔、盆腔、淋巴結(jié)等局部復(fù)發(fā)和肝、腦、骨、肺等遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)，經(jīng)病理檢查或增強(qiáng)CT、磁共振成像、超聲等影像學(xué)檢查確診。隨訪3 年，97 例結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)31例（復(fù)發(fā)組）、未復(fù)發(fā)63例（未復(fù)發(fā)組）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS28.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗；在線網(wǎng)站TargetScan（https：//www.targetscan.org/vert_80/）預(yù) 測miR-370-3p 與ANO1 的 靶 向 關(guān)系；Pearson 相關(guān)法分析結(jié)腸癌患者血清miR-370-3p與ANO1 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性；用單因素與多因素Logistic回歸分析結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素；用受試者工作特征（ROC）曲線分析血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 對結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值，曲線下面積比較用Delong 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 表達(dá)比較 見表1。

表1 三組血清miR-370-3p、ANO1 mRNA表達(dá)比較（± s）

表1 三組血清miR-370-3p、ANO1 mRNA表達(dá)比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與良性病變組比較，#P＜0.05。

組別結(jié)腸癌組良性病變組對照組P ANO1 mRNA 1.64 ± 0.33*#1.14 ± 0.23 1.14 ± 0.21＜0.05 n 94 50 50 miR-370-3p 0.74 ± 0.17*#1.23 ± 0.23 1.27 ± 0.16＜0.05

2.2 結(jié)腸癌患者血清miR-370-3p與ANO1 mRNA表達(dá)的關(guān)系 在線網(wǎng)站TargetScan 預(yù)測miR-370-3p 與ANO1在649～655和676～682處有結(jié)合位點(diǎn)。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者血清miR-370-3p 與ANO1 mRNA中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.609，P＜0.05）。

2.3 血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 見表2。

表2 血清miR-370-3p、ANO1 mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌患者病理特征的關(guān)系（± s）

表2 血清miR-370-3p、ANO1 mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌患者病理特征的關(guān)系（± s）

臨床病理特征性別n miR-370-3pimages/BZ_7_1783_1060_1800_1116.png± s P ANO1 mRNAimages/BZ_7_1783_1060_1800_1116.png± s P＞0.05＞0.05男女年齡55 39 0.74 ± 0.17 0.73 ± 0.18 1.66 ± 0.33 1.62 ± 0.34＞0.05＞0.05≥60歲＜60歲腫瘤最大徑45 49 0.72 ± 0.16 0.75 ± 0.19 1.66 ± 0.28 1.63 ± 0.38＞0.05＞0.05≥5 cm＜5 cm分化程度26 68 0.70 ± 0.15 0.75 ± 0.18 1.3 ± 0.32 1.61 ± 0.33＜0.05＜0.05低分化中高分化TNM分期41 53 0.68 ± 0.15 0.78 ± 0.18 1.73 ± 0.31 1.58 ± 0.34＜0.05Ⅰ～Ⅱ期＜0.05Ⅲ～Ⅳ期侵犯漿膜41 55 0.78 ± 0.17 0.70 ± 0.17 1.54 ± 0.31 1.72 ± 0.34＜0.05＜0.05有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36 58 0.67 ± 0.15 0.78 ± 0.18 1.76 ± 0.31 1.57 ± 0.33＜0.01＜0.01有無39 55 0.66 ± 0.14 0.79 ± 0.18 1.78 ± 0.31 1.54 ± 0.31

2.4 結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素

2.4.1 單因素分析結(jié)果 腫瘤分化程度、TNM 分期、侵犯漿膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-370-3p、ANO1 mRNA 均為結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素（P均＜0.05）。見表3。

表3 結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素的單因素分析

2.4.2 多因素分析結(jié)果 以單因素分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義因素為自變量，術(shù)后復(fù)發(fā)（是/否=1/0）為因變量，多因素Logistic回歸分析顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、侵犯漿膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和ANO1 mRNA≥1.64為術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素，miR-370-3p≥0.74 為獨(dú)立保護(hù)因素（P均＜0.05）。見表4。

表4 結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.5 血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 對結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值 ROC 曲線分析顯示，血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 聯(lián)合預(yù)測結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的曲線下面積（0.876）大于二者單獨(dú)預(yù)測的曲線下面積（0.786、0.783），比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表5。

表5 血清miR-370-3p、ANO1 mRNA對結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值

3 討論

miRNA 是一類新興表觀遺傳調(diào)控分子，能通過引發(fā)信使RNA（mRNA）的降解或轉(zhuǎn)錄后基因沉默，進(jìn)而參與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程［5］。miR-370-3p 是人染色體14q32.31上的一個miRNA，王曉欣等［12］研究報道，下調(diào)miR-370-3p 能靶向叉頭盒蛋白M1 抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。JIA 等［13］研究報道，上調(diào)miR-370-3p 表達(dá)能靶向Y 染色體性別決定區(qū)盒轉(zhuǎn)錄因子4抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和糖酵解。上述研究表明，miR-370-3p 在不同腫瘤中均發(fā)揮作用。LIU 等［6］利用大數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)發(fā)現(xiàn)，miR-370-3p異常表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)展有關(guān)。同時有研究報道，miR-370-3p 異常表達(dá)與急性髓系白血病和乳腺癌復(fù)發(fā)有關(guān)［7，14］。因此推測miR-370-3p 可能與結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者血清miR-370-3p 表達(dá)降低，與分化程度、TNM分期、侵犯漿膜和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，miR-370-3p≥0.74 是術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立保護(hù)因素，說明血清miR-370-3p低表達(dá)參與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展，miR-370-3p高表達(dá)可降低術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險，分析原因可能是miR-370-3p 高表達(dá)能下調(diào)三結(jié)構(gòu)域蛋白14，通過抑制新生血管形成為術(shù)后殘留腫瘤病灶提供生長所需養(yǎng)分，抑制殘留腫瘤病灶持續(xù)增殖和分化，進(jìn)而降低結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險［15］。

碘離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的非碘轉(zhuǎn)運(yùn)功能對腫瘤發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要，其異常表達(dá)可調(diào)節(jié)核因子-κB、絲裂原活化蛋白激酶、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白、Wnt/β-連環(huán)蛋白等信號通路，進(jìn)而調(diào)控腫瘤增殖、分化、遷移、浸潤、復(fù)發(fā)、耐藥等過程［8］。ANO1 是一種分布于甲狀腺、腸胃、肝臟、腎臟、肺臟等多種組織中的碘離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，又稱跨膜蛋白16A，其非碘轉(zhuǎn)運(yùn)功能參與多種腫瘤進(jìn)程［16］。如ANO1 能激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路，促進(jìn)膽管癌細(xì)胞存活和增殖［17］；能激活轉(zhuǎn)化生長因子-β、核因子-κB、Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 信號通路，促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［18］。張喆等［19］基于癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，ANO1 高表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)。同時有研究報道，ANO1 高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌復(fù)發(fā)有關(guān)［9，20］。本研究結(jié)果顯示，ANO1 表達(dá)在結(jié)腸癌患者血清中升高，與分化程度、TNM 分期、侵犯漿膜和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，miR-370-3p≥1.64 是術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立保護(hù)因素，說明血清ANO1高表達(dá)參與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展，并會增加術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險。分析原因可能是ANO1 高表達(dá)能激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路，調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄因子激活，促進(jìn)術(shù)后殘留腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲，導(dǎo)致結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險增加［21］。

本研究顯示，結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)因素還包括TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、侵犯漿膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分析原因是分期越晚、伴有侵犯漿膜和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移反映腫瘤惡性程度更高，手術(shù)難以切除，可能殘留更多腫瘤病灶，增加復(fù)發(fā)風(fēng)險［2］。通過網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-370-3p與ANO1存在結(jié)合位點(diǎn)，相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者血清miR-370-3p 與ANO1 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-370-3p與ANO1可能共同參與結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)。孫欣華等［22］研究也證實，上調(diào)miR-370-3p 表達(dá)能靶向ANO1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移。本研究ROC曲線分析顯示，血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 表達(dá)分別為0.75、1.68 時，預(yù)測結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的曲線下面積分別為0.786、0.783；血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 聯(lián)合預(yù)測結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的曲線下面積為0.876，大于miR-370-3p、ANO1 mRNA 單獨(dú)預(yù)測。說明兩者有助于結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測，且聯(lián)合檢測能提升預(yù)測價值。

綜上所述，血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 表達(dá)與結(jié)腸癌患者腫瘤分化程度、TNM 分期、侵犯漿膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，血清miR-370-3p 聯(lián)合ANO1 mRNA 對結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)具有較高預(yù)測價值。但本研究結(jié)果還需多中心、大樣本研究證實。