紫菀酮對小鼠脊髓損傷后神經(jīng)元凋亡的影響

許軼博 孫洋 肖林雨 朱國慶 宋雪 胡建國 齊琦

基金項目：國家自然科學(xué)基金（82071360）、安徽省高校自然科學(xué)研究重點項目（KJ2020A0587）和蚌埠醫(yī)學(xué)院科研創(chuàng)新計劃（Byycx22010、Byycx22031）

摘要：目的? 探討紫菀酮（SHI）對脊髓損傷（SCI）小鼠運動功能的影響及可能的分子機制。方法? 采用C57BL/6小鼠構(gòu)建SCI模型，分為模型組（SCI組）和SHI藥物治療組（SCI+SHI組），假手術(shù)小鼠為對照組。采用Basso小鼠量表（BMS）評分評估SCI小鼠運動功能恢復(fù)情況，采用HE染色和Nissl染色觀察SCI小鼠脊髓組織纖維化和神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化，采用免疫熒光染色分析脊髓組織中神經(jīng)元凋亡情況。體外培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞，分為腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導(dǎo)組和SHI藥物治療組，采用Western blot檢測各組細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、基因本體和京都基因與基因組百科全書富集分析預(yù)測SHI促進SCI功能恢復(fù)的可能分子靶點和信號通路，并通過體內(nèi)外實驗對其分子機制進行驗證。結(jié)果? 與SCI組比較，SCI+SHI組小鼠BMS評分在第21、28、35、42天顯著升高（P=0.003、P=0.004、P=0.023、P=0.007），脊髓組織纖維化面積顯著降低（P=0.021），神經(jīng)元存活數(shù)量顯著增加（P=0.001），活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved-Caspase3）表達顯著降低（P=0.017）。與TNF-α組比較，SHI組cleaved-Caspase3、Bax蛋白表達水平顯著降低（P=0.010、P=0.001），而Bcl-2蛋白表達水平顯著升高（P=0.001）。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示SHI改善SCI小鼠運動功能可能與磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）信號通路相關(guān)。體內(nèi)和體外實驗檢測結(jié)果顯示，SHI可抑制SCI小鼠或TNF-α誘導(dǎo)的HT22細胞中PI3K和Akt的磷酸化水平（P均＜0.05），而胰島素樣生長因子-1干預(yù)后HT22細胞凋亡數(shù)量顯著高于SHI組（P=0.003）。結(jié)論? SHI可能通過PI3K/Akt信號通路抑制神經(jīng)元凋亡，從而促進SCI小鼠運動功能恢復(fù)。

關(guān)鍵詞：脊髓損傷；紫菀酮；神經(jīng)元；凋亡；磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B

中圖分類號： R285.5? 文獻標志碼： A? 文章編號：1000-503X（2023）05-0703-10

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15586

Effect of Shionone on Neuron Apoptosis After Spinal Cord Injury in Mice

XU Yibo1，2，SUN Yang2，3，XIAO Linyu2，3，ZHU Guoqing2，4，SONG Xue2，5，HU Jianguo2，4，QI Qi1

1Department of Histology and Embryology，College of Basic Medical Sciences，Bengbu Medical College，Bengbu，Anhui 233030，China

2Anhui Province Key Laboratory of Basic and Translational Research of Inflammation-Related Diseases，3Department of Rehabilitation，4Clinical Laboratory，5Central Laboratory，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu，Anhui 233000，China

Corresponding author：QI Qi? Tel：0552-3175282，E-mail：qq233003@163.com

ABSTRACT：Objective? To explore the effect of shionone（SHI）on motor function in the mouse model of spinal cord injury（SCI）and probe into the underlying molecular mechanism.Methods? C57BL/6 mice were treated to induce the SCI model and then assigned into a model group（SCI group），a SCI+SHI group，and a sham surgery（control）group.The Basso mouse scale（BMS）score was determined to evaluate the recovery of motor function in SCI mice.Hematoxylin-eosin（HE）staining，Nissl staining，and immunofluorescence staining were employed to examine the fibrosis，morphological changes of neurons，and neuron apoptosis in the spinal cord tissue of SCI mice，respectively.The mouse hippocampal neuronal cell line HT22 was cultured in vitro and then classified into tumor necrosis factor α（TNF-α）induction and SHI groups.Western blotting was employed to determine the expression of apoptosis-associated proteins.Network pharmacology，gene ontology annotation，and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment were employed to predict the possible molecular targets and signaling pathways of SHI in promoting functional recovery from SCI.Furthermore，the prediction results were verified by in vitro and in vivo experiments.Results? Compared with the SCI group，the SCI+SHI group showed increased BMS score on days 21，28，35，and 42（P=0.003，P=0.004，P=0.023，and P=0.007，respectively），reduced area of spinal cord fibrosis（P=0.021），increased neurons survived（P=0.001），and down-regulated expression of cleaved cysteine aspastic acid-specific protease 3（cleaved Caspase-3）（P=0.017）.Compared with the TNF-α group，the SHI group presented down-regulated expression levels of cleaved Caspase-3 and Bax（P=0.010，P=0.001）and up-regulated expression level of Bcl-2（P=0.001）.The results of bioinformatics analysis showed that SHI might improve the motor function of SCI mice via the phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）/protein kinase B（Akt）signaling pathway.The results of in vivo and in vitro experiments showed that SHI inhibited the phosphorylation of PI3K and Akt in SCI mice or HT22 cells exposed to TNF-α（all P<0.05）.The number of apoptotic HT22 cells after treatment with insulin-like growth factor 1 was higher than that in the SHI group（P=0.003）.Conclusion? SHI may inhibit neuron apoptosis via the PI3K/Akt signaling pathway，thereby promoting the recovery of motor function in SCI mice.

Key words：spinal cord injury；shionone；neuron；apoptosis；phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B

Acta Acad Med Sin，2023，45（5）：703-712

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）會導(dǎo)致長期或永久性的神經(jīng)功能缺損，造成運動和感覺功能障礙，影響患者生活質(zhì)量，同時也給社會和家庭帶來巨大的經(jīng)濟負擔(dān)［1-2］。原發(fā)性損傷后的一系列繼發(fā)性損傷可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，是造成運動功能障礙的重要原因，早期干預(yù)減少神經(jīng)元凋亡是促進SCI后運動功能恢復(fù)的關(guān)鍵［3］。然而，目前尚無有效藥物可以抑制SCI神經(jīng)元凋亡，因此急需尋找和開發(fā)新的治療藥物，以促進SCI患者的康復(fù)。天然植物化合物以其生物學(xué)作用多樣且安全的特點受到關(guān)注，越來越多的學(xué)者嘗試從中草藥中提純有效成分用于SCI的治療［4］。紫菀為菊科紫菀屬草本植物，以干燥根莖入藥［5］。據(jù)報道紫菀具有抗視網(wǎng)膜血管細胞凋亡的特性，而作為紫菀的主要活性成分紫菀酮（shionone，SHI）調(diào)控細胞凋亡及在SCI中的作用相關(guān)報道較少［6-7］。本研究以SCI小鼠模型為研究對象，觀察SHI對SCI小鼠運動功能恢復(fù)的作用效果；并結(jié)合體內(nèi)和體外實驗，分析SHI調(diào)控神經(jīng)元細胞凋亡在SCI中的作用及可能的分子機制，以期為臨床藥物治療提供參考。

材料和方法

材料? SHI購自上海源葉生物科技有限公司，小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）購自美國MedChemExpress公司，HE染色液購自珠海貝索細胞科學(xué)技術(shù)有限公司，Bcl-2、Bax、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved-cysteine asparate protease 3，cleaved-Caspase3）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化PI3K（phosphorylation PI3K，p-PI3K）、磷酸化Akt（phosphorylation Akt，p-Akt）、β-actin抗體均購自英國Abcam公司，神經(jīng)元特異性核蛋白（neuron specific nuclear protein，NeuN）購自武漢三鷹生物技術(shù)公司，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）購自美國Sigma公司。

實驗動物? 6～8周齡野生型C57BL/6雌性小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2018-0008，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中。本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院動物研究倫理委員會批準（倫理審批編號：倫動科批字〔2020〕第044號）。

SCI小鼠模型建立? 采用美國PSI公司脊髓打擊器IH-0400建立小鼠SCI模型［8］。采用1%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）腹腔注射麻醉，切除第9胸椎椎板，充分暴露脊髓，穩(wěn)定脊柱后使用具有50 kdyn的脊髓打擊器（直徑1.3 mm）垂直擊打脊髓建立SCI模型，打擊后小鼠出現(xiàn)尾部痙攣搖擺，雙下肢癱瘓，表明造模成功。假手術(shù)組只切除椎板不損傷脊髓。建模后小鼠每日皮下注射0.5 ml 8000 U青霉素預(yù)防感染，每日3次手動排空膀胱，直至小鼠自主排尿。

動物分組? 將48只C57BL/6小鼠（體重20～25 g）隨機分為3組：假手術(shù)組（對照組）、模型組（SCI組）和治療組（SCI+SHI組），每組16只。SCI+SHI組小鼠每日給予20 mg/kg SHI灌胃治療，連續(xù)給藥7 d；對照組和SCI組每日給予等體積生理鹽水進行灌胃。于造模后第7天和第6周處死小鼠，分離脊髓組織［9］。

Basso小鼠量表評分? 每組隨機抽取6只小鼠，于術(shù)前和術(shù)后第1、3、7、14、21、28、35、42天采用Basso小鼠量表（Basso mouse scale，BMS）評分標準對小鼠后肢進行連續(xù)運動功能狀態(tài)評估［10］。將小鼠置于空曠平坦的場地中，自由活動3 min，采用雙盲法進行評分，觀察指標包括小鼠后肢踝關(guān)節(jié)活動度、協(xié)調(diào)性、腳爪姿態(tài)和軀干穩(wěn)定性等，評分分為10個等級，0分：完全觀察不到踝關(guān)節(jié)運動；1分：踝關(guān)節(jié)輕度活動，關(guān)節(jié)活動范圍≤50%；2分：踝關(guān)節(jié)大幅運動，關(guān)節(jié)活動范圍＞50%；3分：爪子主動放置在地面上，拇指和小指都觸地，可以負重或不負重，或者偶爾/頻繁/持續(xù)以足背負重行走，無足底負重行走；4分：偶見（≤50%）足底負重行走；5分：頻繁（51%～94%）到持續(xù)（95%～100%）足底負重行走，但無前、后肢協(xié)調(diào)；6分：頻繁到持續(xù)足底負重行走，有少量前、后肢協(xié)調(diào)，并且后爪在剛觸地時平行；7分：頻繁到持續(xù)足底負重行走，有大量前、后肢協(xié)調(diào)，并且后爪在剛觸地和抬起時平行，但軀體嚴重不穩(wěn)；8分：頻繁到持續(xù)足底負重行走，有大量前、后肢協(xié)調(diào)，并且后爪在剛觸地和抬起時均平行，有輕度軀體不穩(wěn)表現(xiàn)；9分：足底可以負重行走，前后肢協(xié)調(diào)，軀干穩(wěn)定。由兩名經(jīng)過培訓(xùn)并熟練掌握評分細則的BMS評分員，在未知小鼠分組的情況下，獨立觀察小鼠3～5 min，統(tǒng)計兩名評分者的平均評分。

組織病理學(xué)觀察? 各組小鼠隨機選取6只于造模后第42天麻醉處死，4%多聚甲醛行左心室—主動脈灌注后，分離以損傷點為中心上下共1 cm的脊髓組織，常規(guī)包埋后制作冰凍切片。采用HE染色、Nissl染色評估脊髓組織纖維化面積及神經(jīng)元凋亡情況［11］。

細胞培養(yǎng)及分組? HT22細胞采用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期，以2×105個/孔的密度接種于6孔板中，分為對照組（單純DMEM完全培養(yǎng)基）、TNF-α組（100 ng/ml TNF-α誘導(dǎo)12 h）、SHI組（100 ng/ml TNF-α誘導(dǎo)12 h加20 μmol/L SHI治療1 d）。此外，采用100 ng/ml PI3K/Akt信號通路激動劑IGF-1處理HT22細胞24 h，觀察該信號通路關(guān)鍵蛋白的變化情況［12-13］。

Western blot檢測? 各組脊髓組織和細胞經(jīng)PBS洗滌后，采用RIPA裂解液裂解并提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，分別加入Bcl-2（1∶1000）、Bax（1∶1000）、cleaved-Caspase3（1∶1000）、PI3K（1∶1000）、Akt（1∶1000）、p-PI3K（1∶1000）、 p-Akt（1∶1000）、β-actin（1∶1000）和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/小鼠IgG（1∶3000），使用ECL發(fā)光液曝光后采集圖片，并采用Image-J軟件分析灰度值。

免疫熒光染色? 脊髓組織冰凍切片經(jīng)PBS洗滌、固定和封閉后，加入NeuN（1∶200）和cleaved-Caspase3（1∶200）4 ℃孵育過夜，PBS洗滌后加入FITC標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶500）和Alexa Fluor555標記的山羊抗兔IgG（H+L）（1∶1000）室溫孵育1 h，經(jīng)2 μg/ml DAPI復(fù)染細胞核和封片后，置于激光掃描共聚焦顯微鏡下采集圖片。HT22細胞爬片固定后，0.2% Triton-100破膜20 min，封閉1 h，加入一抗cleaved-Caspase3（1∶200）、Bcl-2（1∶200）4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，封片后于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。

SHI與SCI交集靶點篩選? 從Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得SHI結(jié)構(gòu)式，并將其SMILES結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Predictio數(shù)據(jù)庫和PharmMapper數(shù)據(jù)庫，以可能性＞0為限制條件進行篩選，預(yù)測SHI潛在作用靶點。利用Genecards數(shù)據(jù)庫檢索SCI相關(guān)靶點并剔除非人源基因。將SHI潛在作用靶點和SCI相關(guān)靶點導(dǎo)入Venny 2.1.0在線工具，繪制韋恩圖。

蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析? 將SHI與SCI的交集靶點基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫，獲得蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI）的數(shù)據(jù)文件。將蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，建立SHI與SCI靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)圖中各靶點的點度中心性參數(shù)篩選出關(guān)鍵靶點基因。

基因本體和京都基因與基因組百科全書富集分析? 將篩選的關(guān)鍵靶點基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集和基因本體（gene ontology，GO）功能分析。

統(tǒng)計學(xué)處理? 采用SPSS 26.0軟件，符合正態(tài)分布和方差齊性的計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布和方差齊性的計量資料采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗均獨立重復(fù)3次。

結(jié)? 果

BMS評分比較? 與SCI組比較，SCI+SHI組BMS評分在第21、28、35、42天顯著升高（P=0.003、P=0.004、P=0.023、P=0.007）。

組織病理學(xué)變化? HE染色結(jié)果顯示，SHI顯著減少SCI后脊髓組織的纖維化面積（P=0.021）（圖1A）。Nissl染色結(jié)果顯示，SCI+SHI組在距離損傷中心0.5 mm處殘余的前角運動神經(jīng)元的數(shù)量顯著多于SCI組（P=0.001）（圖1B）。

SHI對SCI小鼠脊髓神經(jīng)元細胞凋亡的影響? 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與SCI組比較，SCI+SHI組小鼠脊髓組織中NeuN和cleaved-Caspase3表達陽性的細胞數(shù)顯著減少（P=0.017）（圖2）。

SHI對TNF-α誘導(dǎo)的HT22細胞凋亡的影響? Western blot檢測結(jié)果顯示，與TNF-α組比較，SHI組HT22細胞Bax（2.08±0.24比4.82±0.42；t=7.940，P=0.001）和cleaved-Caspase3蛋白（5.24±0.13比8.90±1.13；t=4.557，P=0.010）表達水平顯著降低，而Bcl-2蛋白表達水平顯著增加（0.72±0.04比0.39±0.03；t=10.010，P=0.001）（圖3）。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析? 韋恩圖發(fā)現(xiàn)106個SHI和SCI的交集靶點（圖4A），并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖4B），拓撲分析得出前6位的交集靶點分別為SRC、HSP90AA1、MAPK1、PIK3R1、EGFR和IGF1，點度中心性值依次為66、60、54、54、54、48。

GO功能注釋分析? 對106個交集靶點進行GO功能注釋分析結(jié)果顯示，SHI的調(diào)控功能可能與抗凋亡和PI3K信號通路的調(diào)節(jié)有關(guān)（圖5）。

KEGG富集分析? 對106個交集靶點進行KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，SHI的抗凋亡作用可能與PI3K/Akt信號通路有關(guān)（圖6）。

SHI對SCI小鼠脊髓組織PI3K/Akt通路蛋白表達的影響? Western blot檢測結(jié)果顯示，與SCI組比較，SCI+SHI組p-PI3K（2.64±0.15比4.56±0.92；t=2.919，P=0.043）和p-Akt表達（1.85±0.19比3.03±0.25；t=5.276，P=0.006）顯著降低（圖7）。

SHI抑制PI3K/Akt通路對神經(jīng)元凋亡的影響? Western blot檢測結(jié)果顯示，與TNF-α組比較，SHI組p-PI3K（4.25±0.23比8.66±0.31；t=16.130，P＜0.001）和p-Akt表達（2.38±0.36比9.37±0.48；t=16.470，P＜0.001）顯著降低，PI3K/Akt通路激動劑IGF-1干預(yù)后p-PI3K（6.21±0.48比4.25±0.23；t=5.161，P=0.007）和p-Akt表達（3.61±0.44比2.38±0.36；t=3.044，P=0.038）顯著升高（圖8A）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與TNF-α組比較，SHI組cleaved-Caspase3陽性細胞數(shù)顯著降低（P=0.001），而Bcl-2陽性細胞數(shù)顯著升高（P=0.004）；IGF-1干預(yù)后cleaved-Caspase3陽性細胞數(shù)顯著增多（P=0.003），Bcl-2陽性細胞數(shù)顯著減少（P=0.002）（圖8B）。

討論

SCI治療是一個世界性難題，通過藥物干預(yù)抑制神經(jīng)元凋亡等病理損傷是減緩SCI神經(jīng)功能障礙的有效方法之一［14］。本研究發(fā)現(xiàn)菊科植物紫菀的活性單體SHI具有改善SCI小鼠運動功能的作用，可能與其靶向抑制PI3K/Akt信號通路，進而拮抗神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)SHI可改善SCI小鼠運動功能，表現(xiàn)為SHI干預(yù)后SCI小鼠的BMS評分顯著升高、脊髓組織纖維化面積明顯減少以及殘留的前角運動神經(jīng)元數(shù)量增多。隨著中醫(yī)藥的興起，越來越多的中國學(xué)者嘗試從中草藥中提純有效成分用于治療無特效藥物的疾病，包括炎癥性腸病、自身免疫性疾病及SCI等［15-16］。中藥單體具有分子量小，易吸收，可通過血脊髓屏障等優(yōu)點，受到SCI治療藥物研發(fā)者的青睞。目前，已有多種中藥單體被證明可以改善SCI損傷，包括白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ［17］、槲皮素［18］及莫諾苷［19］等。本研究結(jié)果為SCI治療藥物選擇提供了新的方向，同時也證明了SHI的藥用價值及適用疾病范圍。

中藥單體化合物生物活性多樣，具有抗炎、調(diào)控細胞增殖和凋亡等作用［20］。據(jù)報道SHI具有抗視網(wǎng)膜血管細胞凋亡的作用，而抑制細胞凋亡是治療SCI的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［21］。本研究結(jié)果證實SHI可通過抑制損傷脊髓組織中的神經(jīng)細胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)元保護作用，從而促進SCI后運動功能恢復(fù)。在眾多的凋亡調(diào)控基因中Caspase家族和Bcl-2蛋白家族最受關(guān)注［22］。Caspase是凋亡程序的重要執(zhí)行者，其中Caspase3是哺乳動物細胞凋亡通路中的關(guān)鍵死亡蛋白酶，在細胞凋亡中起著不可替代的作用。本研究通過神經(jīng)元特異性標志物NeuN和cleaved-Caspase3對SCI小鼠的脊髓組織進行免疫熒光雙染，結(jié)果表明SHI治療后cleaved-Caspase3表達數(shù)量顯著減少，說明SHI可以抑制SCI小鼠的神經(jīng)元凋亡。Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是Bcl-2家族中促凋亡蛋白，凋亡程度通常由Bcl-2/Bax的比值決定［24］。本研究結(jié)果顯示，SHI可以促進TNF-α誘導(dǎo)的HT22細胞中Bcl-2的表達，抑制Bax的表達，提示SHI的神經(jīng)保護作用可能與Bcl-2家族的抗凋亡作用有關(guān)。

中藥單體作為小分子化合物，調(diào)控細胞生物學(xué)功能的分子機制復(fù)雜，?？芍苯咏Y(jié)合靶蛋白調(diào)控下游信號通路。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析獲得106個SHI和SCI的交集靶點，經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選出SRC、HSP90AA1、MAPK1、PIK3R1、EGFR、IGF1可能為SHI發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶蛋白。既往研究報道，SRC、HSP90AA1、PIK3R1、EGFR和IGF1蛋白均可通過PI3K/Akt信號通路調(diào)控細胞凋亡等多種生物學(xué)過程［25-29］。此外，KEGG富集分析也顯示SHI對SCI的保護作用可能與PI3K信號通路有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路是SCI后的一條經(jīng)典途徑，其調(diào)控神經(jīng)元凋亡、軸突脫髓鞘和炎癥反應(yīng)等過程，拮抗其激活有助于SCI早期神經(jīng)功能恢復(fù)［30-31］。本研究采用Western blot和免疫熒光染色等方法，從體內(nèi)外實驗驗證SHI抑制神經(jīng)元凋亡可能與其抑制PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

本研究存在以下不足：首先，SCI神經(jīng)元凋亡的調(diào)控十分復(fù)雜，受多種因素影響，SHI除抑制神經(jīng)元凋亡外，是否還參與SCI其他病理過程有待進一步探究；其次，本研究采用的SHI用藥劑量是通過預(yù)實驗確定的，有關(guān)SHI的最佳注射劑量仍然需要進一步研究，為本研究成果的臨床轉(zhuǎn)化提供參考。

綜上，本研究結(jié)果表明，SHI可能通過抑制PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡作用，從而促進SCI小鼠運動功能恢復(fù)。

參考文獻

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（收稿日期：2023-03-20）