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    腦心肌炎病毒(EMCV)感染昆明小鼠模型的建立①

    2023-11-13 09:29:44鄭劍綱郝至立曹志剛孫盼盼李宏全
    中國免疫學(xué)雜志 2023年10期
    關(guān)鍵詞:載量脾臟低劑量

    鄭劍綱 郝至立 曹志剛 孫盼盼④ 孫 娜 李宏全

    (山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,太谷 030801)

    腦 心 肌 炎 病 毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)屬于小核糖核酸病毒科,心病毒屬,病毒粒子外表呈光滑球形,無囊膜,為單股正鏈RNA 病毒[1-3]。EMCV 于1945 年在佛羅里達(dá)州邁阿密由HELWIG 和SCHMIDT 首次從一只突然死于肺水腫和心肌炎的雄性長臂猿中分離得到,將浮腫液注射小鼠體內(nèi)后,出現(xiàn)后肢麻痹和心肌炎等癥狀,隨后這種病原體被命名為EMCV[4]。1949 年后,EMCV感染發(fā)生于獼猴、狒狒、狗、老虎、獼猴、蝙蝠、豬和人等不同物種,且分布于世界各地[5-11]。EMCV 感染大多數(shù)物種后癥狀輕微,但可引起母豬繁殖障礙、仔豬急性心肌炎,誘發(fā)仔豬猝死等[12-16]。目前針對(duì)EMCV感染還沒有特效藥和商品化疫苗。

    小鼠模型具有成本低、繁殖飼養(yǎng)快速方便、遺傳背景明確等有利因素,使其成為藥物臨床前評(píng)價(jià)研究等最為重要的模式動(dòng)物。EMCV 小鼠模型的建立既往研究鮮見報(bào)道,主要集中于EMCV 感染小鼠后臨床癥狀和組織病理損傷的觀察[17-21]。本研究擬建立EMCV 感染昆明小鼠模型,為后續(xù)EMCV 致病機(jī)制和藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和病毒 6~8 周齡SPF 級(jí)昆明小鼠192 只雌雄各半(質(zhì)量合格證號(hào):110011210115 155452),購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司[SCXK(京)2021-0006]。自由采食和飲水,所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物委員會(huì)倫理要求(倫理審查號(hào):SXAU-EAW-2021M01027)。EMCV NJ08 株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授惠贈(zèng),本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了擴(kuò)增和保存。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算其毒力為108.5TCID50/ml[22]。

    1.1.2 主要試劑 TRIzol(invitrogen,美國);2×SYBR Green qPCR Master Mix(Low ROX,Biotool,美國);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,中國);蘇木素染色液、伊紅染色液和中性樹膠(Solarbio,中國)。

    1.1.3 主要儀器 烘片機(jī)、全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、熒光正置顯微鏡(型號(hào):HI1220、型號(hào):RM2255、型號(hào):DM3000,德國Leica);生物組織包埋機(jī)(型號(hào):KDBM,中國科迪);高速冷凍離心機(jī)、核酸蛋白濃度測定儀(型號(hào):5418、型號(hào):D30,德國Eppendorf);PCR儀(型號(hào):TC-96,美國Bio-Rad);渦旋振蕩儀(型號(hào):GENIUS3,德國IKA);熒光定量PCR 儀(型號(hào):7500,美國Applied Biosystems)。

    1.2 方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,分為正常組和EMCV 高、中、低劑量感染組。EMCV高 劑 量 組 小 鼠 腹 腔 注 射0.2 ml 100 TCID50/20 g EMCV,中劑量組小鼠腹腔注射0.2 ml 10 TCID50/20 g EMCV,低劑量組小鼠腹腔注射0.2 ml 1 TCID50/20 g EMCV,空白組腹腔注射等體積的生理鹽水。每天觀察小鼠臨床癥狀。于EMCV 感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d,每組隨機(jī)選取8只,經(jīng)摘取眼球采血,脫頸處死小鼠,收集不同臟器進(jìn)行后續(xù)檢測。

    1.2.2 檢測各組小鼠心臟、腦、脾臟和肝臟指數(shù)摘取心臟、腦、脾臟和肝臟后,用濾紙吸干殘留血后,并依據(jù)下列公式計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/小鼠質(zhì)量(g)×10。

    1.2.3 qRT-PCR 檢測病毒載量和炎癥因子 用TRIzol 法提取小鼠血液、心臟、腦、脾臟和肝的總RNA,用核酸蛋白濃度測定儀檢測RNA 的濃度和純度,按照TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR 檢測不同劑量EMCV 感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d 時(shí)血液、心臟、腦、脾臟和肝的病毒載量。使用本實(shí)驗(yàn)室保存的1.59×108Copies/μl EMCV 3D 重組質(zhì)粒為模板,10 倍比稀釋,加入3D基因正反向引物進(jìn)行擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)曲線由各稀釋度模板的起始拷貝數(shù)及其對(duì)應(yīng)的Ct值構(gòu)成。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測每ml 樣品中EMCV 3D 拷貝數(shù)。EMCV 3D基因引物序列為F:5'-TTAGGGCGGGTTTGTAT-3',R:5'-TTTGTTAGCGGGAGTTA-3'。相 對(duì)qRT-PCR 檢測9 d 時(shí)心和腦IL-1β、IL-6 和TNF-α 的相對(duì)表達(dá)量。IL-1β F:5'-GCCACCTTTTGACAGTGATGAGA-3',R:5'-GACAGCCCAGGTCAAAGGTT-3';IL-6 F:5'-GTCCTTCCTACCCCAATTTCCA-3',R:5'-TAACGCACTAGGTTTGCCGA-3';TNF-α F:5'-GATCGGTCCCCTTTGGGATG-3',R:5'-GGTTTGCTACGCAGTGGGC-3';β-Actin F:5'-CTGAGCTGCGTTTTACACCC-3',R:5'-CGCCTTCACCGTTCCAGTTT-3'。

    1.2.4 組織病理切片 取小鼠心尖和左腦,于10%甲醛溶液中固定24 h。經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、烘片、脫蠟、蘇木素-伊紅染色和中性樹膠封片后,鏡檢觀察心臟和腦組織病理變化。

    2 結(jié)果

    2.1 臨床癥狀觀察 與空白組相比,昆明小鼠經(jīng)腹腔接種0.2 ml 100 TCID50/20 g EMCV 后第3 d 開始出現(xiàn)精神沉郁、被毛粗亂等癥狀;感染5~11 d 不斷有小鼠出現(xiàn)震顫、弓背及后肢癱瘓等癥狀,后肢癱瘓癥狀出現(xiàn)24~48 h 后小鼠出現(xiàn)死亡,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,高劑量組共出現(xiàn)死亡小鼠7 只。其他未出現(xiàn)癥狀的小鼠感染15 d 與空白組相比均未出現(xiàn)異常,但在組織中能檢測到EMCV病毒的復(fù)制。中劑量和低劑量組小鼠直到第15天未出現(xiàn)異常癥狀。

    2.2 不同劑量EMCV 在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響 由圖1 可知,與空白組相比,高劑量EMCV 感染小鼠5 d 時(shí),能顯著提高心臟指數(shù)(P<0.05),極顯著提高脾臟指數(shù)(P<0.01),對(duì)于腦和肝臟指數(shù)并無顯著影響。在7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d時(shí),不同劑量的EMCV 感染對(duì)于小鼠的臟器指數(shù)無顯著影響(P>0.05),表明在EMCV 感染小鼠前期造成心臟和脾臟腫大。

    2.3 不同劑量EMCV 感染小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的病毒載量 利用qRT-PCR 檢測不同劑量EMCV 感染的昆明小鼠5 d、7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d 時(shí),心臟、腦、肝臟、脾臟和外周血中EMCV 載量,結(jié)果見圖2。高劑量EMCV 感染昆明小鼠,隨著時(shí)間增加,在心臟、腦、肝臟、脾臟和外周血中EMCV載量逐漸增加,在9 d 時(shí)達(dá)到頂峰,然后隨著時(shí)間增加病毒載量逐漸下降,其中腦組織的病毒載量最高。與高劑量組相比,中劑量和低劑量EMCV 感染小鼠不同時(shí)間點(diǎn)后,心臟、腦、肝臟、脾臟和外周血中EMCV 載量很低,且部分低劑量EMCV感染小鼠未能檢測到EMCV的復(fù)制情況。

    圖2 qRT-PCR 檢測不同劑量EMCV 感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d 時(shí)心臟、腦、肝臟、脾臟和外周血中EMCV載量Fig.2 qRT-PCR was used to detect EMCV loads in different organs and peripheral blood infected with different doses of EMCV on 5 d, 7 d, 9 d, 11 d, 13 d and 15 d

    2.4 不同劑量EMCV 感染小鼠9 d 時(shí)炎癥因子mRNA表達(dá) 利用qRT-PCR檢測不同劑量EMCV感染昆明小鼠9 d 時(shí),心臟和腦中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA 表達(dá)情況,結(jié)果見圖3。與空白組相比,高劑量EMCV 感染9 d 時(shí),能極顯著提高心臟中IL-1β(P<0.01)、IL-6(P<0.001)和TNF-α(P<0.01) mRNA 表達(dá),中劑量EMCV 感染9 d 時(shí)則顯著提升心臟中IL-1β mRNA 表達(dá)(P<0.05)。與空白對(duì)照組相比,高劑量EMCV感染9 d時(shí)能極顯著提高腦組織中IL-1β 和TNF-α mRNA 表達(dá)(P<0.001),顯著增加IL-6 mRNA 表達(dá)(P<0.05)。中劑量EMCV 感染9 d 時(shí)能極顯著提高腦組織中TNF-α mRNA 的表達(dá) (P<0.01)。與空白組相比,低劑量EMCV 感染對(duì)心臟和腦組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達(dá)無顯著影響(P>0.05)。

    圖3 qRT-PCR 檢測不同劑量EMCV 感染9 d 時(shí)心臟和腦IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 qRT-PCR detected relative expressions of IL-1β,IL-6 and TNF-α mRNA in heart and brain infected with different doses of EMCV for 9 d

    2.5 小鼠心臟組織病理損傷情況 不同劑量EMCV 感染昆明小鼠5 d、7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d時(shí),對(duì)心臟組織進(jìn)行HE 染色。由圖4 可知,空白組心肌細(xì)胞纖維清晰可見,心肌纖維平行排列,且整齊均勻。胞漿染色均勻,細(xì)胞核呈橢圓形,位于細(xì)胞中部。與空白組相比,高劑量EMCV感染5 d時(shí)心臟組織炎癥細(xì)胞增多;7 d時(shí)心臟組織有大面積炎癥細(xì)胞浸潤;9 d 時(shí)心肌細(xì)胞出現(xiàn)空泡狀病變;11 d 時(shí)炎癥細(xì)胞浸潤減少,空泡狀病變消失,心肌間隙增寬,后期回歸正常。中劑量EMCV 僅在感染前期導(dǎo)致少量炎癥細(xì)胞浸潤和心肌間隙增寬。低劑量EMCV感染與空白組形態(tài)基本一致。

    圖4 不同劑量EMCV感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d和15 d時(shí)心臟組織病理學(xué)切片(HE染色,×200)Fig.4 Histopathological sections of heart tissue infected with different doses of EMCV on 5 d,7 d,9 d,11 d,13 d and 15 d (HE staining, ×200)

    2.6 小鼠腦組織病理損傷情況 空白組大腦腦膜正常,皮質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰,白質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤。與空白組相比,高劑量EMCV 感染5 d 時(shí),腦膜下血管擴(kuò)張,7 d 和9 d 時(shí)腦膜增厚,膜下出血,后期腦膜恢復(fù)正常,膜下出血逐漸吸收;中劑量EMCV感染7 d時(shí),腦膜增厚和腦水腫,9 d 時(shí)白質(zhì)有出血點(diǎn),中劑量感染其他時(shí)間點(diǎn)和低劑量感染與空白組形態(tài)基本一致(圖5)。與空白組相比,高劑量EMCV 感染5 d時(shí),腦白質(zhì)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤,7 d 和9 d 時(shí),白質(zhì)內(nèi)血管高度擴(kuò)張,炎癥細(xì)胞浸潤,形成血管套,后期逐漸恢復(fù)正常;中劑量EMCV感染前期,出現(xiàn)輕微的炎癥細(xì)胞浸潤和血管擴(kuò)張,后期逐漸恢復(fù)正常。低劑量感染與空白組形態(tài)基本一致(圖6)。

    圖5 不同劑量EMCV感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d和15 d時(shí)腦皮質(zhì)和腦膜組織病理學(xué)切片(HE染色,×200)Fig.5 Histopathological sections of cerebral cortex and meninges infected with different doses of EMCV on 5 d, 7 d, 9 d, 11 d, 13 d and 15 d (HE staining, ×200)

    圖6 不同劑量EMCV感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d和15 d時(shí)腦白質(zhì)組織病理學(xué)切片(HE染色,×200)Fig.6 Histopathological sections of cerebral white matter infected with different doses of EMCV on 5 d, 7 d,9 d, 11 d, 13 d and 15 d (HE staining, ×200)

    3 討論

    目前,大量研究集中于EMCV 感染小鼠臨床癥狀的觀察,而系統(tǒng)建立EMCV 感染昆明小鼠模型鮮見報(bào)道,這在一定程度上限制了抗EMCV 臨床藥物的開發(fā)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)醇體外能夠顯著抑制EMCV 的復(fù)制,為了驗(yàn)證其體內(nèi)抗病毒活性,首先需建立EMCV感染昆明小鼠模型[23]。EMCV感染昆明小鼠模型的建立為抗EMCV藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

    首先采用100 TCID50/20 g的EMCV感染小鼠5 d時(shí),能夠顯著提高心臟和脾臟指數(shù)。施開創(chuàng)等[19]使用103.67TCID50的EMCV GXLC 株腹腔注射小鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)心臟重量與體質(zhì)量的比值在3~14 d 都會(huì)保持明顯升高。本實(shí)驗(yàn)僅在感染5 d 時(shí)顯著升高,這可能取決于選取相對(duì)較低的劑量和不同的毒株。EMCV 感染首先在位于扁桃體的巨噬細(xì)胞復(fù)制,然后隨著游走的巨噬細(xì)胞遍布全身[24]。脾臟紅髓中存在大量平滑肌細(xì)胞和纖維,外周圍繞脾索巨噬細(xì)胞,EMCV 在巨噬細(xì)胞中復(fù)制后,造成該類細(xì)胞脫離消失,而平滑肌細(xì)胞直接與血液中的凝血因子接觸,使血小板激活聚集,激發(fā)凝血系統(tǒng),使紅細(xì)胞在脾臟中聚集,充血腫大。

    本實(shí)驗(yàn)中,采用100 TCID50/20 g EMCV 感染昆明小鼠,隨著時(shí)間增加,心臟、腦和脾臟中的EMCV載量逐漸增加,在9 d 時(shí)達(dá)到頂峰,然后隨著時(shí)間增加病毒載量逐漸下降。殷雪婷[21]研究發(fā)現(xiàn)EMCV HLJ感染小鼠后,在組織器官中廣泛分布,各器官都能檢測到病毒的存在,其中心和腦病毒載量最高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,100 TCID50/20 g的EMCV感染可以導(dǎo)致病毒在小鼠體內(nèi)大量復(fù)制。

    心臟和腦是EMCV 感染的靶器官,可以導(dǎo)致心肌炎和腦炎,最終導(dǎo)致心力衰竭和癱瘓。炎癥因子被認(rèn)為在心臟衰竭的發(fā)病過程中具有非常重要的作用,IL-1β 降低心臟收縮力,IL-6 導(dǎo)致負(fù)性肌力,TNF-α引起心肌收縮障礙、心肌炎、心室擴(kuò)張和心臟發(fā)育不全[25-27]。研究表明,致心肌炎型EMCV-M 感染小鼠后,心肌中IL-1β、TNF-α 表達(dá)與心肌病變程度 呈 正 相 關(guān)[19]。施 開 創(chuàng) 等[19]研 究 還 表 明EMCV GXLC 感染小鼠后,腦組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達(dá)顯著上升。本研究結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,100 TCID50/20 g EMCV感染9 d時(shí),能極顯著提升心臟和腦組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA表達(dá),表明100 TCID50/20 g EMCV 感染小鼠造成了靶器官心和腦的炎癥反應(yīng)。

    EMCV 感染小鼠誘發(fā)的心肌炎特點(diǎn)為心肌壞死和炎癥細(xì)胞浸潤,并且導(dǎo)致心力衰竭和擴(kuò)張型心肌?。?8]。研究發(fā)現(xiàn)EMCV復(fù)制主要位于大腦海馬體和小腦顆粒層的小區(qū)域壞死性病灶內(nèi)[29]。從胸椎到腰椎脊髓,控制骨骼肌活動(dòng)和張力的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元也會(huì)受到影響,從而導(dǎo)致癱瘓[30]。病理學(xué)組織切片結(jié)果顯示,100 TCID50/20 g EMCV感染能夠引起小鼠心臟組織大面積炎癥細(xì)胞浸潤和空泡化病變。也引起腦組織腦膜下血管擴(kuò)張、腦膜增厚、膜下出血、腦白質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤和形成血管套的病理變化。結(jié)果表明100 TCID50/20 g EMCV 感染小鼠造成了靶器官心和腦的病理損傷。

    綜 上 所 述,腹 腔 注 射0.2 ml 100 TCID50/20 g EMCV 可引起小鼠發(fā)病,成功建立了EMCV 感染昆明小鼠模型。本實(shí)驗(yàn)通過測定不同時(shí)間點(diǎn)EMCV感染小鼠的不同臟器中病毒RNA,并觀察了心和腦組織病理學(xué)改變,了解EMCV進(jìn)入小鼠引起的變化。

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