基因片段Myo5a原核表達、純化及多克隆抗體制備①

游荷花 唐銳敏 （山西醫(yī)科大學汾陽學院免疫學與免疫學檢驗教研室，汾陽 032200）

Myosin 是肌球蛋白，又稱肌凝蛋白，是真核細胞里的一類ATP依賴型分子馬達［1］。Myosin于1864年由KUEHNE 在對肌肉的運動進行探討時發(fā)現(xiàn)的，以肌動蛋白絲作為運轉的軌道，經過水解ATP 造成了構型的改變而在肌動蛋白絲上移行。最初研究以為其是存在于平滑肌和橫紋肌中的ATP 酶，之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)許多真核細胞也存在同源蛋白基因，證實這種蛋白的用處不局限于肌肉細胞。Myosin 可以進行的細胞活動包括：肌肉運動、趨化作用、細胞分裂、胞飲作用、靶向小泡運輸和信號轉導等，是生物體內重要的蛋白質成員。據發(fā)現(xiàn)時間的先后命名肌球蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)30 多種，分為傳統(tǒng)的和非傳統(tǒng)的［2］。

Myo5 也稱為Myosin5 或MyoⅤ，在細胞中物質運輸中有重要的作用。MyosinⅤa（Myo5a）是MyosinⅤ家族中的一分子，是一種“摩托蛋白”，主要負責轉運細胞內物質［3］。近十幾年不斷有研究發(fā)現(xiàn)Myo5a與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。為進一步探究Myo5a 可能與某些腫瘤發(fā)展的關系，本實驗擬制備Myo5a 片段的原核表達質粒PGEX-4T-3/Myo5a，使其表達并純化該蛋白質，制備其抗血清，為后續(xù)探討Myo5a與腫瘤的關系作鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料 Myo5a PCR 模板、原核載體、ELISA 反應板、實驗動物、佐劑以及E.coliDH5α和BL21均由實驗室提供；DNA 限制性核酸內切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4DNA連接酶、DNA聚合酶等均購于TaKaRa公司；鎳親和層析柱購自Bio-Rad 公司；低分子量蛋白標準Marker 和DNA Marker 等購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Myo5a 目的基因的獲取 按照人Myo5a 基因序列，設計一對引物來擴增Myo5a 羧基末端的近100 bp 大小的基因小片段，命名為Myo5a-D1［BamHⅠF（5'～3'）：CG/GGATCC/ATGAATAGTGGGGCTAAAG；XhoⅠR（5'～3'）：CCC/CTCGAG/AGAACAAATGGCTTCTGCATC，長度111 bp］。BamHⅠ是正向引物的酶切位點，XhoⅠ是反向引物的酶切位點。擴增條件如下：95 ℃ 預變性2 min；95 ℃變性15 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，共30 個循環(huán)；最后4 ℃保溫。擴增完畢，進行瓊脂糖電泳鑒定。采用RCR純化試劑盒純化基因小片段。

1.2.2 PGEX-4T-3/Myo5a 重組質粒的構建及鑒定 原核表達載體PGEX-4T-3 的基因片段經BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切反應（37 ℃、CO2孵箱過夜），用DNA回收試劑盒回收所需DNA。將原核表達載體PGEX-4T-3 與Myo5a-D1 連接， EP 管中加入1.5 μl PGEX-4T-3 質粒、0.3 μl D1、0.4 μl T4DNA 連接酶、1 μl緩沖液后補加去離子水（DI H2O）使連接體系為10 μl，4 ℃冰箱過夜。連接產物轉化到大腸桿菌的DH5α 感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)，篩選重組子。經雙酶切鑒定和測序，獲得重組質粒PGEX-4T-3/Myo5a-D1。

1.2.3 重組PGEX-4T-3/Myo5a 的誘導表達 4 μl PGEX-4T-3（對 照）、8 μl 重 組 質 粒PGEX-4T-3/Myo5a-D1轉化入大腸桿菌BL21。置于冰中30 min，42 ℃熱擊40 s，再冰鎮(zhèn)1～2 min。經復蘇后，取適量涂布于含有Amp 的LB 盤中，37 ℃孵箱放置12～16 h后，可見菌落長出。挑取陽性克隆菌落，接于2 ml含有Amp 的LB 培養(yǎng)基中（兩個培養(yǎng)皿依次挑?。?7 ℃搖床振蕩3～4 h，至OD 值為0.6。各取0.5 ml菌液作為誘導前的對照。剩余菌液均加15 μl IPTG，37 ℃搖床中培養(yǎng)至終濃度為1 mmol/L（2～3 h）。培養(yǎng)結束后，1.5 ml 菌液均分成3 份。其中0.5 ml 菌液保種儲存；0.5 ml 菌液為誘導后的總菌液，離心，收集沉淀加50 μl PBS重懸菌液；最終0.5 ml菌液，離心，收集沉淀后加250 μl的PBS重懸菌液，超聲裂解細菌細胞，離心后分別得到細菌沉淀和裂解上清，去離子水溶解沉淀。最終得到質粒包含誘導前總菌液、誘導后總菌液、裂解上清、細菌沉淀共4 個樣品。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白的表達。

1.2.4 大量表達重組PGEX-4T-3/Myo5a 蛋白 LB培養(yǎng)基（含Amp）中接種1 個BL21 轉化成功的陽性克隆，37 ℃ 過夜培養(yǎng)，第2天再加入300 ml LB，繼續(xù)搖菌至OD 值約為0.6。按1∶100 的比例加入IPTG培養(yǎng)至終濃度為1 mol/L。4 ℃離心2 次，棄上清。10 ml的去離子水重懸菌液，分裝10管，-20 ℃儲存。

1.2.5 采用鎳親和層析柱提純蛋白，Western blot檢測純化蛋白 取1 ml 菌體，加29 ml 去離子水，50 μl PMSF 和1% Triton。超聲裂解細胞，4 ℃離心，得到裂解上清，濾紙過濾。層析柱中加0.5 ml 50%谷胱甘肽瓊脂糖，樣品過柱（前后均用5×柱體積的PBS 洗層析柱）。采用3×柱體積的洗脫液洗脫蛋白，得到提純的融合蛋白。收集蛋白0.5 ml/管，-80 ℃儲存。其中20 μl 樣品SDS-PAGE 電泳鑒定。PGEX-4T-3/Myo5a-D1 得到了大量提純的蛋白，采用Western blot 檢測提純的蛋白，并用SDS-PAGE 電泳純化后的融合蛋白和陰性對照，在80 V 恒壓狀態(tài)下轉膜2 h。4 ℃過夜后在NC 膜條中加入一抗，4 ℃過夜，TBST 洗滌5 次。加二抗孵育，洗膜。最后顯色記錄結果。

1.2.6 制備兔抗人抗血清，并對其進行滴度測定查閱文獻［4］，采用PGEX-4T-3/Myo5a-D1 融合蛋白為免疫原，免疫動物選適齡，健康的家兔。初次注射免疫原劑量為200 μg，佐劑用完全弗氏佐劑，佐劑與免疫原按1∶1 體積比混勻，于家兔皮下注射。注射3 周后，再次注射進行加強免疫， 家兔皮下均用100 μg PGEX-4T-3/Myo5a-D1 融合蛋白，與等體積的不完全弗氏佐劑混勻后注射。之后每隔2～3周進行加強免疫1 次，總共注射4 次。在最后一次注射后第6 天進行靜脈采血，ELISA 法測血清抗體滴度。酶標板先用PGEX-4T-3/Myo5a-D1 融合蛋白（10 μg/ml，100 μl/孔）4 ℃過夜包被，后用10%牛血清白蛋白37 ℃進行封閉2 h，之后洗板5次。加入梯度稀釋的家兔抗血清（100 μl/孔），恒溫孵箱37 ℃放置1 h，陰性對照用家兔未免疫時的血清。后加入HRP-羊抗兔IgG 后，恒溫孵箱37 ℃放置1 h。加入顯色底物TMB 恒溫孵箱37 ℃放置0.5 h 后加中止液。酶標儀檢測波長450 nm 處OD 值，判定抗血清效價（Cut off 值為陰性孔OD450值×2.1，大于此值的抗血清最大稀釋度為其效價）。

1.2.7 抗血清特異性鑒定 Western blot 檢測：將純化的PGEX-4T-3/Myo5a-D1 蛋白經SDS-PAGE 電泳，后轉移至NC 濾膜上。制備的兔抗血清與膜4 ℃孵育過夜，加二抗，孵育，洗滌，顯色并記錄結果。免疫熒光法檢測：腦神經細胞（因富含Myo5a 蛋白）作為基質細胞切片，加制備的兔抗血清于4 ℃，過夜，陰性對照還是用兔未免疫時的血清，加二抗，37 ℃孵育0.5 h后洗滌5次，最后熒光顯微鏡下觀察發(fā)射熒光情況。

2 結果

2.1 擴增了基因小片段My05a-D1 以人類Myo5a基因為模板，利用引物，成功擴增了基因小片段Myo5a-D1，PCR結果見圖1。

圖1 Myo5a-D1小片段的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarosegel electrophoresis of small fragment of Myo5a-D1

2.2 PGEX-4T-3/Myo5a 重組質粒構建及鑒定 將在抗性平板上生長的菌落隨機挑取進行搖菌培養(yǎng)，提取重組質粒進行PCR 鑒定，均含目的條帶。質粒DNA 雙酶切鑒定結果見圖2。將鑒定正確的重組質粒進行測序，測序結果符合預期。

圖2 PGEX-4T-3/Myo5a-D1重組質粒的酶切鑒定Fig.2 Enzymatic digestion of PGEX-4T-3/Myo5a-D1 recombinant plasmid

2.3 融合蛋白誘導表達 選重組質粒PGEX-4T-3/Myo5a-D1 與 空 載 體PGEX-4T-3 進 行IPTG 誘 導 表達，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白表達（圖3）。PGEX-4T-3/Myo5a-D1 經誘導后在裂解上清、沉淀、誘導后的總菌液中均產生分子質量約30 kD 的大量蛋白。與對照質粒PGEX-4T-3 表達的GST 蛋白（分子質量為29 kD）略高。表明融合蛋白誘導表達成功。

圖3 PGEX-4T-3/Myo5a-D1的原核表達產物的電泳鑒定Fig.3 Electrophoretic identification of prokaryotic expression product of pGEX-4T-3/Myo5a-D1

2.4 融和蛋白的純化鑒定 將裂解后上清采用鎳親和層析柱純化，結果見圖4，PGEX-4T-3/Myo5a-D1得到大量純化的蛋白。對PGEX-4T-3/Myo5a-D1 進行Western blot 鑒定，見圖5。顯色條帶大小約為30 kD，符合預期，表明目的蛋白表達成功。

圖4 蛋白純化的電泳鑒定Fig.4 Electrophoretic identification of protein purification

圖5 純化蛋白的免疫印跡鑒定Fig.5 Western blot identification of purified protein

2.5 多克隆抗體鑒定 包括滴度和特異性的測定。PGEX-4T-3/Myo5a-D1 融合蛋白包被酶標板，ELISA 間接法檢測制備的兔抗人PGEX-4T-3/Myo5a-D1抗血清滴度為1∶128 000。將兔抗人PGEX-4T-3/Myo5a-D1抗血清（1∶100 00）作為一抗，與PGEX-4T-3/Myo5a-D1融合蛋白反應，以Western blot 實驗檢測其抗原特異性，見圖6。結果表明，在分子量30 kD左右顯現(xiàn)特異條帶，說明兔抗人PGEX-4T-3/Myo5a-D1 多克隆抗體具有良好的抗原特異性。腦組織細胞因富含Myo5a 在熒光顯微鏡下出現(xiàn)綠色熒光，陰性對照無熒光（圖7）。證明制備的抗血清與天然的Myo5a蛋白發(fā)生特異性反應。

圖6 Western blot檢測兔抗血清Fig.6 Western blot detection of rabbit antiserum

圖7 免疫熒光染色Fig.7 Immunofluorescence staining

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)Myosin 中的很多類型都和各型腫瘤發(fā)生及發(fā)展關系密切?？赡茉蚴莻鹘y(tǒng)的Myosin的主要功能是參與肌肉收縮，而非傳統(tǒng)的Myosin 是細胞骨架的組成，為細胞質流動、物質運輸、有絲分裂、胞質裂解等提供所需的能源［5］。癌癥主要生物學特征是癌細胞轉移，癌細胞轉移涉及過程極其復雜，但有研究認為癌細胞轉移運動需要細胞骨架提供支撐與動力［6］。目前研究比較多的是非傳統(tǒng)的Myosin2、Myosin9 和Myosin10 等。研究顯示非傳統(tǒng)的Myosin2 與消化道腫瘤、乳腺癌、膀胱癌、肺癌等腫瘤有緊密的關系，也有研究表明適當?shù)腡 細胞反應和T細胞特異性抗原受體相互作用的強度與細胞骨架重組有關，絲狀肌動蛋白和非肌肉肌球蛋白Ⅱ（NMMⅡ）起主要作用［7-8］。Myosin9是近年新發(fā)現(xiàn)的癌細胞轉移相關蛋白，研究顯示，Myosin9 可促使胃癌細胞向腹膜轉移［9］。同時Myosin10可導致多種疾病，包括惡性腫瘤和病原微生物感染。與正常結直腸組織相比，結直腸癌組織中Myosin10 表達會明顯升高，推測Myosin10 可能與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展關系密切［10］。除結直腸癌外，也有研究報道Myosin10在乳腺癌和非小細胞肺癌等幾種侵襲性惡性腫瘤中高表達［11］。此外，乳腺癌患者的預后不良也與高水平的Myosin10 有關。而關于Myosin5 近十幾年也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，因此本研究選擇Myosin5作為切入點。

Myosin5 是迄今為止在細胞功能、酶性質和調控方面最具特色的非傳統(tǒng)肌球蛋白。脊椎動物有3 個Myosin5 基 因，分 別 編 碼Myo5a、Myo5b 和Myo5c［12］。Myosin5 參與了許多膜質載體：如分泌囊泡、液泡、黑素體、色素顆粒、循環(huán)核內體等和mRNA的運輸［13］。因此脊椎動物Myo5a的調控也已經受到了廣泛的關注。文獻顯示Myo5a高表達與腫瘤浸潤深度顯著相關。有文獻報道食管鱗狀細胞癌患者中Myo5a表達水平可用于預測腫瘤的侵襲性及預測患者的臨床生存期，可用于指導臨床診療方案和評估療效，此外，Myo5a在其他許多惡性腫瘤中高表達并與癌細胞侵襲相關，例如胰島細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌和惡性黑素瘤等［14-15］。因此，近年來對Myo5a 的運動和循環(huán)都進行了較深入的探討。

本文采用PCR擴增了Myo5a末端特異性片段的蛋白編碼序列，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，用原核表達載體pGEX-4T-3 將片段插入，構建了重組質粒PGEX-4T-3/Myo5a-D1。原核重組質粒PGEX-4T-3/Myo5a-D1 經測序等證實構建成功。而后將重組質粒依次轉化至大腸桿菌BL21 感受態(tài)細胞，經IPTG誘導重組蛋白表達，后制備了一個小片段的多克隆抗體。因國外有文獻報道，許多外源蛋白在BL21中表達時，以一種不溶性的沉淀即包涵體形式存在，這樣不利于外源蛋白施展生物學活性。所以本研究分別對菌體沉淀和裂解液中的蛋白質進行SDSPAGE 電泳，最后選取在裂解細菌后的上清中能找到目的蛋白的質粒，這樣的質粒才具有可溶的生物學活性。同時電泳顯示蛋白相對分子量約為30 kD，與預期相符。Western blot 也同時證實該蛋白具有免疫反應特異性。因此最終經過親和層析柱對蛋白進行了純化，得到了PGEX-4T-3/Myo5a-D1融合蛋白的純品制備多克隆抗體，為后續(xù)進一步研究Myo5a 與其他腫瘤的作用提供了鋪墊，從而能夠繼續(xù)探討Myo5a在癌細胞轉移中的作用。