LINC01410 調(diào)控miR-124/stat3 軸參與急性髓性白血病免疫逃逸的機(jī)制研究

袁 戎 易慧智 （信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，信陽 464000）

急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）作為一種具有高度異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤疾病，是由于骨髓和外周血中未成熟的髓細(xì)胞大量積累和擴(kuò)增導(dǎo)致的造血功能衰竭［1-2］。免疫治療雖已被認(rèn)作是最有前景的治療措施，但腫瘤細(xì)胞可躲避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視及殺傷，發(fā)生免疫逃逸，因此，詳細(xì)了解AML 的免疫逃逸機(jī)制對其治療極具意義［3-4］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lnc-RNA）是造血系統(tǒng)功能和發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，研究 發(fā) 現(xiàn)lncRNA 參 與AML 細(xì) 胞 的 免 疫 逃 逸［5-6］。LINC01410 作為一種lncRNA 在胃癌等腫瘤疾病中呈異常高表達(dá)狀態(tài)，但其對AML 免疫逃逸的影響還未見報(bào)道［7］。微小RNA（miRNA）作為高度保守的小分子非編碼RNA 參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及免疫逃逸，miR-124 已被發(fā)現(xiàn)可通過抑制信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal trans ducerand activator of transcription 3，stat3）表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的免疫逃逸，且miR-124 參與AML 的發(fā)生，抑制其表達(dá)可促進(jìn)AML 細(xì)胞的增殖［4，8］。已知stat3 在AML 患者骨髓標(biāo)本表達(dá)異常增加，參與AML 發(fā)生［9］。LINC01410 是否可能通過調(diào)控miR-124/stat3 軸影響AML 免疫逃逸值得探究，因此，本研究通過對LINC01410 在AML 免疫逃逸中的作用機(jī)制進(jìn)行探究，以期為AML 免疫逃逸存在潛在作用靶點(diǎn)的尋找提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料 LipofectamineTM2000 Transfection Reagent（上海研卉生物）；干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）ELISA 試劑盒、雙熒光素酶檢測試劑盒（北京索萊寶）；IL-2（蘇州賽業(yè)生物）；兔抗p-stat3、β-actin、stat3抗體、Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody（Cell Signaling Technology）。Insta Q48TM熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)購自上海威正翔禹生物；DAIHAN 凝膠成像系統(tǒng)購自上海連橋生物。

1.2 方法

1.2.1 骨髓及外周血樣本獲取 采集信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院2019 年3 月至2021 年5 月收治的21 例AML 患者骨髓樣本，患者平均年齡（31.65±8.43）歲，另取同時(shí)期25 例非惡性血液病患者骨髓樣本及外周血樣本，患者平均年齡（30.34±7.98）歲，經(jīng)過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均知情同意。

1.2.2 白細(xì)胞收集 將所得骨髓樣本與6 ml 紅細(xì)胞裂解液混勻后冰上靜置15 min，2 000 r/min 離心10 min，棄上清后加入4 ml紅細(xì)胞裂解液重懸，再次離心棄上清取下層白細(xì)胞。

1.2.3 自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）收集及培養(yǎng) 將經(jīng)肝素抗凝的非惡性血液病患者外周血（2 ml）與PBS 等比例混勻后加入淋巴細(xì)胞分離液，1 500 r/min 離心15 min 后混合液分為4 層，吸取位于第2 層的乳白色淋巴細(xì)胞層，再次離心后棄上清取單個(gè)核細(xì)胞。按2.5×108個(gè)/ml 加入磁珠緩沖液MACS（miltenyi）重 懸，NK 細(xì) 胞 生 物 素 化 抗 體（7.5 μl）孵育10 min，再次添加macs緩沖液（22.5 μl）及抗生物素化抗體磁珠（15 μl）孵育20 min，經(jīng)質(zhì)譜分離、洗柱收集細(xì)胞，添加CD56、CD3抗體進(jìn)行標(biāo)記后篩選NK 細(xì)胞，將NK 細(xì)胞接種于RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，作為對照組，NK 細(xì)胞經(jīng)20 ng/ml IL-2 刺激24 h后常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞作為IL-2組。

1.2.4 分組、轉(zhuǎn)染及共培養(yǎng) 將NK 細(xì)胞分為對照組、IL-2 組、sh-NC 組、sh-LINC01410 組、sh-LINC-01410+inhibitor NC 組、sh-LINC01410+miR-124 inhibitor 組、miR-NC 組、miR-124 mimics 組、miR-124 mimics+pcDNA3.1-stat3 組、miR-124 mimics+pcDNA 3.1 組，將所得的白細(xì)胞（1×105個(gè)/ml）接種到96 孔板中，使用LipofectamineTM2000 試劑盒對IL-2 組NK細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染后與白細(xì)胞以10∶1 的比例混勻共培養(yǎng)。

1.2.5 qRT-PCR 檢 測LINC01410 及miR-124 的 表達(dá) 使用TRIzol 法提取AML 患者、非惡性血液病患者骨髓以及對照組、IL-2組、sh-NC組、sh-LINC01410組、sh-LINC01410+inhibitor NC 組、sh-LINC01410+miR-124 inhibitor 組NK 細(xì) 胞 中 總RNA，逆 轉(zhuǎn) 錄 成cDNA 后 分 別 以U6、GAPDH 作 為miR-124 及LINC01410 的內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt分析miR-124及LINC01410表達(dá)（n=5），引物見表1。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.2.6 Western blot 檢測stat3 蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后的各組NK 細(xì)胞并經(jīng)蛋白裂解液裂解提取總蛋白，經(jīng)BCA 法定量、電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后，孵育兔抗p-stat3、β-actin、stat3（1∶1 000）抗體過夜，孵育2 h羊抗兔IgG（1∶3 000），避光孵育ECL發(fā)光液（5 min），使用成像儀進(jìn)行顯影，計(jì)算p-stat3/stat3 蛋白表達(dá)（n=5）。

1.2.7 ELISA 法檢測上清液中IFN-γ 含量 收集各組細(xì)胞共培養(yǎng)后的培養(yǎng)上清液后使用IFN-γ 試劑盒處理，于酶標(biāo)儀 光密度D450nm處檢 測IFN-γ 含 量（n=5）。

1.2.8 細(xì)胞毒性檢測 收集各組NK 細(xì)胞（5×105個(gè)/ml）作為效應(yīng)細(xì)胞，以白細(xì)胞為靶細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)分為效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組（100 μl NK 細(xì)胞懸液+100 μl 細(xì)胞培養(yǎng)液）、靶細(xì)胞自然釋放組（100 μl 白細(xì)胞懸液+100 μl 細(xì)胞培養(yǎng)液）、自然殺傷組（100 μl NK細(xì)胞懸液+100 μl白細(xì)胞懸液）、靶細(xì)胞最大釋放組（100 μl白細(xì)胞懸液+100 μl 2.5%的Triton X-100），培養(yǎng)4 h 后使用LDH 試劑盒檢測光密度D，計(jì)算細(xì)胞毒性（%）=（D自然殺傷組-D靶細(xì)胞自然釋放組-D效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組）/（D靶細(xì)胞最大釋放組-D靶細(xì)胞自然釋放組）×100%（n=5）。

1.2.9 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測LINC01410、miR-124、stat3 的靶向關(guān)系 starBase 網(wǎng)站預(yù)測miR-124分別與LINC01410、stat3 的結(jié)合位點(diǎn)；將含有miR-124 結(jié)合位點(diǎn)的LINC01410 及stat3 3'UTR 片段插入pMir-Report 載體上，構(gòu)建LINC01410-wt、stat3-wt 野生型載體，通過替換miR-124 結(jié)合片段產(chǎn)生突變構(gòu)建體，命名為LINC01410-mut、stat3-mut；將白細(xì)胞分為LINC01410-wt+miR-124 mimics 組、LINC01410-wt+miR-NC 組、LINC01410-mut+miR-124 mimics 組、LINC01410-mut+miR-NC 組、stat3-wt+miR-124 mimics組、stat3-wt+ miR-NC 組、stat3-mut+miR-124 mimics組、stat3-mut+miR-NC 組，將miR-NC、miR-124 mimics 分別與所構(gòu)建的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至白細(xì)胞中，24 h 后通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（Promega）計(jì)算海腎和螢火蟲熒光值，計(jì)算白細(xì)胞的相對熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)通過SPSS22.0 軟件分析，±s描述，多組數(shù)據(jù)比較行One-way ANOVA，SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步兩兩比較，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AML 以及非惡性血液病患者骨髓中LINC01410、miR-124表達(dá)水平比較 與非惡性血液病患者相比，AML 患者骨髓中LINC01410 表達(dá)顯著增加，miR-124表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 AML 以及非惡性血液病患者骨髓中LINC01410、miR-124表達(dá)比較（±s）Tab.2 Comparison of LINC01410 and miR-124 expressions in bone marrow of AML patients and non malignant hematological patients （±s）

表2 AML 以及非惡性血液病患者骨髓中LINC01410、miR-124表達(dá)比較（±s）Tab.2 Comparison of LINC01410 and miR-124 expressions in bone marrow of AML patients and non malignant hematological patients （±s）

Note：Compared with non malignant hematological diseases group， 1）P＜0.05.

Groups Non malignant hematological diseases AML n LINC01410 miR-124 0.99±0.04 0.42±0.061）37.122 0.000 25 21 t P--1.01±0.03 1.96±0.221）19.601 0.000

2.2 各組NK 細(xì)胞中LINC01410、miR-124 及stat3蛋白表達(dá)水平比較 與對照組相比，IL-2組NK細(xì)胞中LINC01410 及p-stat3/stat3 表 達(dá) 顯 著 降 低（P＜0.05），miR-124 表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與IL-2 組、sh-NC組相比，sh-LINC01410組LINC01410及p-stat3/stat3 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），miR-124 表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與sh-LINC01410 組、sh-LINC01410+inhibitor NC 組相比，sh-LINC01410+miR-124 inhibitor組LINC01410 表達(dá)無顯著變化（P＞0.05），而miR-124 表達(dá)顯著降低，p-stat3/stat3 表達(dá)顯著增加（P＜0.05），見表3、圖1。

圖1 各組NK細(xì)胞中stat3蛋白表達(dá)比較Fig.1 Comparison of stat3 protein expression in NK cells of each group

表3 各組NK細(xì)胞中LINC01410、miR-124及stat3蛋白表達(dá)比較（±s，n=5）Tab.3 Comparison of LINC01410， miR-124 and stat3 protein expressions in NK cells of each group（±s，n=5）

表3 各組NK細(xì)胞中LINC01410、miR-124及stat3蛋白表達(dá)比較（±s，n=5）Tab.3 Comparison of LINC01410， miR-124 and stat3 protein expressions in NK cells of each group（±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with IL-2 group， 2）P＜0.05； compared with sh-NC group， 3）P＜0.05； compared with sh-LINC01410 group， 4）P＜0.05； compared with sh-LINC01410+inhibitor NC group， 5）P＜0.05.

Groups Control IL-2 sh-NC sh-LINC01410 sh-LINC01410+inhibitor NC sh-LINC01410+miR-124 inhibitor LINC01410 0.99±0.05 0.52±0.041）0.53±0.05 0.24±0.022）3）miR-124 1.01±0.03 1.63±0.201）1.64±0.24 2.33±0.262）3）p-stat3/stat3 1.63±0.21 0.92±0.101）0.93±0.12 0.35±0.042）3）0.25±0.03 2.35±0.28 0.34±0.06 0.23±0.04 1.29±0.164）5）0.98±0.084）5）

2.3 LINC01410 及miR-124 表達(dá)沉默對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ 含量的影響 與對照組相比，IL-2組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ 含量顯著增加（P＜0.05）；與IL-2 組、sh-NC 組相比，sh-LINC01410 組IFN-γ含量顯著增加（P＜0.05）；與sh-LINC01410組、sh-LINC01410+inhibitor NC 組相比，sh-LINC01410+miR-124 inhibitor 組IFN-γ 含量顯著降低（P＜0.05），見表4。

表4 各組IFN-γ含量比較（±s，n=5）Tab.4 Comparison of IFN-γ content in each group （±s，n=5）

表4 各組IFN-γ含量比較（±s，n=5）Tab.4 Comparison of IFN-γ content in each group （±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with IL-2 group， 2）P＜0.05； compared with sh-NC group， 3）P＜0.05；compared with sh-LINC01410 group， 4）P＜0.05； compared with sh-LINC01410+inhibitor NC group， 5）P＜0.05.

IFN-γ/（pg·ml-1）40.19±4.32 83.27±6.141）82.50±5.63 129.52±6.982）3）130.81±7.60 85.92±5.744）5）Groups Control IL-2 sh-NC sh-LINC01410 sh-LINC01410+inhibitor NC sh-LINC01410+miR-124 inhibitor

2.4 LINC01410 及miR-124 表 達(dá) 沉 默 對NK 細(xì) 胞毒性的影響 與對照組相比，IL-2組NK細(xì)胞毒性顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；與IL-2 組、sh-NC 組相比，sh-LINC01410 組NK 細(xì)胞毒性顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；與sh-LINC01410 組、sh-LINC01410+inhibitor NC 組 相比，sh-LINC01410+miR-124 inhibitor 組NK 細(xì)胞毒性顯著降低（P＜0.05），見表5。

表5 各組NK細(xì)胞毒性比較（±s，n=5）Tab.5 Comparison of NK cytotoxicity in each group（±s，n=5）

表5 各組NK細(xì)胞毒性比較（±s，n=5）Tab.5 Comparison of NK cytotoxicity in each group（±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with IL-2 group， 2）P＜0.05； compared with sh-NC group， 3）P＜0.05；compared with sh-LINC01410 group， 4）P＜0.05； compared with sh-LINC01410+inhibitor NC group， 5）P＜0.05.

Cytotoxicity/%32.65±4.35 49.23±6.221）50.01±5.92 72.62±6.852）3）71.53±7.20 48.20±5.374）5）Groups Control IL-2 sh-NC sh-LINC01410 sh-LINC01410+inhibitor NC sh-LINC01410+miR-124 inhibitor

2.5 LINC01410、miR-124、stat3 的靶向關(guān)系驗(yàn)證starBase 預(yù)測顯示：LINC01410 與miR-124 間及miR-124與stat3間存在結(jié)合位點(diǎn)（圖2）；熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示：與LINC01410-wt+miR-NC 組相比，LINC01410-wt+miR-124 mimics 組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），LINC01410-mut+miR-124 mimics組、LINC01410-mut+miR-NC 組熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05），見圖3；與stat3-wt+miR-NC 組相比，stat3-wt+miR-124 mimics組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），stat3-mut+miR-124 mimics組、stat3-mut+miR-NC 組熒光素酶活性無顯著性變化（P＞0.05），見圖4。

圖3 熒光素酶活性檢測Fig.3 Detection of luciferase activity

圖4 熒光素酶活性檢測Fig.4 Luciferase activity assay

2.6 miR-124 及stat3 過表達(dá)對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ 含量及NK 細(xì)胞毒性作用的影響 與IL-2 組、miR-NC 組相比，miR-124 mimics 組IFN-γ 含量及NK細(xì)胞毒性顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；與miR-124 mimics組、miR-124 mimics+pcDNA3.1 組 相 比，miR-124 mimics+pcDNA3.1-stat3 組IFN-γ 含量及NK 細(xì)胞毒性顯著降低（P＜0.05），見表6。

表6 各組IFN-γ含量及NK細(xì)胞毒性比較（±s，n=5）Tab.6 Comparison of IFN-γ content and NK cytotoxicity in each group （±s，n=5）

表6 各組IFN-γ含量及NK細(xì)胞毒性比較（±s，n=5）Tab.6 Comparison of IFN-γ content and NK cytotoxicity in each group （±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with IL-2 group， 2）P＜0.05； compared with miR-NC group， 3）P＜0.05；compared with miR-124 mimics group， 4） P＜0.05； compared with miR-124 mimics+pcDNA3.1 NC group， 5） P＜0.05.

Cytotoxicity/%31.60±4.32 47.53±6.141）48.80±5.55 76.40±6.732）3）75.22±7.52 50.43±5.284）5）Groups Control IL-2 miR-NC miR-124 mimics miR-124 mimics+pcDNA3.1 miR-124 mimics+pcDNA3.1-stat3 IFN-γ/（pg·ml-1）40.10±4.35 82.07±6.331）83.10±5.86 135.22±7.862）3）136.82±8.64 86.92±7.154）5）

3 討論

AML 可通過基因融合、突變和表觀遺傳修飾來躲避NK 細(xì)胞的免疫監(jiān)視，造成免疫逃避的發(fā)生，而至今免疫逃逸的發(fā)生機(jī)制尚不清楚［10-11］。因此有必要對其深入探討。

腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制涉及NK 細(xì)胞等免疫細(xì)胞的細(xì)胞毒作用改變，NK 細(xì)胞作為機(jī)體抗腫瘤第一道防線，其功能異常會(huì)造成機(jī)體免疫耐受及功能障礙的發(fā)生，從而導(dǎo)致免疫逃逸［4，11］。lncRNA 可在細(xì)胞中充當(dāng)信號分子，調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)，如充當(dāng)miRNA 海綿，調(diào)控miRNA 表達(dá)［12］。但目前關(guān)于LINC01410 在AML 免疫逃逸機(jī)制中的相關(guān)研究還未見報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，AML 患者骨髓中LINC01410 表達(dá)顯著增加，LINC01410 參與AML 的發(fā)生；在IL-2 刺激的NK 細(xì)胞中LINC01410 顯著降低，IFN-γ 含量、NK 細(xì)胞毒性顯著增加，并且沉默LINC01410 表達(dá)后與AML 患者白細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用及IFN-γ 分泌，表明LINC01410表達(dá)沉默能夠有效增加NK細(xì)胞毒性，增強(qiáng)對AML 的殺傷作用，并通過釋放IFN-γ 等促進(jìn)其殺傷效應(yīng)，從而抑制免疫逃逸。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-124 是LINC01410 的靶基因。有研究報(bào)道，腫瘤抑制因子miR-124 在AML 患者骨髓中表達(dá)降低，其參與AML 的發(fā)生［13］。lncRNA SNHG16 沉默通過促進(jìn)miR-124-3p 表達(dá)在急性淋巴細(xì)胞白血病中起到腫瘤抑制作用［14］。近期有研究稱，miR-124 與IL-2、IFN-γ 等細(xì)胞因子表達(dá)與細(xì)胞免疫應(yīng)答有關(guān)［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，AML患者骨髓中miR-124表達(dá)顯著降低，IL-2 刺激的NK 細(xì)胞miR-124 表達(dá)顯著增加，與前述研究一致［13］，且沉默LINC01410后與AML 患者白細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)NK 細(xì)胞miR-124 表達(dá)，而miR-124 表達(dá)沉默可逆轉(zhuǎn)LINC01410 沉默對NK 細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果表明，LINC01410 表達(dá)沉默對AML 免疫逃逸的抑制作用可能與其促進(jìn)miR-124 表達(dá)有關(guān)。為進(jìn)一步對miR-124 在AML 免疫逃逸中的作用機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證，本研究對miR-124 過表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-124 過表達(dá)能夠有效促進(jìn)IFN-γ釋放及NK細(xì)胞毒性增加。

miRNA 可通過與目標(biāo)mRNA 3'-UTR 結(jié)合在轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)向調(diào)控其目標(biāo)基因表達(dá)，有研究表明，其主要通過拷貝數(shù)改變、表觀遺傳變化等機(jī)制參與AML 發(fā)?。?2］。本研究發(fā)現(xiàn)，stat3 是miR-124 的靶基因。miR-124過表達(dá)可通過抑制stat3表達(dá)增加NK 細(xì)胞對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，抑制免疫逃逸［4］。stat3作為轉(zhuǎn)錄因子參與多種類型的腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的發(fā)生［15-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-2 刺激的NK細(xì)胞中p-stat3/stat3 表達(dá)顯著降低，并且沉默LINC01410 后與AML 患者白細(xì)胞共培養(yǎng)抑制NK 細(xì)胞p-stat3/stat3 表達(dá)，miR-124 表達(dá)沉默可逆轉(zhuǎn)LINC01410 沉默對p-stat3/stat3 表達(dá)的抑制作用，上述結(jié)果表明，LINC01410 表達(dá)沉默可能通過促進(jìn)miR-124表達(dá)抑制stat3表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)stat3過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-124過表達(dá)對AML的殺傷作用。

綜上所述，LINC01410 沉默通過激活miR-124/stat3 軸抑制AML 免疫逃逸。本研究為AML 免疫逃逸機(jī)制的研究以及AML 治療靶點(diǎn)的尋找提供了線索。