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    SIRT2在結腸癌微環(huán)境CD4+T細胞向Th17細胞分化中的作用及對HIF-1α的影響①

    2023-11-13 09:29:44謝興旺武漢市第三醫(yī)院武漢430000
    中國免疫學雜志 2023年10期
    關鍵詞:瘤體結腸癌淋巴細胞

    蔣 斌 謝興旺 (武漢市第三醫(yī)院,武漢 430000)

    結腸癌是常見的消化道腫瘤,隱蔽性強,預后差[1]。機體免疫是控制癌細胞增長的防線,Th17 細胞是近年來發(fā)現(xiàn)的CD4+T 淋巴細胞亞群,Th17 在維持腸道內免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵作用,其分泌的IL-17、IL-22 等細胞因子是結直腸癌的促進因素[2-3]。張靜[4]研究顯示,老年結腸癌患者外周血中Th17 細胞比例顯著高于同期健康者,WANG 等[5]發(fā)現(xiàn)人參果濃縮物可通過抑制Th17 細胞分化預防結腸癌。Th17 分泌的IL-17 可通過促進腫瘤血管生成、促腫瘤增殖、轉移等途徑促進腫瘤進展[6-7]。因此抑制CD4+T 細胞的Th17 分化可能是結腸癌的治療途徑之一。沉默信息調節(jié)因子2(silent information regulator 2,SIRT2)是SIRTs家族成員,屬于去乙?;?,參與新陳代謝、基因表達沉默、DNA 損傷修復等多種過程,SIRTs 家族與腸道相關疾?。c炎、結腸癌)關系密切,但SIRT2 在結腸癌中的研究較少,XU等[8]認為硫肉豆蔻可通過阻斷Th17 分化和抑制SIRT2 誘導的代謝,改善結腸炎,且SIRT2 可能通過調控Th17 的分化發(fā)揮作用,SIRT2 能否在結腸癌中參與Th17 細胞分化仍未可知。缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在 結 腸 癌 患者、結腸癌細胞系中均呈高表達,且生物信息學網(wǎng)站中預測SIRT2 與HIF-1α 存在靶向關系[9-10]。因此,本研究重點探討SIRT2 在腫瘤微環(huán)境中CD4+T細胞向Th17 細胞分化中的作用以及對HIF-1α 的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 小鼠、細胞及試劑 小鼠結腸癌細胞CT26(CBP61189)購自南京科佰生物科技有限公司;SIRT2 過表達病毒由吉凱基因構建;SuperScript ⅥVILOTMcDNA 合成試劑盒(11754250)、SYBR Green PCR Mastermix(1309155)購自ThermoFisher;Trizol(R0016)、CCK-8 試劑盒(C0038)、TUNEL 試劑盒(C1091)購自上海碧云天公司;SIRT2(ab211033)、HIF-1α(ab51608)、GAPDH(ab8245)、Ki67(ab9274 2)、CD4-PE(ab252151)、IL-17-FITC(ab279597)抗體、HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗(ab6721)均購自美國Abcam 公 司;IL-17(ml1037866)、IL-6(ml002293-J)試劑盒購自上海酶聯(lián)公司;24 只C57BL/6 小鼠(雄性,6~8 周),許可證號:SCXK(湘)2019-0004,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng)及SIRT2 過表達 將CT26 細胞株置于DMEM 完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),置于CO2培養(yǎng)箱中,及時更換培養(yǎng)液(24 h),融合至80%左右傳代。取對數(shù)生長期CT26 細胞于6 孔板內,細胞量為1×105個/孔,待細胞貼壁后將完全培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基,并加入轉染試劑10 μg polybrene,加入SIRT2 過表達病毒(病毒∶細胞=80∶1),每8 h 更換1 次培養(yǎng)基,72 h 后添加1 μg/ml 嘌呤霉素篩選穩(wěn)定SIRT2過表達細胞,即CT26/SIRT2細胞。

    1.2.2 qRT-PCR檢測SIRT2 mRNA和HIF-1α mRNA水平 用Trizol 提取細胞總RNA。測定RNA 濃度,用試劑盒將mRNA 逆轉錄為cDNA。然后以cDNA為模板用SYBR Green PCR Mastermix 進行實時定量PCR檢測。反應條件為預熱50 ℃ 2 min,94 ℃ 10 min,然后94 ℃ 30 s,60 ℃ 1 min,共40 個循環(huán)。引物序列NCBI 的Primer-Blast 軟件設計,生物公司合成。采用2-ΔΔCt相對定量的方法對SIRT2 mRNA、HIF-1α mRNA進行定量。

    1.2.3 Western blot 法檢測SIRT2、HIF-1α 蛋白水平 用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液冰上提取細胞蛋白并用BCA 試劑盒測定蛋白濃度,將20 μg 細胞總蛋白上樣進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后將蛋白轉印至PVDF 膜。PVDF 膜置于5%脫脂奶粉中封閉2 h,用特異性一抗SIRT2、HIF-1α(1∶1 000稀釋)在4 ℃孵育過夜,膜經(jīng)TBST緩沖液漂洗3次后,用HRP標記的二抗室溫孵育1 h。膜經(jīng)TBST緩沖液漂洗3次后,用超級ECL發(fā)光試劑盒顯影并在成像系統(tǒng)上曝光,掃描結果經(jīng)圖像分析系統(tǒng)處理,測定各條帶光密度值進行定量分析。

    1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖抑制率 將對數(shù)生長期CT26、CT26/SIRT2細胞接種至96孔板(2×103個/孔),每 組 設 置6 個 復 孔,培 養(yǎng)48 h 后 每 孔 加 入10 μl CCK-8 溶液,37 ℃孵育2 h,利用酶標儀檢測450 nm處吸光度(OD),以CT26細胞為對照,CT26/SIRT2細胞增殖抑制率(%)=ODCT26/SIRT2/ODCT26×100%。

    1.2.5 結腸癌細胞移植瘤模型構建 取對數(shù)生長期CT26、CT26/SIRT2 細胞,調整細胞密度為1×107個/ml,注射10 μl于C57BL/6小鼠右后肢,每組各12 只,28 d 后處死,剝離小鼠腫瘤組織稱重,并觀測腫瘤體積,腫瘤體積=長徑×短徑2/2。

    1.2.6 Ki67 染色觀察腫瘤組織細胞增殖情況 每組選取6只小鼠腫瘤組織,一部分用4%多聚甲醛固定腫瘤組織制備石蠟切片,抗原修復后,血清封閉1 h,加入Ki67 抗體4 ℃反應過夜,PBS 洗滌3 次后,用生物素標記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h,PBS 洗滌3 次后加入鏈霉素卵白素工作液、DAB 染色液,蘇木素復染、脫水、透明、封片。隨機選取5個視野,觀察Ki67細胞陽性表達。

    1.2.7 TUNEL 染色觀察腫瘤組織細胞凋亡情況取1.2.6 中石蠟切片,通過TUNEL 試劑盒進行凋亡檢測,統(tǒng)計凋亡細胞數(shù)與總細胞數(shù),凋亡指數(shù)(%)=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

    1.2.8 腫瘤組織勻漿上清液IL-17、IL-6 表達 將1.2.6 中另一部分腫瘤組織勻漿后離心,吸取上清液,試劑盒檢測IL-17、IL-6水平。

    1.2.9 腫瘤組織淋巴細胞獲取 每組選取剩余6只小鼠腫瘤組織,修剪為1 mm×1 mm×1 mm組織塊,以含1 mg/ml膠原酶Ⅳ的RPMI1640培養(yǎng)基消化30 min(37 ℃),消化完成后制備為單個細胞懸液。離心5 min(1 200 r/min),懸浮細胞,加入5 ml淋巴細胞分離液,1 000 r/min 離心20 min 并收集淋巴細胞層,PBS洗滌2次,保存。

    1.2.10 流式細胞術檢測淋巴細胞中Th17 細胞比例 向淋巴細胞懸液(100 μl,1×106個/ml)內加入PE標記的CD4抗體,4 ℃孵育40 min,PBS洗2遍,加入FITC 標記的IL-17 抗體至終濃度為1 μg/ml,冰上孵 育20 min,PBS 洗 滌2 次,以 預 冷 的1 mmol/L EDTA-PBS 溶液懸浮細胞,調整濃度至1×107個/ml。采用流式細胞分選儀分選出CD4+Th17 細胞,檢測Th17 細胞在CD4+T 細胞中的比例。分選得到的Th17 細胞于含5 ml 預冷的RPMI 1640 培養(yǎng)基試管中保存,qRT-PCR 法與Western blot 法檢測Th17 細胞SIRT2、HIF-1α mRNA 與蛋白的表達,方法分別參照1.2.2、1.2.3。

    2 結果

    2.1 CT26/SIRT2 轉染細胞株的建立 倒置熒光顯微鏡下觀察細胞呈綠色熒光,熒光表達率90%以上,與CT26 細 胞 相 比,CT26/SIRT2 細 胞SIRT2 mRNA 水平與蛋白水平升高,HIF-1α mRNA 與蛋白水平降低(P<0.05,圖1、表1)。

    表1 CT26、CT26/SIRT2 細 胞SIRT2、HIF-1α mRNA 與蛋白表達(±s,n=6)Tab.1 mRNA and protein expressions of SIRT2 and HIF-1α in CT26 and CT26/SIRT2 cells (±s,n=6)

    表1 CT26、CT26/SIRT2 細 胞SIRT2、HIF-1α mRNA 與蛋白表達(±s,n=6)Tab.1 mRNA and protein expressions of SIRT2 and HIF-1α in CT26 and CT26/SIRT2 cells (±s,n=6)

    Groups CT26 CT26/SIRT2 SIRT2 mRNA 1.02±0.12 2.54±0.31 11.201 0.000 tP Protein 0.83±0.10 1.72±0.22 9.021 0.000 HIF-1α mRNA 1.01±0.13 0.26±0.03 13.770 0.000 Protein 0.52±0.06 0.11±0.01 16.510 0.000

    圖1 CT26/SIRT2細胞轉染情況Fig.1 CT26/SIRT2 cells transfection

    2.2 CT26、CT26/SIRT2 細胞增殖抑制率情況CT26、CT26/SIRT2組細胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表2)。

    表2 CT26、CT26/SIRT2細胞增殖抑制率(±s,n=6)Tab.2 Proliferation inhibition rate of CT26 and CT26/SIRT2 cells (±s,n=6)

    表2 CT26、CT26/SIRT2細胞增殖抑制率(±s,n=6)Tab.2 Proliferation inhibition rate of CT26 and CT26/SIRT2 cells (±s,n=6)

    Groups CT26 CT26/SIRT2 tP Proliferation inhibition rate/%100.00±0.00 98.75±12.34 0.248 0.809

    2.3 小鼠瘤體體積與重量 與CT26 小鼠相比,CT26/SIRT2 小鼠剝離瘤體體積與重量均降低(P<0.05,圖2、表3)。

    表3 CT26、CT26/SIRT2小鼠瘤體體積與重量(±s,n=12)Tab.3 Tumor volume and weight of CT26 and CT26/SIRT2 mice (±s,n=12)

    表3 CT26、CT26/SIRT2小鼠瘤體體積與重量(±s,n=12)Tab.3 Tumor volume and weight of CT26 and CT26/SIRT2 mice (±s,n=12)

    Groups CT26 CT26/SIRT2 tP Volume/mm3 465.82±58.22 174.67±21.54 16.247 0.000 Weight/g 0.54±0.06 0.21±0.02 18.075 0.000

    2.4 小鼠腫瘤組織細胞增殖、凋亡檢測 與CT26小鼠相比,CT26/SIRT2小鼠腫瘤組織Ki67陽性表達降低,細胞凋亡率升高(P<0.05,圖3、圖4、表4)。

    表4 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織細胞凋亡率(±s,n=6)Tab.4 Apoptosis rate of tumor tissues in CT26 and CT26/SIRT2 mice (±s,n=6)

    表4 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織細胞凋亡率(±s,n=6)Tab.4 Apoptosis rate of tumor tissues in CT26 and CT26/SIRT2 mice (±s,n=6)

    Groups CT26 CT26/SIRT2 tP Apoptosis rate/%13.24±1.62 25.64±3.17 8.532 0.000

    圖4 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織細胞凋亡情況(×400)Fig.4 Apoptosis in tumor tissues of CT26 and CT26/SIRT2 mice (×400)

    2.5 小鼠腫瘤組織淋巴細胞中Th17細胞比例 與CT26 小鼠相比,CT26/SIRT2 小鼠淋巴細胞中Th17細胞比例降低(P<0.05,圖5、表5)。

    表5 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織淋巴細胞中Th17細胞比例(±s,n=6)Tab.5 Proportion of Th17 cells in tumor tissue lymphocytes of CT26 and CT26/SIRT2 mice (±s,n=6)

    表5 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織淋巴細胞中Th17細胞比例(±s,n=6)Tab.5 Proportion of Th17 cells in tumor tissue lymphocytes of CT26 and CT26/SIRT2 mice (±s,n=6)

    Groups CT26 CT26/SIRT2 t P Th17/%19.76±2.48 7.64±0.94 11.194 0.000

    圖5 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織浸潤淋巴細胞中Th17細胞比例Fig.5 Proportion of Th17 cells in tumor infiltrating lymphocytes of CT26 and CT26/SIRT2 mice

    2.6 小鼠腫瘤組織勻漿上清液中IL-17、IL-6 水平 與CT26 小鼠比較,CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織勻漿上清液中IL-17、IL-6 水平均降低(P<0.05,表6)。2.7 小鼠腫瘤組織淋巴細胞中Th17 細胞SIRT2、HIF-1α mRNA 與蛋白表達情況 與CT26 小鼠相比,CT26/SIRT2小鼠腫瘤組織淋巴細胞中Th17細胞SIRT2 mRNA 和蛋白水平升高,HIF-1α mRNA 與蛋白水平降低(P<0.05,圖6、表7)。

    表6 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織勻漿上清液中IL-17、IL-6水平(±s,n=6,ng/ml)Tab.6 Levels of IL-17 and IL-6 in tumor tissue homogenate supernatant of CT26 and CT26/SIRT2 mice(±s,n=6,ng/ml)

    表6 CT26、CT26/SIRT2 小鼠腫瘤組織勻漿上清液中IL-17、IL-6水平(±s,n=6,ng/ml)Tab.6 Levels of IL-17 and IL-6 in tumor tissue homogenate supernatant of CT26 and CT26/SIRT2 mice(±s,n=6,ng/ml)

    Groups CT26 CT26/SIRT2 t P IL-17 88.62±11.08 35.61±4.45 10.875 0.000 IL-6 137.62±17.21 51.08±6.38 11.549 0.000

    表7 小鼠腫瘤組織淋巴細胞中Th17 細胞SIRT2、HIF-1α mRNA與蛋白表達情況(±s,n=6)Tab.7 Th17 cells SIRT2 and HIF-1α in lymphocytes of mouse tumor tissue mRNA and protein expressions (±s,n=6)

    表7 小鼠腫瘤組織淋巴細胞中Th17 細胞SIRT2、HIF-1α mRNA與蛋白表達情況(±s,n=6)Tab.7 Th17 cells SIRT2 and HIF-1α in lymphocytes of mouse tumor tissue mRNA and protein expressions (±s,n=6)

    Groups CT26 CT26/SIRT2 SIRT2 mRNA 1.01±0.13 2.54±0.32 10.850 0.000 t P Protein 0.66±0.08 1.59±0.19 11.050 0.000 HIF-1α mRNA 1.02±0.12 0.25±0.03 15.248 0.000 Protein 1.16±0.14 0.32±0.04 14.131 0.000

    圖6 Western blot 檢測小鼠腫瘤組織淋巴細胞中Th17細胞SIRT2、HIF-1α蛋白Fig.6 SIRT2 and HIF-1α proteins of Th17 cells were detected by Western blot analysis

    3 討論

    結腸癌是消化道惡性腫瘤之一,多與飲食習慣、遺傳因素有關,前期癥狀不明顯,不易引起重視,晚期擴展迅速、預后差,因此結腸癌重在防治。機體免疫系統(tǒng)在識別、殺傷癌細胞過程中發(fā)揮作用,正常情況下,機體免疫系統(tǒng)發(fā)揮對異常細胞清除作用,但當癌細胞數(shù)目過多或免疫能力受損時,癌細胞無須擴張,即可加重疾病進展。CD4+T 細胞是腫瘤免疫應答的關鍵,其可分化為Th1、Th2、Th17、Treg 等細胞,其中Th17 細胞在維持腸內免疫穩(wěn)態(tài)、抵御細胞外病原體、腫瘤血管生成方面發(fā)揮作用,Th17 細胞異常分化、分泌IL-17、IL-22 等細胞因子是結腸癌發(fā)生的重要因素[6-7]。SPS等[11]研究顯示,Ⅳ期結腸癌患者Th17相關細胞因子IL-17、IL-23、IL-25水平顯著高于Ⅲ期結直腸癌患者;SUN 等[12]研究顯示,結腸癌中腫瘤外泌體通過傳遞LncRNA crnde-h 促進Th17 細胞分化并加速癌癥進程;轉移性結直腸癌患者Th17細胞積聚,且貝伐單抗耐藥性增強[13]?;赥h17 的過度分化在結腸癌中發(fā)揮的不良作用,降低Th17細胞分化是治療結腸癌的可行方向之一。

    SIRT2 是SIRTs 家族成員,主要定位于細胞質。SIRTs 家族參與多系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展,在腸道疾病中,參與腸道炎癥、屏障修復等過程。LEE等[14]研究顯示,姜黃素通過共價修飾SIRT1 的半胱氨酸67 殘基抑制人結腸癌細胞的致癌性。SIRT2 在結腸癌中研究較少,其可調控黏連蛋白SMC1 磷酸化抑制結腸癌增殖[15]。本研究構建穩(wěn)定SIRT2過表達的結腸癌CT26 細胞株,記為CT26/SIRT2,并經(jīng)倒置顯微鏡、qRT-PCR 與Western blot 驗證轉染成功。CT26/SIRT2 細胞與CT26 細胞增殖抑制率相比并無顯著性差異,說明慢病毒轉染不影響CT26 的增殖能力,將CT26、CT26/SIRT2種植于小鼠皮下成瘤后,CT26/SIRT2 所形成的腫瘤體積及重量小于CT26 細胞所形成的,提示SIRT2 過表達可抑制瘤體的生長。CT26/SIRT2 小鼠分離瘤體淋巴細胞Th17 細胞比例以及所分泌的細胞因子水平均低于CT26 小鼠分離瘤體,提示腫瘤細胞SIRT2 過表達可能抑制Th17 分化,緩解炎癥損傷,但其調控Th17 的分化機理仍需繼續(xù)分析。檢測可知淋巴細胞Th17 細胞SIRT2 水平升高,其升高原因可能為腫瘤細胞內SIRT2 激活增加IL-17、IL-6 分泌,進一步激活腫瘤微環(huán)境中的SIRT2,進而影響免疫,至于影響Th17 細胞分化的SIRT2 來自腫瘤細胞還是Th17 本身,尚需進一步探討。

    HIF-1α 經(jīng)miR-448 過表達后下調,伴隨著結腸癌細胞SW480 侵襲、遷移速度減緩[10];HIF-1α 下調可減緩結腸癌細胞生長代謝速度,降低結腸癌細胞侵襲性[16]。以上研究均顯示HIF-1α 過表達在結腸癌中發(fā)揮不良作用。CHOU 等[17]研究顯示HIF-1α經(jīng)腫瘤抑制死亡相關蛋白激酶抑制后,降低Th17細胞的分化能力。此外,SIRT2 具有調控HIF-1α 的能力。HIF-1α 在調控Th17 分化中發(fā)揮重要作用,HIF-1α 可能被SIRT2調控參與Th17分化,最終影響結腸癌的免疫應答與炎癥反應[18]。本研究中,CT26/SIRT2 細胞的HIF-1α 水平低于CT26 細胞,即SIRT2過表達可降低HIF-1α水平,CT26/SIRT2小鼠分離瘤淋巴細胞中Th17細胞HIF-1α水平也顯著低于CT26小鼠。為此猜測SIRT2過表達可能通過調控HIF-1α參與對Th17 的調控,抑制瘤體增長,但SIRT2 是否通過降低HIF-1α表達發(fā)揮上述作用,仍需后續(xù)深入研究。

    綜上所述,SIRT2 可抑制結腸癌微環(huán)境CD4+T細胞向Th17 細胞分化,并下調HIF-1α 表達。但受限于資金、時間等,本研究尚未對SIRT2調控HIF-1α的作用機制進行深度探索,有待后續(xù)開展。

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