活血化濕湯通過靶向TP53 抑制M2 巨噬細(xì)胞極化與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲①

高莉萍 趙蘭婷 馮 倩 石軍年 （蘭州大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，蘭州 730030）

非 小 細(xì) 胞 肺 癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌病理學(xué)分類的一種，也是其中最常見的亞型，預(yù)后差［1］。中藥對癌癥的治療作用已被廣泛認(rèn)同，目前已發(fā)現(xiàn)多種單味中藥或復(fù)方湯劑對NSCLC 具有良好的治療作用［2］。如石泉玉珍湯抑制NSCLC 血管生成和腫瘤生長，促進免疫應(yīng)答［3］。在中醫(yī)的范疇內(nèi)，NSCLC 屬于“咳嗽、肺積、息賁”等，諸多國醫(yī)大師均認(rèn)為NSCLC 的發(fā)病不離肺脾，治法不離益氣化濕［4］?；钛瘽駵砂酌└?、白術(shù)、赤芍、赤小豆、大黃、黨參、茯苓、紅花、益母草、茵陳、玉米須、澤蘭、梔子等組成，已經(jīng)通過臨床試驗，對晚期肝癌黃疸具有良好的治療效果［5］。但對NSCLC的治療是否有效有待商榷。中醫(yī)方劑成分復(fù)雜，具有多作用途徑和多靶點的特征，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能通過構(gòu)建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，相對系統(tǒng)地將多種成分、多種靶點的復(fù)雜特性展示出來，對藥物、靶點和疾病的相互作用進行分析［6］。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建活血化濕湯-靶點-NSCLC 的相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析活血化濕湯對NSCLC 的治療作用及潛在靶點，為開發(fā)新藥提供理論和基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 10 周齡清潔級雄性SD 大鼠10 只，體質(zhì)量300～350 g，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（甘）2018-0002。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，陰暗/光照各12 h，自由攝食和飲水，每3 d 更換飼料和飲用水。本研究經(jīng)蘭州大學(xué)第二醫(yī)院動物倫理委員會審批（批號：D2021-083）。

1.1.2 主要試劑及儀器 活血化濕湯（基本方包括白茅根20 g、白術(shù)20 g、赤芍30 g、赤小豆20 g、大黃10 g、黨參30 g、茯苓20 g、紅花10 g、益母草10 g、茵陳30 g、玉米須20 g、澤蘭10 g、梔子10 g）由蘭州市中醫(yī)院熬制并制備為含生藥1 g/ml 的藥液，冷卻后置于-20 ℃?zhèn)溆?；BEAS-2B 細(xì)胞（CL-0496）、NCIH1299細(xì)胞（CL-0165）、THP-1細(xì)胞（CL-0233）、RPMI-1640 培養(yǎng)基（PM150110）、PBS（PB180327）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；引物設(shè)計由南京金斯瑞制作合成；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒購自上海吉瑪基因；佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）（70-CS1001）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；PE標(biāo)記的CD206抗體（321105）、FITC 標(biāo)記的CD86 抗體（374203）均購自BioLegend（北京）生物科技有限公司；ECL 顯影試劑（P0018S）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-1β ELISA 試劑盒（E-EL-H0149c）和CCL18 ELISA 試劑盒（E-EL-H1270c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；結(jié)晶紫染液（C8470）和Matrigel 基質(zhì)膠（356234）均購自北京索萊寶；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn) 染 試 劑（L3000007）、分 光 光 度 計（NanoDrop 2000）、Real Time PCR 系統(tǒng)（ABI 7500）均購自Thermo Fisher；TRIzol 試劑盒（15596-026）購自Invitrogen；PrimeScript RT 試劑盒（RR036A）、SYBR Premix ExTap Ⅱ試 劑 盒（RR820A）購 自TaKaRa；TP53（ab179477）、GAPDH（ab181602）和IgG（ab6721）抗體均購自英國Abcam；流式細(xì)胞儀（LSRFortessa）購自美國BD 公司；酶標(biāo)儀（SynergyHT）購自美國Bio Tek 公司；顯微鏡（DM2000）購自徠卡顯微系統(tǒng)公司。

1.2 方法

1.2.1 中藥有效成分及靶點的獲取 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https：//tcmsp-e.com）中檢索活血化濕湯的主要組成：白茅根、白術(shù)、赤芍、赤小豆、大黃、黨參、茯苓、紅花、益母草、茵陳、玉米須、澤蘭、梔子的有效活性成分及作用靶點，檢索條件設(shè)置為：口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug-Likeness，DL）≥18。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）對靶點名稱進行歸一化處理，統(tǒng)一以基因名表示，同時刪除無法轉(zhuǎn)化的靶點并去掉重復(fù)靶點。

1.2.2 NSCLC相關(guān)風(fēng)險基因的篩選 借助Malacards數(shù)據(jù)庫（https：//www.malacards.org）和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/search）查找NSCLC發(fā)病風(fēng)險基因，將兩個網(wǎng)站的結(jié)果進行綜合及去重復(fù)處理。

1.2.3 核心靶基因篩選 將NSCLC 的發(fā)病風(fēng)險基因與活血化濕湯的潛在作用靶基因利用Evenn 在線工具（http：//www.ehbio.com/test/venn/#/）取交集，將得到的交集在STRING 網(wǎng)站（https：//string-db.org/）中進行蛋白互作分析。

1.2.4 活血化濕湯含藥血清的制備 選用健康10 周齡雄性SD 大鼠10 只，體質(zhì)量300～350 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，依據(jù)“動物和人體表面積折算的等效劑量”對大鼠進行灌胃，灌胃劑量為10.8 g/（kg·d），2 次/d。采血前使大鼠空腹禁食12 h，末次灌胃2 h后采用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠并斷頸處死，取大鼠腹主動脈血，每只大鼠取血8 ml，采集的血液置于37 ℃水箱內(nèi)水浴20 min，之后以3 000 r/min 離心20 min，去上清，過濾并除菌后置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 MTT 法檢測活血化濕湯對NSCLC 細(xì)胞的最佳干預(yù)濃度和時間 取5×103個處于對數(shù)生長期的NCI-H1299 細(xì)胞置于96 孔板，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h 后加入濃度為5%、10%、20%的含藥血清各1 ml，同時設(shè)置加入等量PBS 的對照組。培養(yǎng)12 h、24 h和48 h后去除含藥血清培養(yǎng)液，加入100 μl MTT 試 劑，振 蕩 混 勻 后10 min 內(nèi) 上 酶 標(biāo) 儀 測 定570 nm處吸光度，統(tǒng)計并分析細(xì)胞增殖活力。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 將THP-1細(xì)胞、人正常支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B、人NSCLC 細(xì)胞系NCIH1299 置于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2。THP-1 細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)借助100 nmol/L PMA 完成，誘導(dǎo)時間48 h，之后收集THP-1 細(xì)胞并將其命名為M0 巨噬細(xì)胞用于后續(xù)研究。M0 巨噬細(xì)胞分別以PBS、活血化濕湯、活血化濕湯+TP53 過表達(dá)載體處理（TP53 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染24 h 后再以活血化濕湯處理48 h）。TP53 過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine 3000 試劑盒說明書完成。

1.2.7 qRT-PCR 檢測mRNA 表達(dá) TRIzol 試劑盒提取總RNA，NanoDrop 2000 分光光度計以及Prime-Script RT 試劑盒分別用于總RNA 濃度測定和逆轉(zhuǎn)錄操作執(zhí)行。之后以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為樣本，借助SYBR Premix ExTap Ⅱ試劑盒完成PCR 反應(yīng)，并結(jié)合7500 實時PCR 系統(tǒng)完成操作，反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循 環(huán)40 次。GAPDH 作為內(nèi)參。TP53 正向引物：5'-GTTATGAGCTATCGCGCTATA-3'，反向引物：5'-AATAGGCTTAGAGATATTGA-3'；GAPDH 正 向 引 物：5'-GGTTCTCTCTCAGCCCATCAAGT-3'，反向引物：5'-ACCTCGTGCACCTAAGTGTGCAA-3'。應(yīng)用2-ΔΔCt法計算TP53的相對表達(dá)量。

1.2.8 Western blot 檢測蛋白表達(dá) RIPA 裂解液對細(xì)胞進行裂解，并借助BCA 試劑盒完成蛋白濃度的測定。取20 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂奶粉封閉1 h。加入TP53（1∶10 000）、GAPDH（1∶2 500）一抗4 ℃孵育過夜。隔天TBST 洗膜，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h。膜上加入ECL 顯影試劑使蛋白條帶可視化，Image J軟件測定蛋白條帶灰度值。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測M1 型（CD86）和M2 型（CD206）巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá) 將M0 巨噬細(xì)胞以1×105個/孔接種于24 孔培養(yǎng)板，使用PBS、活血化濕湯、活血化濕湯+轉(zhuǎn)染過表達(dá)TP53處理后收集細(xì)胞，使用PE 標(biāo)記的CD206 與FITC 標(biāo)記的CD86 抗體與細(xì)胞共孵育30 min 后，轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞儀上分析，計算陽性細(xì)胞比例。

1.2.10 ELISA 檢測IL-1β、CCL18 的濃度 收集PBS 組、活血化濕湯組、活血化濕湯+TP53 組巨噬細(xì)胞上清，以3 500 r/min 離心5 min 后，ELISA 法測定細(xì)胞上清中IL-1β、CCL18的濃度。首先在對應(yīng)組細(xì)胞孔板中加入100 μl標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃孵育90 min，去除板內(nèi)液體并加入100 μl 生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min，洗板。之后每孔加入100 μl 的HRP 酶結(jié)合物工作液，37 ℃孵育30 min并洗板。加入90 μl底物溶液，37 ℃孵育15 min 后加入50 μl 終止液，酶標(biāo)儀測定450 nm處OD值。

1.2.11 Transwell 檢測細(xì)胞侵襲 在Transwell 小室上室預(yù)涂1 層Matrigel 膠，將1×105個NCI-H1299細(xì)胞接種于上室，下室加入含胎牛血清的培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)。此外，將NCI-H1299 細(xì)胞和不同條件（PBS、活血化濕湯）處理的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，以1∶1比例混合并分別接種于上室，下室同樣加入胎牛血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)。24 h 后多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡對侵襲細(xì)胞進行觀察和計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有計量資料采用SPSS23.0軟件進行分析，以±s表示。采用t檢驗分析兩組間數(shù)據(jù)差異，單因素方差分析比較多組間數(shù)據(jù)差異。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活血化濕湯含藥血清對NSCLC 細(xì)胞的最佳干預(yù)濃度和時間 MTT檢測結(jié)果顯示，相對于PBS組，活血化濕湯組各濃度梯度細(xì)胞活性均降低（均P＜0.05），其中，10%活血化濕湯干預(yù)組的細(xì)胞活性最低。此外，活血化濕湯處理24 h 的細(xì)胞增殖活力顯著低于12 h 和48 h（均P＜0.05），提示活血化濕湯對NSCLC 細(xì)胞的最佳干預(yù)濃度和時間分別為10%和24 h。見圖1。

2.2 活血化濕湯的有效活性成分及靶基因篩選TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索“活血化濕湯”組成藥物的有效活性成分及靶基因發(fā)現(xiàn)，白茅根活性成分7種、靶蛋白83種；白術(shù)活性成分7種、靶蛋白23種；赤芍活性成分29 種、靶蛋白151 種；赤小豆活性成分5 種、靶蛋白39種；大黃活性成分16種、靶蛋白110種；黨參活性成分21種、靶蛋白213種；茯苓活性成分15種、靶蛋白30種；紅花活性成分22種、靶蛋白439種；益母草活性成分8 種、靶蛋白320 種；茵陳活性成分13 種、靶蛋白362 種；玉米須活性成分12 種、靶蛋白119 種；澤蘭活性成分2 種、靶蛋白62 種；梔子活性成分15 種、靶蛋白356 種。經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換，去除重復(fù)基因，共得到217個靶基因，采用Cytoscape將靶基因可視化，構(gòu)建藥物-靶點互作用網(wǎng)絡(luò)（附圖1，www.immune99.com）。

2.3 核心靶基因的篩選 在Malacards與DisGeNET網(wǎng)站中查詢NSCLC的發(fā)病風(fēng)險基因，分別得到46個和107 個NSCLC 的發(fā)病風(fēng)險基因，數(shù)據(jù)經(jīng)過綜合去重后得到131個風(fēng)險基因。將風(fēng)險基因與活血化濕湯的靶基因取交集，得到17 個交集基因（附圖2，www.immune99.com）。將這17 個靶基因上傳至STRING 網(wǎng)站與Cytoscape 進行蛋白互作分析，結(jié)果顯示TP53與其他基因的交互作用最強，可能對其他基因的表達(dá)產(chǎn)生影響（圖2）。

圖2 核心靶基因的篩選結(jié)果Fig.2 Screening results of core target genes

2.4 活血化濕湯能抑制TP53 在NSCLC 中的高表達(dá) GEPIA 網(wǎng)站中顯示，相較于正常肺組織，TP53表達(dá)在肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）與肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）組織中均上調(diào)（圖3A）。本研究選擇NCI-H1299 細(xì)胞進行研究，并檢測細(xì)胞中TP53 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，NCI-H1299 細(xì)胞中TP53 表達(dá)較正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B 顯著上調(diào)，但經(jīng)活血化濕湯處理后的NCI-H1299 細(xì)胞中TP53表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05，圖3B～D）。

圖3 活血化濕湯抑制TP53在NSCLC中的表達(dá)Fig.3 Huoxue Huashi Decoction inhibits expression of TP53 in NSCLC

2.5 活血化濕湯通過降低TP53 的表達(dá)抑制M2 巨噬細(xì)胞極化 使用活血化濕湯處理M0 巨噬細(xì)胞，觀察巨噬細(xì)胞向M2 和M1 型巨噬細(xì)胞極化的趨勢。流式分析顯示，活血化濕湯處理后CD86 陽性細(xì)胞百分比上調(diào)，CD206陽性細(xì)胞百分比下調(diào)，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TP53過表達(dá)載體后，CD86陽性細(xì)胞百分比下調(diào)，CD206 陽性細(xì)胞百分比上調(diào)（均P＜0.05，圖4A、B）。同時，活血化濕湯處理后M1 巨噬細(xì)胞相關(guān)因子IL-1β 濃度升高，M2 巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子CCL18濃度降低，轉(zhuǎn)染TP53 過表達(dá)后，以上數(shù)據(jù)被部分逆轉(zhuǎn)（圖4C）。提示活血化濕湯抑制了巨噬細(xì)胞向M2方向的轉(zhuǎn)化，促進向M1方向轉(zhuǎn)化，而過表達(dá)TP53能部分削弱活血化濕湯的作用。

圖4 活血化濕湯通過抑制TP53 表達(dá)進而降低M2 型巨噬細(xì)胞極化Fig.4 Huoxue Huashi Decoction reduces M2-type macrophage polarization by inhibiting expression of TP53

2.6 活血化濕湯通過抑制TP53表達(dá)抑制NCI-H1299細(xì)胞侵襲 Transwell 結(jié)果表明，活血化濕湯處理后的NCI-H1299 細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著減少，但過表達(dá)TP53 后侵襲數(shù)量有所增多（均P＜0.05，圖5A）。將不同條件處理的巨噬細(xì)胞與NCI-H1299 細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)活血化濕湯處理后的巨噬細(xì)胞能顯著抑制NCI-H1299 細(xì)胞的侵襲，在NCI-H1299 細(xì)胞中過表達(dá)TP53 能部分抵消以上作用（均P＜0.05，圖5B）。提示活血化濕湯可通過抑制TP53 進而抑制M2 巨噬細(xì)胞極化，從而抑制NCI-H1299 細(xì)胞侵襲。本研究機制圖見圖5C。

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，強調(diào)從藥物靶點出發(fā)促進藥物治療效果的提高，對促進藥物實驗的成功率以及降低研發(fā)經(jīng)費均具有重要意義［7］。本文首先通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選活血化濕湯治療NSCLC 的主要潛在靶點，首先選出TP53。TP53是一種腫瘤突變蛋白質(zhì)，該蛋白在癌癥中普遍發(fā)生突變［8］。LUO 等［9］發(fā)現(xiàn)在斑馬魚中，肝臟特異性PTEN 和TP53突變之間的合作在遺傳上能誘導(dǎo)肝癌發(fā)生。WAN 等［10］發(fā)現(xiàn)在血管肉瘤標(biāo)本中TP53 免疫染色顯著升高。關(guān)于NSCLC 的研究揭示了耐藥NSCLC 細(xì) 胞 中TP53 的 表 達(dá) 升 高［11］。本 研 究 通 過GEPIA 網(wǎng)站預(yù)測到TP53 在LUAD 與LUSC 組織中表達(dá)均上調(diào)；qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)在NSCLC 細(xì)胞系NCIH1299 細(xì)胞中TP53 表達(dá)也較正常細(xì)胞顯著上調(diào)，活血化濕湯可抑制TP53表達(dá)，初步確認(rèn)活血化濕湯可能靶向TP53在NSCLC中發(fā)揮潛在作用。

巨噬細(xì)胞源于單核細(xì)胞，被證實是細(xì)胞免疫調(diào)控中非常重要的因素［12］。巨噬細(xì)胞在功能上存在異質(zhì)性，主要分為M1 和M2 兩個亞群，M1 型巨噬細(xì)胞仍具有抗原遞呈能力，可促進Th1反應(yīng)，與抗腫瘤有關(guān)；而M2 型巨噬細(xì)胞則具有促進腫瘤活性作用［13］。在癌癥早期，機體內(nèi)趨化因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1 轉(zhuǎn)化，發(fā)揮機體免疫作用，當(dāng)癌癥達(dá)到進展期，會促使M2 型細(xì)胞轉(zhuǎn)化來抑制免疫反應(yīng)，促進腫瘤進展［14］。此外，M2型巨噬細(xì)胞也被證實能夠參與肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)進展［15］。CD86 和CD206 分別為腫瘤M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其狀態(tài)的改變與腫瘤的遷移和侵襲等存在密切關(guān)聯(lián)［16-17］。IL-1β 是M1 型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志基因，與癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)［18］。而CCL18 是M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，與癌細(xì)胞的惡性行為及癌癥患者的預(yù)后不良存在關(guān)聯(lián)［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)活血化濕湯能抑制NSCLC 中M2 型巨噬細(xì)胞活化，進而抑制癌細(xì)胞的侵襲能力，且該作用被TP53 部分逆轉(zhuǎn)，進一步說明活血化濕湯通過TP53發(fā)揮對M2巨噬細(xì)胞活化與癌細(xì)胞侵襲的抑制作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步預(yù)測出活血化濕湯調(diào)控TP53，又進一步通過細(xì)胞實驗證實該猜測，并證明了活血化濕湯可通過TP53 抑制NSCLC 中M2 型巨噬細(xì)胞極化與癌細(xì)胞侵襲能力。但本研究未使用動物實驗進行驗證，結(jié)果可能存在差異，需要進一步研究驗證。綜上，本研究證實了活血化濕湯對NSCLC發(fā)展的抑制作用，為NSCLC的治療提供了新的方案和藥物治療靶點。