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    活血化濕湯通過靶向TP53 抑制M2 巨噬細(xì)胞極化與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲①

    2023-11-13 09:29:44高莉萍趙蘭婷石軍年蘭州大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科蘭州730030
    中國免疫學(xué)雜志 2023年10期
    關(guān)鍵詞:靶點活血試劑盒

    高莉萍 趙蘭婷 馮 倩 石軍年 (蘭州大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科,蘭州 730030)

    非 小 細(xì) 胞 肺 癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌病理學(xué)分類的一種,也是其中最常見的亞型,預(yù)后差[1]。中藥對癌癥的治療作用已被廣泛認(rèn)同,目前已發(fā)現(xiàn)多種單味中藥或復(fù)方湯劑對NSCLC 具有良好的治療作用[2]。如石泉玉珍湯抑制NSCLC 血管生成和腫瘤生長,促進免疫應(yīng)答[3]。在中醫(yī)的范疇內(nèi),NSCLC 屬于“咳嗽、肺積、息賁”等,諸多國醫(yī)大師均認(rèn)為NSCLC 的發(fā)病不離肺脾,治法不離益氣化濕[4]?;钛瘽駵砂酌└?、白術(shù)、赤芍、赤小豆、大黃、黨參、茯苓、紅花、益母草、茵陳、玉米須、澤蘭、梔子等組成,已經(jīng)通過臨床試驗,對晚期肝癌黃疸具有良好的治療效果[5]。但對NSCLC的治療是否有效有待商榷。中醫(yī)方劑成分復(fù)雜,具有多作用途徑和多靶點的特征,而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能通過構(gòu)建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò),相對系統(tǒng)地將多種成分、多種靶點的復(fù)雜特性展示出來,對藥物、靶點和疾病的相互作用進行分析[6]。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,構(gòu)建活血化濕湯-靶點-NSCLC 的相互作用網(wǎng)絡(luò),分析活血化濕湯對NSCLC 的治療作用及潛在靶點,為開發(fā)新藥提供理論和基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物 10 周齡清潔級雄性SD 大鼠10 只,體質(zhì)量300~350 g,由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(甘)2018-0002。大鼠常規(guī)飼養(yǎng),陰暗/光照各12 h,自由攝食和飲水,每3 d 更換飼料和飲用水。本研究經(jīng)蘭州大學(xué)第二醫(yī)院動物倫理委員會審批(批號:D2021-083)。

    1.1.2 主要試劑及儀器 活血化濕湯(基本方包括白茅根20 g、白術(shù)20 g、赤芍30 g、赤小豆20 g、大黃10 g、黨參30 g、茯苓20 g、紅花10 g、益母草10 g、茵陳30 g、玉米須20 g、澤蘭10 g、梔子10 g)由蘭州市中醫(yī)院熬制并制備為含生藥1 g/ml 的藥液,冷卻后置于-20 ℃?zhèn)溆?;BEAS-2B 細(xì)胞(CL-0496)、NCIH1299細(xì)胞(CL-0165)、THP-1細(xì)胞(CL-0233)、RPMI-1640 培養(yǎng)基(PM150110)、PBS(PB180327)均購自武漢普諾賽生命科技有限公司;引物設(shè)計由南京金斯瑞制作合成;轉(zhuǎn)染質(zhì)粒購自上海吉瑪基因;佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)(70-CS1001)購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司;PE標(biāo)記的CD206抗體(321105)、FITC 標(biāo)記的CD86 抗體(374203)均購自BioLegend(北京)生物科技有限公司;ECL 顯影試劑(P0018S)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;IL-1β ELISA 試劑盒(E-EL-H0149c)和CCL18 ELISA 試劑盒(E-EL-H1270c)均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;結(jié)晶紫染液(C8470)和Matrigel 基質(zhì)膠(356234)均購自北京索萊寶;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn) 染 試 劑(L3000007)、分 光 光 度 計(NanoDrop 2000)、Real Time PCR 系統(tǒng)(ABI 7500)均購自Thermo Fisher;TRIzol 試劑盒(15596-026)購自Invitrogen;PrimeScript RT 試劑盒(RR036A)、SYBR Premix ExTap Ⅱ試 劑 盒(RR820A)購 自TaKaRa;TP53(ab179477)、GAPDH(ab181602)和IgG(ab6721)抗體均購自英國Abcam;流式細(xì)胞儀(LSRFortessa)購自美國BD 公司;酶標(biāo)儀(SynergyHT)購自美國Bio Tek 公司;顯微鏡(DM2000)購自徠卡顯微系統(tǒng)公司。

    1.2 方法

    1.2.1 中藥有效成分及靶點的獲取 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(https://tcmsp-e.com)中檢索活血化濕湯的主要組成:白茅根、白術(shù)、赤芍、赤小豆、大黃、黨參、茯苓、紅花、益母草、茵陳、玉米須、澤蘭、梔子的有效活性成分及作用靶點,檢索條件設(shè)置為:口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%,類藥性(Drug-Likeness,DL)≥18。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)對靶點名稱進行歸一化處理,統(tǒng)一以基因名表示,同時刪除無法轉(zhuǎn)化的靶點并去掉重復(fù)靶點。

    1.2.2 NSCLC相關(guān)風(fēng)險基因的篩選 借助Malacards數(shù)據(jù)庫(https://www.malacards.org)和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/search)查找NSCLC發(fā)病風(fēng)險基因,將兩個網(wǎng)站的結(jié)果進行綜合及去重復(fù)處理。

    1.2.3 核心靶基因篩選 將NSCLC 的發(fā)病風(fēng)險基因與活血化濕湯的潛在作用靶基因利用Evenn 在線工具(http://www.ehbio.com/test/venn/#/)取交集,將得到的交集在STRING 網(wǎng)站(https://string-db.org/)中進行蛋白互作分析。

    1.2.4 活血化濕湯含藥血清的制備 選用健康10 周齡雄性SD 大鼠10 只,體質(zhì)量300~350 g,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后,依據(jù)“動物和人體表面積折算的等效劑量”對大鼠進行灌胃,灌胃劑量為10.8 g/(kg·d),2 次/d。采血前使大鼠空腹禁食12 h,末次灌胃2 h后采用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠并斷頸處死,取大鼠腹主動脈血,每只大鼠取血8 ml,采集的血液置于37 ℃水箱內(nèi)水浴20 min,之后以3 000 r/min 離心20 min,去上清,過濾并除菌后置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.5 MTT 法檢測活血化濕湯對NSCLC 細(xì)胞的最佳干預(yù)濃度和時間 取5×103個處于對數(shù)生長期的NCI-H1299 細(xì)胞置于96 孔板,在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h 后加入濃度為5%、10%、20%的含藥血清各1 ml,同時設(shè)置加入等量PBS 的對照組。培養(yǎng)12 h、24 h和48 h后去除含藥血清培養(yǎng)液,加入100 μl MTT 試 劑,振 蕩 混 勻 后10 min 內(nèi) 上 酶 標(biāo) 儀 測 定570 nm處吸光度,統(tǒng)計并分析細(xì)胞增殖活力。

    1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 將THP-1細(xì)胞、人正常支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B、人NSCLC 細(xì)胞系NCIH1299 置于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)條件:37 ℃、5%CO2。THP-1 細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)借助100 nmol/L PMA 完成,誘導(dǎo)時間48 h,之后收集THP-1 細(xì)胞并將其命名為M0 巨噬細(xì)胞用于后續(xù)研究。M0 巨噬細(xì)胞分別以PBS、活血化濕湯、活血化濕湯+TP53 過表達(dá)載體處理(TP53 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染24 h 后再以活血化濕湯處理48 h)。TP53 過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine 3000 試劑盒說明書完成。

    1.2.7 qRT-PCR 檢測mRNA 表達(dá) TRIzol 試劑盒提取總RNA,NanoDrop 2000 分光光度計以及Prime-Script RT 試劑盒分別用于總RNA 濃度測定和逆轉(zhuǎn)錄操作執(zhí)行。之后以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為樣本,借助SYBR Premix ExTap Ⅱ試劑盒完成PCR 反應(yīng),并結(jié)合7500 實時PCR 系統(tǒng)完成操作,反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,循 環(huán)40 次。GAPDH 作為內(nèi)參。TP53 正向引物:5'-GTTATGAGCTATCGCGCTATA-3',反向引物:5'-AATAGGCTTAGAGATATTGA-3';GAPDH 正 向 引 物:5'-GGTTCTCTCTCAGCCCATCAAGT-3',反向引物:5'-ACCTCGTGCACCTAAGTGTGCAA-3'。應(yīng)用2-ΔΔCt法計算TP53的相對表達(dá)量。

    1.2.8 Western blot 檢測蛋白表達(dá) RIPA 裂解液對細(xì)胞進行裂解,并借助BCA 試劑盒完成蛋白濃度的測定。取20 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂奶粉封閉1 h。加入TP53(1∶10 000)、GAPDH(1∶2 500)一抗4 ℃孵育過夜。隔天TBST 洗膜,加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。膜上加入ECL 顯影試劑使蛋白條帶可視化,Image J軟件測定蛋白條帶灰度值。

    1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測M1 型(CD86)和M2 型(CD206)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá) 將M0 巨噬細(xì)胞以1×105個/孔接種于24 孔培養(yǎng)板,使用PBS、活血化濕湯、活血化濕湯+轉(zhuǎn)染過表達(dá)TP53處理后收集細(xì)胞,使用PE 標(biāo)記的CD206 與FITC 標(biāo)記的CD86 抗體與細(xì)胞共孵育30 min 后,轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞儀上分析,計算陽性細(xì)胞比例。

    1.2.10 ELISA 檢測IL-1β、CCL18 的濃度 收集PBS 組、活血化濕湯組、活血化濕湯+TP53 組巨噬細(xì)胞上清,以3 500 r/min 離心5 min 后,ELISA 法測定細(xì)胞上清中IL-1β、CCL18的濃度。首先在對應(yīng)組細(xì)胞孔板中加入100 μl標(biāo)準(zhǔn)品,37 ℃孵育90 min,去除板內(nèi)液體并加入100 μl 生物素化抗體工作液,37 ℃孵育60 min,洗板。之后每孔加入100 μl 的HRP 酶結(jié)合物工作液,37 ℃孵育30 min并洗板。加入90 μl底物溶液,37 ℃孵育15 min 后加入50 μl 終止液,酶標(biāo)儀測定450 nm處OD值。

    1.2.11 Transwell 檢測細(xì)胞侵襲 在Transwell 小室上室預(yù)涂1 層Matrigel 膠,將1×105個NCI-H1299細(xì)胞接種于上室,下室加入含胎牛血清的培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)。此外,將NCI-H1299 細(xì)胞和不同條件(PBS、活血化濕湯)處理的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),以1∶1比例混合并分別接種于上室,下室同樣加入胎牛血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)。24 h 后多聚甲醛固定細(xì)胞,結(jié)晶紫染色,顯微鏡對侵襲細(xì)胞進行觀察和計數(shù)。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有計量資料采用SPSS23.0軟件進行分析,以±s表示。采用t檢驗分析兩組間數(shù)據(jù)差異,單因素方差分析比較多組間數(shù)據(jù)差異。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 活血化濕湯含藥血清對NSCLC 細(xì)胞的最佳干預(yù)濃度和時間 MTT檢測結(jié)果顯示,相對于PBS組,活血化濕湯組各濃度梯度細(xì)胞活性均降低(均P<0.05),其中,10%活血化濕湯干預(yù)組的細(xì)胞活性最低。此外,活血化濕湯處理24 h 的細(xì)胞增殖活力顯著低于12 h 和48 h(均P<0.05),提示活血化濕湯對NSCLC 細(xì)胞的最佳干預(yù)濃度和時間分別為10%和24 h。見圖1。

    2.2 活血化濕湯的有效活性成分及靶基因篩選TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索“活血化濕湯”組成藥物的有效活性成分及靶基因發(fā)現(xiàn),白茅根活性成分7種、靶蛋白83種;白術(shù)活性成分7種、靶蛋白23種;赤芍活性成分29 種、靶蛋白151 種;赤小豆活性成分5 種、靶蛋白39種;大黃活性成分16種、靶蛋白110種;黨參活性成分21種、靶蛋白213種;茯苓活性成分15種、靶蛋白30種;紅花活性成分22種、靶蛋白439種;益母草活性成分8 種、靶蛋白320 種;茵陳活性成分13 種、靶蛋白362 種;玉米須活性成分12 種、靶蛋白119 種;澤蘭活性成分2 種、靶蛋白62 種;梔子活性成分15 種、靶蛋白356 種。經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換,去除重復(fù)基因,共得到217個靶基因,采用Cytoscape將靶基因可視化,構(gòu)建藥物-靶點互作用網(wǎng)絡(luò)(附圖1,www.immune99.com)。

    2.3 核心靶基因的篩選 在Malacards與DisGeNET網(wǎng)站中查詢NSCLC的發(fā)病風(fēng)險基因,分別得到46個和107 個NSCLC 的發(fā)病風(fēng)險基因,數(shù)據(jù)經(jīng)過綜合去重后得到131個風(fēng)險基因。將風(fēng)險基因與活血化濕湯的靶基因取交集,得到17 個交集基因(附圖2,www.immune99.com)。將這17 個靶基因上傳至STRING 網(wǎng)站與Cytoscape 進行蛋白互作分析,結(jié)果顯示TP53與其他基因的交互作用最強,可能對其他基因的表達(dá)產(chǎn)生影響(圖2)。

    圖2 核心靶基因的篩選結(jié)果Fig.2 Screening results of core target genes

    2.4 活血化濕湯能抑制TP53 在NSCLC 中的高表達(dá) GEPIA 網(wǎng)站中顯示,相較于正常肺組織,TP53表達(dá)在肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)與肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)組織中均上調(diào)(圖3A)。本研究選擇NCI-H1299 細(xì)胞進行研究,并檢測細(xì)胞中TP53 的表達(dá)發(fā)現(xiàn),NCI-H1299 細(xì)胞中TP53 表達(dá)較正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B 顯著上調(diào),但經(jīng)活血化濕湯處理后的NCI-H1299 細(xì)胞中TP53表達(dá)下調(diào)(均P<0.05,圖3B~D)。

    圖3 活血化濕湯抑制TP53在NSCLC中的表達(dá)Fig.3 Huoxue Huashi Decoction inhibits expression of TP53 in NSCLC

    2.5 活血化濕湯通過降低TP53 的表達(dá)抑制M2 巨噬細(xì)胞極化 使用活血化濕湯處理M0 巨噬細(xì)胞,觀察巨噬細(xì)胞向M2 和M1 型巨噬細(xì)胞極化的趨勢。流式分析顯示,活血化濕湯處理后CD86 陽性細(xì)胞百分比上調(diào),CD206陽性細(xì)胞百分比下調(diào),在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TP53過表達(dá)載體后,CD86陽性細(xì)胞百分比下調(diào),CD206 陽性細(xì)胞百分比上調(diào)(均P<0.05,圖4A、B)。同時,活血化濕湯處理后M1 巨噬細(xì)胞相關(guān)因子IL-1β 濃度升高,M2 巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子CCL18濃度降低,轉(zhuǎn)染TP53 過表達(dá)后,以上數(shù)據(jù)被部分逆轉(zhuǎn)(圖4C)。提示活血化濕湯抑制了巨噬細(xì)胞向M2方向的轉(zhuǎn)化,促進向M1方向轉(zhuǎn)化,而過表達(dá)TP53能部分削弱活血化濕湯的作用。

    圖4 活血化濕湯通過抑制TP53 表達(dá)進而降低M2 型巨噬細(xì)胞極化Fig.4 Huoxue Huashi Decoction reduces M2-type macrophage polarization by inhibiting expression of TP53

    2.6 活血化濕湯通過抑制TP53表達(dá)抑制NCI-H1299細(xì)胞侵襲 Transwell 結(jié)果表明,活血化濕湯處理后的NCI-H1299 細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著減少,但過表達(dá)TP53 后侵襲數(shù)量有所增多(均P<0.05,圖5A)。將不同條件處理的巨噬細(xì)胞與NCI-H1299 細(xì)胞共培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)活血化濕湯處理后的巨噬細(xì)胞能顯著抑制NCI-H1299 細(xì)胞的侵襲,在NCI-H1299 細(xì)胞中過表達(dá)TP53 能部分抵消以上作用(均P<0.05,圖5B)。提示活血化濕湯可通過抑制TP53 進而抑制M2 巨噬細(xì)胞極化,從而抑制NCI-H1299 細(xì)胞侵襲。本研究機制圖見圖5C。

    3 討論

    網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ),強調(diào)從藥物靶點出發(fā)促進藥物治療效果的提高,對促進藥物實驗的成功率以及降低研發(fā)經(jīng)費均具有重要意義[7]。本文首先通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選活血化濕湯治療NSCLC 的主要潛在靶點,首先選出TP53。TP53是一種腫瘤突變蛋白質(zhì),該蛋白在癌癥中普遍發(fā)生突變[8]。LUO 等[9]發(fā)現(xiàn)在斑馬魚中,肝臟特異性PTEN 和TP53突變之間的合作在遺傳上能誘導(dǎo)肝癌發(fā)生。WAN 等[10]發(fā)現(xiàn)在血管肉瘤標(biāo)本中TP53 免疫染色顯著升高。關(guān)于NSCLC 的研究揭示了耐藥NSCLC 細(xì) 胞 中TP53 的 表 達(dá) 升 高[11]。本 研 究 通 過GEPIA 網(wǎng)站預(yù)測到TP53 在LUAD 與LUSC 組織中表達(dá)均上調(diào);qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)在NSCLC 細(xì)胞系NCIH1299 細(xì)胞中TP53 表達(dá)也較正常細(xì)胞顯著上調(diào),活血化濕湯可抑制TP53表達(dá),初步確認(rèn)活血化濕湯可能靶向TP53在NSCLC中發(fā)揮潛在作用。

    巨噬細(xì)胞源于單核細(xì)胞,被證實是細(xì)胞免疫調(diào)控中非常重要的因素[12]。巨噬細(xì)胞在功能上存在異質(zhì)性,主要分為M1 和M2 兩個亞群,M1 型巨噬細(xì)胞仍具有抗原遞呈能力,可促進Th1反應(yīng),與抗腫瘤有關(guān);而M2 型巨噬細(xì)胞則具有促進腫瘤活性作用[13]。在癌癥早期,機體內(nèi)趨化因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1 轉(zhuǎn)化,發(fā)揮機體免疫作用,當(dāng)癌癥達(dá)到進展期,會促使M2 型細(xì)胞轉(zhuǎn)化來抑制免疫反應(yīng),促進腫瘤進展[14]。此外,M2型巨噬細(xì)胞也被證實能夠參與肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)進展[15]。CD86 和CD206 分別為腫瘤M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)志物,其狀態(tài)的改變與腫瘤的遷移和侵襲等存在密切關(guān)聯(lián)[16-17]。IL-1β 是M1 型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志基因,與癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[18]。而CCL18 是M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物,與癌細(xì)胞的惡性行為及癌癥患者的預(yù)后不良存在關(guān)聯(lián)[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)活血化濕湯能抑制NSCLC 中M2 型巨噬細(xì)胞活化,進而抑制癌細(xì)胞的侵襲能力,且該作用被TP53 部分逆轉(zhuǎn),進一步說明活血化濕湯通過TP53發(fā)揮對M2巨噬細(xì)胞活化與癌細(xì)胞侵襲的抑制作用。

    本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步預(yù)測出活血化濕湯調(diào)控TP53,又進一步通過細(xì)胞實驗證實該猜測,并證明了活血化濕湯可通過TP53 抑制NSCLC 中M2 型巨噬細(xì)胞極化與癌細(xì)胞侵襲能力。但本研究未使用動物實驗進行驗證,結(jié)果可能存在差異,需要進一步研究驗證。綜上,本研究證實了活血化濕湯對NSCLC發(fā)展的抑制作用,為NSCLC的治療提供了新的方案和藥物治療靶點。

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