香蕉miR164-NAC 調(diào)控模塊的鑒定與分析

朱 虹，曾 俊,2，孔祥錦,2，彭 寬,2，朱孝揚，溫玲蓉，屈紅霞，蔣躍明

（1.中國科學(xué)院華南植物園/華南國家植物園，廣東 廣州 510650；2.中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642）

【研究意義】香蕉（Musaacuminata,AAA group）是芭蕉科芭蕉屬植物，營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟價值高。在我國，香蕉多以鮮食為主，而鮮食對于果實品質(zhì)的要求比加工更為苛刻。一方面，香蕉屬于呼吸躍變型果實，一旦啟動呼吸躍變，果實會迅速完成后熟，難以繼續(xù)貯藏和運輸。香蕉對乙烯十分敏感，因此抑制乙烯產(chǎn)生和延緩呼吸躍變的到來是控制香蕉后熟及貯藏保鮮的關(guān)鍵［1］。另一方面，作為熱帶水果的典型代表，香蕉對低溫十分敏感，田間生長低溫或采后貯運溫度過低都易發(fā)生冷害，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和果實品質(zhì)［2］。鑒于種質(zhì)資源缺乏和果實成熟及冷害調(diào)控的復(fù)雜性，目前針對香蕉采后成熟和冷害的控制仍面臨較大挑戰(zhàn)。因此，深入研究其后熟和冷害發(fā)生規(guī)律及調(diào)控機制，對于維持和提升香蕉采后品質(zhì)以及減輕冷害損失，具有重大的理論和實踐意義。【前人研究進(jìn)展】microRNA（簡稱miRNA）是真核生物中廣泛存在的一類對基因表達(dá)調(diào)控具有重要影響的非編碼小分子RNA，長度在20～24 個核苷酸。一般產(chǎn)生于基因的間隔區(qū)域，通過與靶基因互補配對的原則在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。成熟miRNA 序列在不同物種間表現(xiàn)出高度的進(jìn)化保守性，而其表達(dá)則具有嚴(yán)格的時空特異性，并受到環(huán)境條件的影響［3］。其中，miR164 最先在擬南芥和水稻中被報道，此后通過同源比對、克隆及高通量測序等技術(shù)，先后在多個植物物種中鑒定出miR164 家族的成員。經(jīng)miRBase 22.0 版數(shù)據(jù)庫檢索，miR164 家族目前共有70 個成員，來自39 個不同物種。雖然這些miR164 家族成員源自不同物種或同一物種不同的基因位點，且具有各異的前體序列，但它們的成熟序列卻高度同源，超過半數(shù)的成員在不同植物物種中的序列是完全相同的［4］。部分植物miR164 的功能已得到解析。例如，擬南芥中miR164 調(diào)控營養(yǎng)生長及花器官形成，且伴隨葉片衰老，miR164 的表達(dá)量會出現(xiàn)下降［5］。甜橙miR164 在球形胚發(fā)育過程中特異性表達(dá)，與球形胚的形成關(guān)系密切［6］。過表達(dá)miR164 的番茄出現(xiàn)花朵脫落延遲、果形奇特且不產(chǎn)種子的表型，證實miR164 參與調(diào)控花器官形成及果實發(fā)育［7］。此外，環(huán)境脅迫如低氮或鹽漬條件下，楊樹和棉花的特定miR164家族成員均表現(xiàn)出早期的上調(diào)表達(dá)，通過靶基因調(diào)節(jié)根系生長以適應(yīng)逆境脅迫［8-9］。盡管生信預(yù)測miR164 可能作用于多種類型的靶基因，但基于現(xiàn)有的研究報道，miR164 最主要的作用靶標(biāo)為NAC 家族轉(zhuǎn)錄因子。換言之，絕大多數(shù)植物都是通過miR164-NAC 這一保守的調(diào)控模塊來行使功能。例如，擬南芥miR164 家族中的3 個成員，分別靶向5 個與分生組織形成和器官邊界建成相關(guān)的NAC 家族轉(zhuǎn)錄因子。其中CUC1和CUC2基因在擬南芥球形胚的葉原基之間表達(dá)，miR164 通過負(fù)調(diào)控CUC1/2影響分生組織的發(fā)育和器官原基的邊界建立。NAC基因在胚發(fā)生和花發(fā)育過程中有重要作用，其功能缺失會導(dǎo)致花芽發(fā)育異常［10］。Guo 等［11］證 實miR164-NAC 調(diào)控模塊和生長素信號通路存在密切的互作關(guān)系，miR164 功能缺失突變體中NACmRNA 積累，生長素信號通路受阻，最終導(dǎo)致側(cè)根增加。相反，miR164 過表達(dá)會引發(fā)側(cè)根數(shù)目減少。近期研究揭示了miR164-GhCUC2 模塊通過調(diào)控脫落酸合成影響棉花的株型［12］，而番茄SlMIR164A可以通過控制SlNAM2和SlNAM3的表達(dá)調(diào)節(jié)果實的成熟及營養(yǎng)品質(zhì)［13］。NAC 家族是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子超家族，廣泛存在于植物界，其結(jié)構(gòu)域最初的特征在于來自NAM、ATAF1/2 和CUC2 的共有序列［14］。大多數(shù)NACs 蛋白具有保守的DNA 結(jié)合域，N 端包含約150 個氨基酸，參與行使NAC蛋白的多種獨特功能，而C 端具有高度可變的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，富含絲氨酸、蘇氨酸等殘基，且該區(qū)域在不同亞群中存在差異，可能賦予不同亞群NACs 蛋白間的功能變異。某些NAC 轉(zhuǎn)錄因子還在C 末端含有負(fù)責(zé)錨定到質(zhì)膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜基序，在需要表達(dá)時被蛋白水解切割后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核。通過對數(shù)百個不同物種NACs基因的進(jìn)化關(guān)系分析表明NAC 超家族內(nèi)部存在多個亞群，這些NAC 家族成員在植物生長發(fā)育、果實成熟衰老以及生物和非生物脅迫響應(yīng)等多個生物過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［15］。另一方面，對NACs 蛋白的結(jié)構(gòu)解析也取得一些進(jìn)展，如通過X 光衍射分別獲得ANAC019 和OsNAC1 保守域的晶體結(jié)構(gòu)，并推斷大多數(shù)NACs 蛋白可能以同源二聚體的形式發(fā)揮調(diào)控作用［16-17］?！颈狙芯壳腥朦c】解析果實成熟與抗逆調(diào)控機制一直是采后生物學(xué)的重要科學(xué)問題，目前相關(guān)研究還有待深入和拓展，特別是針對microRNA-靶基因模塊介導(dǎo)香蕉采后品質(zhì)形成和冷害發(fā)生的調(diào)控機制尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以香蕉為試驗對象，對其采后成熟及低溫脅迫下不同階段的香蕉果實進(jìn)行小RNA 測序，篩選分析與香蕉后熟及冷害密切相關(guān)的miR164 和NAC 轉(zhuǎn)錄因子，明確香蕉中的miR164-NAC 調(diào)控模塊，并對該模塊在香蕉后熟和冷害過程中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，以期為深入探究香蕉miR164-NAC 調(diào)控模塊的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

鑒于‘巴西蕉’高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)，一直是我國香蕉的主栽品種，本試驗選取其作為研究對象。果實于2019 年8 月采自廣東省廣州市南沙區(qū)萬頃沙蕉園，采收時果實飽滿度為7～8 成，采收后立即運回實驗室。落梳后分為單個蕉指，清水清洗后再用0.1%施?？私? min 后自然晾干。挑選大小均勻、無病蟲害及機械傷的單果分成4 個處理：（1）對照組：自然后熟，置于23 ℃、相對濕度85%～90%條件下貯藏；（2）實驗組1：100 μL/L C2H4密閉處理18 h 后，置于23 ℃、相對濕度85%～90%條件下貯藏；（3）實驗組2：0.5 μL/L 1-MCP 密閉處理18 h 后，置于23 ℃、相對濕度85%～90%條件下貯藏；（4）實驗組3：置于6 ℃、相對濕度85%～90%條件下貯藏。每個處理150個果實，設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。分別在貯藏第0、2、4、6、8 d 取對照組與處理組的香蕉樣品，分離果皮和果肉，凍存。

1.2 試驗方法

1.2.1 香蕉miR164 家族成員的鑒定及進(jìn)化分析 首先基于前期的sRNA 高通量測序分析［18］，獲得香蕉中6 條MIR164基因家族成員的前體基因組定位、長度、自由能、miRNA 成熟序列及miR* star 序列等信息。根據(jù)前體序列信息，利用在線RNAfold 網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）分析香蕉MIR164基因家族前體序列的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后從miRBase 數(shù)據(jù)庫（www.mirbase.org）下載所有植物物種MIR164基因家族成員的前體序列和成熟序列，按科屬分類統(tǒng)計，利用Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對香蕉和其他代表性物種（選取禾本科、薔薇科及十字花科代表）MIR164s基因的前體序列和成熟序列進(jìn)行多重序列比對，分析進(jìn)化特征，并在此基礎(chǔ)上用iTOL 在線軟件基于參數(shù)臨近法對前體序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 香蕉NAC基因家族成員的miR164 靶位點預(yù)測及驗證 從前期香蕉sRNA 測序結(jié)果中獲取全部的成熟miR164 序列，使用Target prediction for plant microRNAs（TAPIR，http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/tapir/）對香蕉NAC基因家族的蛋白編碼序列進(jìn)行miR164 靶位點預(yù)測，Score 值設(shè)為5.0，自由能比值設(shè)為0.6。預(yù)測結(jié)果使用TBtools 中的Gene structure view 功能進(jìn)行可視化［19］。另一方面，基于香蕉降解組測序分析［18］，鑒定高置信度的miR164 的靶基因，以明確香蕉中特定的miR164-NAC 調(diào)控模塊。利用煙草瞬時表達(dá)體系進(jìn)一步驗證miR164 與靶基因的互作需要兩類載體［20］：一類為miRNA 超表達(dá)載體pBI121。設(shè)計引物用PCR 方法獲得MIR164基因的前體，替代pBI121 載體中的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）基因完成miR164 超表達(dá)載體的構(gòu)建。另一類為改造過的綠色熒光蛋白GFP 超表達(dá)載體pMS4，其中GFP基因前有兩個酶切位點XhoI 和XbaI，雙酶切后用于插入miR164 在靶基因上的結(jié)合位點片段，該片段由兩段寡核苷酸DNA 退火后合成。miR164 和靶位點如果能在煙草葉片上互作，則GFP 表達(dá)被抑制，熒光信號減弱。

1.2.3 香蕉NAC基因家族成員的鑒定分析 從第4 版香蕉基因組數(shù)據(jù)庫（Version 4.3）下載全基因組文件，包括全部氨基酸序列和gff3 注釋文件。分別在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫（TAIR，http://www.arabidopsis.org/）和植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）下載擬南芥和水稻的NAC 同源氨基酸序列，經(jīng)手動去重后，共得到100 個擬南芥和141 個水稻的NACs 蛋白，建立參考序列庫。采用TBtools 軟件［19］的BLAST工具來檢索香蕉基因組中的潛在NACs基因，其中E-value cutoff 設(shè)置為e-10，其他參數(shù)默認(rèn)。從PFAM 蛋白數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）下載氨基酸序列NAM 保守結(jié)構(gòu)域（PF02365）的HMM文件，在E-value cutoff 為0.01、其他參數(shù)默認(rèn)的設(shè)置下，使用TBtools 軟件的Simple Hmm Search來搜索香蕉基因組中的NACs基因。將BLAST 和Hmm Search 結(jié)果合并，手動去重，將所有篩選出的候選NACs基因氨基酸序列使用Pfam 和NCBI的CDD 數(shù)據(jù)庫驗證蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域。含有NAM 結(jié)構(gòu)域的序列被確定為香蕉NAC基因家族成員，并根據(jù)其所在染色體位置的先后順序?qū)λ鼈冞M(jìn)行重命名。通過TBtools 中的Gene location visualize from GTF/GFF 工具，使用香蕉基因組的GFF3 注釋文件來創(chuàng)建香蕉NACs基因的染色體定位圖。使用MCScanX 對香蕉基因組內(nèi)的同源復(fù)制事件進(jìn)行分析，并通過TBtools 中的Advanced Circos 對香蕉NACs基因進(jìn)行共線性分析。借助NCBI CDD 數(shù)據(jù)庫確定香蕉NACs 蛋白保守結(jié)構(gòu)域NAM 域所在的具體位置，并使用TBtools 中的Gene structure view 功能對香蕉NACs基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化［19］。同時，利用ExPASy（www.expasy.org）網(wǎng)站中的ProtParam 工具對香蕉NACs 蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.2.4 香蕉NACs 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 使用ClustalX 2.0 對擬南芥、水稻和香蕉NACs 進(jìn)行氨基酸多序列比對，利用TBtools 中的trimAL Wrapper 對多序列比對后的結(jié)果文件進(jìn)行修剪，通過IQ-Tree 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，參數(shù)默認(rèn)，最后使用iTOL 在線網(wǎng)站進(jìn)行美化。

1.2.5 香蕉RNA 提取及小分子RNA 的Northern雜交 香蕉總RNA 的提取在熱硼法基礎(chǔ)上略有改動，具體參考曾俊［21］方法。小分子RNA Northern 雜交實驗參考文獻(xiàn)［20］并略作改動。配制15% PAGE 工作液，充分溶解后迅速加入10% APS 和凝固劑TEMED，隨即灌膠插梳。等膠凝固后拔出梳子，電泳槽中加入適量1×TBE電泳液，120 V 預(yù)電泳30 min。RNA 樣品制備：取總RNA 20 μL（濃度為1 μg/μL），加入20 μL 2×上樣緩沖液，98 ℃變性2 min，快速置于冰上備用。預(yù)電泳結(jié)束后用注射器沖洗點樣孔數(shù)次，點入RNA 樣品。60 V 電壓電泳30 min，接著調(diào)整為120 V 電泳90 min，直至下層溴酚藍(lán)指示劑遷移至距離膠底部約1 cm 左右停止電泳。然后使用Mini 垂直電轉(zhuǎn)槽（Bio Rad），設(shè)置60 V 電壓，轉(zhuǎn)膜90 min。隨后紫外交聯(lián)固定樣品，60 ℃烘膜2 h 后裝袋，4 ℃保存。使用Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit（Thermo Scientific）進(jìn)行雜交及信號檢測，3’端生物素標(biāo)記的雜交檢測探針與miR164 成熟序列反向互補，選擇香蕉U6 片段作為內(nèi)參，探針由上海生工生物合成，序列見表1。配制雜交工作液，將膜正面朝內(nèi)，貼放于玻璃雜交管中，加入雜交工作液在37 ℃預(yù)雜交30 min，隨后在預(yù)雜交液中加入5 μL 生物素標(biāo)記的miR164 探針（濃度為5 μmol/L），同樣37 ℃雜交16～20 h。第2 d 在37 ℃雜交爐內(nèi)，滾動洗膜。棄去雜交管中的嚴(yán)謹(jǐn)洗膜液，加入5 mL 顯色試劑盒（Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module）中提供的封阻液，雜交爐溫調(diào)至25 ℃，滾動封阻15 min。再取20 μL 鏈親和素-辣根過氧化物酶（HRP，Streptavidin-Horseradish peroxidase conjugate），加入1 mL 封阻液中，再將混合液加入上一步封阻液中，繼續(xù)室溫滾動15 min。棄封阻液，加入10 mL 1×檢測洗液洗膜。將膜從雜交管轉(zhuǎn)移至干凈洗盒中，加入底物平衡液50 mL，室溫勻速搖動5 min，混合250 μL 魯米諾溶液（Luminol/Enhancer solution）和250 μL H2O2溶液配制底物工作液。膜正面朝上平鋪于透明夾膜上，加入底物工作液使其均勻覆蓋整個膜，暗處室溫孵育5 min。使用ChemiDocTMTouch Imaging System 成像系統(tǒng)（Bio Rad）檢測雜交信號。根據(jù)信號強弱調(diào)整曝光模式及時長。

表1 RNA 探針和實時qPCR 引物序列Table 1 RNA hybridization probes and primers for real-time qPCR

1.2.6 香蕉NAC靶基因反轉(zhuǎn)錄及定量PCR 采用TaKaRa PrimescriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（RR047A）對質(zhì)量過關(guān)的香蕉總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參照試劑盒說明書操作。將所得cDNA 溶液濃度統(tǒng)一稀釋成50 ng/μL。靶基因定量PCR 采用TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒，依次加入10 μL TB Green Premix Ex Taq II（2×）、0.4 μL ROX Reference Dye II（50×）、0.4 μL Forward Primer（10 μmol/L）、0.4 μL Reverse Primer（10 μmol/L）、6.8 μL 超純水以及2 μL cDNA，總體系為20 μL。使用ABI 公司7500 Fast 熒光定量PCR 儀進(jìn)行反應(yīng)，程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)置熔解反應(yīng)95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃15 s。使用Beacon Designer 8.0 軟件設(shè)計靶基因定量PCR 的引物，交由上海生工生物合成。定量PCR 選擇香蕉RPS2作為內(nèi)參基因，靶基因定量PCR 引物見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉miR164 家族成員的鑒定及進(jìn)化分析

基于前期sRNA 測序結(jié)果，在香蕉中鑒定到6 個MIR164基因家族成員（相應(yīng)成熟miR164 序列分別命名為mac-miR164 a～f），通過將這6 條前體序列比對到香蕉基因組V4.3，發(fā)現(xiàn)它們定位在第6、8 和11 號3 條染色體上，其中4 條位于4 個編碼基因的內(nèi)部，另外2 條則位于基因間區(qū)（詳見數(shù)據(jù)附表 S1）。定位于第11 號染色體上的2 條MIR164基因前體與編碼基因的外顯子部分重合，而定位于第8 和第6 號染色體上的2條前體則完全處于編碼基因的內(nèi)含子區(qū)域（圖1A）。經(jīng)搜索和基于植物MIRNA基因位點鑒定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，從miRbase 數(shù)據(jù)庫中共獲得131條MIR164基因的前體序列，共產(chǎn)生70 條非冗余的成熟miR164 序列。依據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫，miR164家族分布于18 科39 個植物物種中，屬于保守度較高的一類MIRNA基因家族。其中，禾本科報道的MIR164最多、達(dá)30 條，成熟序列有18 條，分布于7 個物種中；其次是薔薇科的4 個物種，有18 條前體序列和8 條成熟序列；排在第3 位的是十字花科5 個物種，共報道16 條前體序列和10 條成熟miR164 序列。從分布上看，miR164廣泛分布在單雙子葉植物中，甚至也同樣存在于被子植物最原始的無油樟科植物互葉梅中。將香蕉中鑒定到的miR164 成熟序列與39 個已報道植物物種中的非冗余miR164 成熟序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示miR164 成熟序列在5’端較為保守，尤其是前8 位，而3’端序列呈現(xiàn)多變性，特別是第17、20 和21 位的序列，在不同物種中差異較為明顯，其中香蕉miR164 也貢獻(xiàn)了部分多樣性（圖1B）。比對結(jié)果表明該家族的基因擴張在進(jìn)化過程中存在明顯的重排和篩選，暗示其在不同物種中調(diào)控的復(fù)雜性，值得深入研究。接著分析測序鑒定到的香蕉6 條miR164 家族成員前體序列的二級結(jié)構(gòu)。如圖1C 所示，這些前體序列的長度介于100～120 nt，具有MIRNA基因前體典型的發(fā)夾莖環(huán)結(jié)構(gòu)和較低的自由能（-70～-45 kcal/mol）。圖中紅色和藍(lán)色標(biāo)記的序列分別代表miRNA 成熟序列和miR* star 序列，其中有2 條前體未檢測到miR*star 序列的表達(dá)。通過對香蕉與禾本科、薔薇科及十字花科代表物種擬南芥的MIR164基因前體序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)該家族能在單、雙子葉植物間明顯區(qū)分開來。但香蕉的6 條MIR164基因前體并沒有全部聚在一起，而是分布在3 個亞群中，其中有5 條均與熱帶雙子葉植物番木瓜聚為一類，包括測序豐度較高的mac-miR164a/b 和mac-miR164c，僅有一條低豐度的mac-miR164f 與單子葉禾本科植物聚為一類（圖1D），這暗示香蕉MIR164基因家族的起源與雙子葉植物更為接近。

圖1 香蕉miR164 家族成員鑒定及進(jìn)化分析Fig.1 Identification and evolutionary analysis of miR164 family members in banana

2.2 香蕉miR164 靶基因及miR164-NAC 調(diào)控模塊鑒定

首先利用psRNATarget在線軟件（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）對香蕉miR164 家族成員所有可能的靶基因進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)是編碼NAC 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子（詳見數(shù)據(jù)庫附表S2）。同時，結(jié)合香蕉NACs基因家族成員的鑒定，預(yù)測miR164 的結(jié)合位點。然而，在鑒定到的所有香蕉NACs基因中，僅有5%具有miR164 的靶位點，這暗示著miR164-NAC 調(diào)控模塊可能在香蕉物種進(jìn)化過程中出現(xiàn)較晚，且miR164 靶點均位于接近NAM 保守結(jié)構(gòu)域的3’UTR 區(qū)域（圖2A）。另一方面，前期的香蕉降解組測序共鑒定到4 條受miR164 切割的NACs靶基因（均屬于0類高置信靶基因，詳見數(shù)據(jù)庫附表S3）。降解組t-plot 證實，miR164 對這幾個NACs靶基因都有較高的剪切效率，且切割位點較為一致（圖2B～圖2D）。煙草葉片的瞬轉(zhuǎn)實驗則進(jìn)一步驗證了miR164c 對香蕉NAC176的抑制作用（圖2E）。而香蕉中這幾個miR164 的NACs靶基因均位于第9 號染色體上。

圖2 香蕉miR164 靶基因及miR164-NAC 調(diào)控模塊鑒定Fig.2 Identification of miR164 target genes and miR164-NAC regulatory module in banana

2.3 香蕉NAC 基因家族成員的鑒定分析

通過同源序列比對結(jié)合手動驗證蛋白保守結(jié)構(gòu)域，從第4 版香蕉基因組中共鑒定到222 個NACs成員，比基于第2 版基因組鑒定的結(jié)果多出41 個［22］，按照所在染色體位置分別命名為MaNAC001～MaNAC222（詳見數(shù)據(jù)庫附表S4）。如圖3 所示，這222 個香蕉NACs不均勻地分布在所有11 條染色體上。其中，6 號染色體編碼最多、達(dá)32 個NACs基因，其次是10 號染色體、含28個NACs基因，8 號染色體僅編碼12 個NACs基因。這些數(shù)量龐大的NACs基因可能源自芭蕉屬譜系中發(fā)生的3 輪全基因組復(fù)制（WGD）事件。此外，串聯(lián)重復(fù)和區(qū)段復(fù)制在香蕉NAC家族的顯著擴張中也可能起到重要作用［23-24］。

圖3 香蕉NAC 基因家族成員的染色體定位Fig.3 Chromosomal locations of in NAC gene family members in banana

使用默認(rèn)參數(shù)，通過MCScanX 對每個香蕉NAC基因的重復(fù)事件進(jìn)行分析，在222 個香蕉NACs中共鑒定出134 對同源基因，其中1、2 和4 號染色體上共存在4 對串聯(lián)重復(fù)基因，其余130對同源基因均為區(qū)段復(fù)制，表明香蕉NACs基因進(jìn)化的主要動力來源于基因的區(qū)段復(fù)制事件（詳見數(shù)據(jù)庫附表S5）。如圖4 所示，香蕉NACs基因位于幾乎所有染色體的同線性區(qū)塊內(nèi)。相應(yīng)地，含有較多NACs基因的6 號和10 號染色體上區(qū)塊間存在較多共線性關(guān)系。然而，1 號染色體雖然也編碼數(shù)量較多的NACs基因，但卻基本聚集在染色體的末端位置，且僅存在1 對串聯(lián)重復(fù)和4對片段復(fù)制的同源基因，因而共線性關(guān)系也相對簡單（圖4）。

圖4 香蕉NAC 基因家族成員在染色體上的關(guān)聯(lián)Fig.4 Interchromosomal association of NAC gene family members in banana

2.4 香蕉NAC 基因家族成員的進(jìn)化分析

為研究香蕉NAC基因家族的進(jìn)化特征，對香蕉、擬南芥和水稻NACs 蛋白序列進(jìn)行比較系統(tǒng)發(fā)育和亞群分布的分析。系統(tǒng)發(fā)育樹將NAC 家族蛋白劃分為23 個不同的亞群，比先前報道的分類［22］多出5 個亞群。如圖5 所示，沒有任何香蕉NACs基因分布在S5、S13 和S20 亞群中，而另一些香蕉NACs基因則形成獨立的亞群，如S1、S2、S3、S8、S21 和S23。此外，絕大部分混合亞群同時含有來自單子葉植物和雙子葉植物的NACs基因，表明這一超家族在單、雙子葉物種中并非完全獨立進(jìn)化?？傮w而言，香蕉NACs基因在大多數(shù)進(jìn)化分支中占據(jù)主導(dǎo)地位，尤其是S14 亞群（圖5）。香蕉NACs基因在S14 亞群中的數(shù)量最多達(dá)61 個，其次是S15 和S12 亞群，分別包含36 個和20 個NACs基因。在香蕉NACs基因形成的6 個獨立亞群中，數(shù)目較多的是S1 和S2 亞群，分別含有24 個和14 個NACs基因，表明這些香蕉NACs很可能是在水稻中丟失后又在香蕉中分化獲得的，暗示其可能具有特定功能。但轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，僅有不到30%的NACs基因在香蕉后熟過程中或低溫脅迫下有表達(dá)（詳見數(shù)據(jù)庫附表S6），表明香蕉NACs基因高度冗余，或某些NACs基因可能只在特定條件下才表達(dá)及發(fā)揮功能。

圖5 香蕉與擬南芥、水稻NAC 轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of NAC transcription factors from banana,Arabidopsis thaliana and Oryza sativa

2.5 香蕉NACs 基因的結(jié)構(gòu)與功能分析

基于蛋白比對構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，在此背景下對有表達(dá)的66 個香蕉NACs基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行注釋，明確其外顯子-內(nèi)含子組成，并通過TBtools 進(jìn)行可視化。結(jié)果（圖6）表明，除MaNAC079僅含一個外顯子、無內(nèi)含子外，大部分香蕉NACs基因均含有3 個外顯子和2 個內(nèi)含子、占比65%。其中MaNAC062含有最多的外顯子（44 個）和內(nèi)含子（43 個），這是由于第4 版香蕉基因組中的MaNAC062基因整合先前第2 版基因組中的2個基因（5’端為舊版基因）的緣故。這些香蕉NACs基因中NAM 結(jié)構(gòu)域的長度，除MaNAC079（141 bp）外均介于315～411 bp。多數(shù)情況下，同一亞群內(nèi)的NACs基因有較為相似且保守的結(jié)構(gòu)，但同時也存在單個內(nèi)含子丟失或獲得的情況，但S7、S10、S12、S16 和S22 組內(nèi)成員的基因結(jié)構(gòu)相差較大。此外，同源基因?qū)Φ耐怙@子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析也進(jìn)一步驗證了系統(tǒng)發(fā)育樹和重復(fù)事件的分析結(jié)果。另一方面，理化分析結(jié)果表明，所有香蕉NACs 編碼蛋白的平均長度為353 個氨基酸，平均分子量為39.5 kDa，等電點范圍為4.44～10.33。除MaNAC079 外，所有香蕉NACs 蛋白均為親水性，且僅有不足15%的NACs 屬于穩(wěn)定蛋白（詳見數(shù)據(jù)庫附表S4）。

圖6 香蕉NAC 家族蛋白聚類及基因結(jié)構(gòu)Fig.6 Protein clustering and gene structure of NAC family members in banana

圖5 中用藍(lán)色三角形標(biāo)記了已報道的16 個香蕉NACs基因（詳見數(shù)據(jù)庫附表S7），有5 個分布在含香蕉NACs基因數(shù)目最多的S14 亞群，其中3 個（MaNAC177、MaNAC176、MaNAC207）被報道在乙烯誘導(dǎo)的香蕉后熟過程中發(fā)揮作用［25］，而另外2 個（MaNAC210、MaNAC217）則與次生細(xì)胞壁的形成密切相關(guān)［26］。然而，同樣受乙烯上調(diào)的MaNAC121、MaNAC132和MaNAC126則分別位于S16、S21 和S21 亞群中。這些結(jié)果表明香蕉NACs基因在果實后熟過程中所起的作用可能是多元化的。此外，香蕉NACs還能對各類脅迫作出響應(yīng)，通過多種渠道發(fā)揮抗逆作用。例如，MaNAC129 通過調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉及H2O2含量來增強香蕉的耐旱性［27］，MaNAC085和MaNAC141 均正向參與了香蕉對高鹽和干旱脅迫的響應(yīng)［28］，MaNAC176 可通過與WRKY 家族蛋白互作，增強香蕉抵抗炭疽菌過程中病程相關(guān)基因的表達(dá)［29］。

2.6 miR164-NAC 模塊在香蕉后熟和冷害過程中的表達(dá)分析

結(jié)合sRNA 測序數(shù)據(jù)，首先對香蕉miR164家族6 個成員的表達(dá)進(jìn)行Northern 雜交檢測，分別選取后熟和冷害進(jìn)程中不同時期的香蕉樣品進(jìn)行檢測（圖7A）。其中，mac-miR164 d～f 未檢測到雜交信號，表明豐度極低，而另外3 個豐度較高的成員均在香蕉后熟過程中上調(diào)表達(dá)，miR164a（圖7B）。此外，雜交結(jié)果顯示伴隨后熟進(jìn)程，miR164a 的表達(dá)在乙烯處理的香蕉果皮和果肉中均持續(xù)增強。1-MCP 處理后，香蕉miR164a 在果皮中的表達(dá)未受明顯影響，但在果肉中出現(xiàn)先降低后上升現(xiàn)象（圖7B）。隨后檢測受miR164 靶向調(diào)控的2 個表達(dá)量較高的MaNAC165和MaNAC176的轉(zhuǎn)錄本在后熟過程中的豐度變化，圖7C 顯示，MaNAC176在果皮和果肉中均響應(yīng)乙烯處理且隨后熟進(jìn)程逐漸下調(diào)表達(dá)，這與乙烯處理后果皮和果肉中miR164a 的表達(dá)模式正好相反。1-MCP 處理下MaNAC176的表達(dá)無明顯變化，僅第8 天在果皮中的表達(dá)顯著升高。相比MaNAC176而言，MaNAC165在果皮和果肉中的轉(zhuǎn)錄本豐度更高，在乙烯處理后的果皮中其表達(dá)呈現(xiàn)先升高后快速下降的趨勢，而在果肉中則持續(xù)下調(diào)（圖7C）?？傮w而言，1-MCP處理對MaNAC176和MaNAC165的表達(dá)影響不明顯，特別是果肉樣品。另一方面，在冷害的果皮樣品中，香蕉miR164a 的表達(dá)則被顯著誘導(dǎo)，相應(yīng)地，MaNAC165和MaNAC176兩個靶基因的表達(dá)均出現(xiàn)明顯下調(diào)（圖7B、圖7C）。

圖7 香蕉后熟和冷害過程中miR164-NAC 模塊的表達(dá)變化Fig.7 Expression changes of miR164-NAC module during banana ripening and chilling injury

3 討論

香蕉基因組共編碼222 個NACs成員，數(shù)量相當(dāng)龐大。然而，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示僅有不足30%的NACs基因產(chǎn)生表達(dá)，特別是聚集于第1、4和10 號染色體上的多個NACs基因均無表達(dá)，表明香蕉中該家族大多數(shù)成員存在功能冗余或時空表達(dá)特異性。另一方面，只有5%的NACs基因具有miR164 的靶切位點，這一比例在有表達(dá)的NACs基因中上升為20%。但相比香蕉中其他保守miRNA-靶基因模塊（如miR156-SPL、miR482-NBS-LRR）而言，香蕉miR164-NAC 模塊中的NAC靶標(biāo)的范圍仍較為局限，暗示該調(diào)控模塊可能在香蕉的物種演化過程中出現(xiàn)較晚。

作為植物中一個高度保守的miRNA 家族，miR164 保守的靶基因NAC也是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，且miR164-NAC 模塊已被證實在調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，草莓des突變體相比野生型，其miR164a的成熟體在第19 位核苷酸上存在堿基突變，miR164a 通過靶向植物組織器官發(fā)育相關(guān)基因FvCUC2，影響草莓葉片和花器官的形態(tài)建成［30］。另有研究發(fā)現(xiàn)乙烯處理后，獼猴桃miR164 的表達(dá)受到顯著抑制，且與靶基因AdNAC6、AdNAC7的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)。AdNAC6、AdNAC7 能夠結(jié)合獼猴桃乙烯生物合成、細(xì)胞壁降解和香氣合成基因的啟動子，進(jìn)而調(diào)控獼猴桃品質(zhì)形成及后熟進(jìn)程［31］。在香蕉中，MaNAC089 蛋白（又名MusaATAF2-like）可通過調(diào)節(jié)葉綠素降解和H2O2積累誘導(dǎo)香蕉葉片衰老［32］，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白還可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞分裂素超敏和類黃酮積累，調(diào)節(jié)香蕉植株幼苗的生長［33］。

本研究基于sRNA 高通量測序，發(fā)現(xiàn)香蕉miR164 家族中共有6 個成員（miR164a/b/c/d/e/f），其中miR164a/b/c 的積累水平與其對應(yīng)NAC靶基因的表達(dá)量呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系。然而，與同為呼吸躍變型果實的獼猴桃不同，香蕉中miR164 的表達(dá)受到乙烯強烈誘導(dǎo)，且隨后熟進(jìn)程呈上調(diào)趨勢，而其靶向的MaNAC176的表達(dá)則隨香蕉后熟進(jìn)程逐漸減弱。miR164 另一個靶基因MaNAC165在乙烯催熟的果皮中出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，基本上與miR164 的表達(dá)模式相反。NAC 類轉(zhuǎn)錄因子在香蕉果實后熟調(diào)控中的作用已有不少相關(guān)報道。早期研究發(fā)現(xiàn)，MaNAC128、MaNAC129的表達(dá)在自然后熟、乙烯催熟和1-MCP 延緩后熟的香蕉果實中，隨著乙烯釋放和后熟進(jìn)程而不斷增強［34］。作為轉(zhuǎn)錄激活子，MaNAC128和MaNAC129 均能夠結(jié)合乙烯合成關(guān)鍵基因MaACS1和MaACO1的啟動子，激活乙烯的生物合成，加速香蕉后熟與品質(zhì)形成［35］。與此相反，MaNAC197在香蕉后熟過程中明顯下調(diào)，而其作為轉(zhuǎn)錄抑制子，通過結(jié)合MaACS1和MaACO1的啟動子抑制其表達(dá)［34］。類似地，MaNAC085 和MaNAC198 也相繼被報道是香蕉成熟衰老過程中的負(fù)調(diào)控因子［36-37］?？傮w來看，上述結(jié)果暗示著MaNAC176 和MaNAC165 很可能是香蕉后熟的負(fù)調(diào)控因子，而miR164 則通過負(fù)調(diào)控這兩個靶基因的表達(dá)，參與促進(jìn)香蕉后熟進(jìn)程中的乙烯合成。另一方面，本研究結(jié)果表明，香蕉miR164能夠被低溫誘導(dǎo)，同樣可能通過負(fù)調(diào)控其靶基因MaNAC176和MaNAC165來應(yīng)對冷害。前期報道多個香蕉NAC 家族成員參與調(diào)控逆境脅迫響應(yīng)，如MaNAC121 通過與CBF1 蛋白互作參與果實采后的低溫脅迫應(yīng)答［38］，MaNAC129 通過調(diào)節(jié)氣孔開合度和H2O2含量增強香蕉抗旱性［27］，MaNAC085 和MaNAC141 均能提高香蕉對高鹽和干旱的耐受性［28］。近期報道指出，MaNAC127和MaNAC164 可通過上調(diào)磷脂降解相關(guān)基因，促進(jìn)磷脂降解積累磷脂酸，從而引發(fā)香蕉的冷害癥狀［39］。本研究發(fā)現(xiàn)的香蕉miR164-NAC165/176 模塊很可能是香蕉發(fā)生冷害的又一個關(guān)鍵調(diào)控通路，具體的分子機制還需通過轉(zhuǎn)基因手段進(jìn)一步證實。

4 結(jié)論

本研究基于高通量測序及第4 版香蕉基因組信息，鑒定出6 個香蕉miR164 家族成員，詳細(xì)描述其染色體定位、序列同源性、前體二級結(jié)構(gòu)及其與代表性物種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。明確了香蕉miR164 在不同NACs基因上的切割位點，并通過降解組和煙草瞬時共轉(zhuǎn)化驗證香蕉中多條miR164-NAC 調(diào)控模塊。利用更新版香蕉基因組注釋，鑒定出222 個香蕉NACs成員，明確其在基因組上的定位、重復(fù)事件、與擬南芥和水稻的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)呈現(xiàn)部分香蕉NAC 家族成員的基因結(jié)構(gòu)。分別設(shè)置香蕉后熟和低溫實驗，通過小分子RNA 雜交和qRT-PCR，分析鑒定到的香蕉miR164-NAC 調(diào)控模塊在后熟和冷害兩種過程中的表達(dá)情況。綜上，本研究系統(tǒng)篩選了與香蕉后熟及響應(yīng)低溫脅迫密切相關(guān)的miR164 及其靶基因NAC 轉(zhuǎn)錄因子，可為后續(xù)香蕉miR164-NAC 模塊的克隆及功能驗證奠定基礎(chǔ)。