溫和灸對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠子宮微循環(huán)及血液流變學(xué)的影響

郭 莎 李雪梅 任奎羽 陳兆恒 楊 莎

(1 成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,成都,610075; 2 南充精神衛(wèi)生中心,南充,637000)

原發(fā)性痛經(jīng)(Primary Dysmenorrhea,PD)也稱(chēng)功能性痛經(jīng),是指生殖器官無(wú)器質(zhì)性病變引起的痛經(jīng),臨床表現(xiàn)以月經(jīng)前后與行經(jīng)期間出現(xiàn)周期性痙攣性下腹部疼痛為主。PD在年輕女性中是最常見(jiàn)的婦科疾病[1],在一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)女大學(xué)生的研究中,51.1%的女大學(xué)生均患有PD,其中PD中度以上的疼痛的患病率為33.1%[2]。并且PD會(huì)嚴(yán)重影響女性的身體健康及生命質(zhì)量[3]。目前,PD尚無(wú)特效治療藥物,臨床上多以非甾體抗炎藥、避孕藥等藥物緩解疼痛[4],有一定療效,但不良反應(yīng)也較多,包括長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致高血壓、腦卒中、心臟病等疾病的產(chǎn)生[5]。同時(shí),有20%～25%的女性對(duì)上述藥物反應(yīng)不佳[6]。

研究表明,溫和灸具有溫通經(jīng)脈、活血止痛的作用,對(duì)PD有獨(dú)特療效,不良反應(yīng)小,安全性高,能有效改善患者經(jīng)期疼痛癥狀、中醫(yī)證候表現(xiàn)及生命質(zhì)量[7-9]。PD的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確,但有學(xué)者認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制可能與血液流變學(xué)及子宮微循環(huán)狀態(tài)有關(guān)[10-11]。同時(shí)課題組前期研究發(fā)現(xiàn),溫和灸治療對(duì)PD患者的子宮微循環(huán)狀態(tài)改善明顯,表現(xiàn)在治療后患者子宮內(nèi)血流增多、子宮動(dòng)脈血流速度增快、血流阻力降低[12]。因此,在臨床有效的基礎(chǔ)上,溫和灸對(duì)子宮微循環(huán)及血液流變學(xué)的影響值得進(jìn)一步研究。本研究對(duì)溫和灸治療PD可能的作用機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)雌性大鼠40只,鼠齡12周齡,體質(zhì)量(255±25)g,性成熟未交配,成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(許可證號(hào):SCXK 2015-030)。飼喂普通大鼠清潔級(jí)飼料,清潔飲水。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):2020-01)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程對(duì)動(dòng)物的處置遵循科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 藥物 苯甲酸雌二醇注射液(寧波三生生物科技有限公司生產(chǎn),批號(hào):B191001)、縮宮素注射液(寧波三生生物科技有限公司生產(chǎn),批號(hào):S190204)。

1.1.3 試劑與儀器 10%水合氯醛(成都市科隆化學(xué)品有限公司,批號(hào):20200811),艾條(臨湘市湖香艾生物科技有限公司)。體視顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司,型號(hào):SMZ-168)、自動(dòng)血流變測(cè)試儀(北京賽科希德科技發(fā)展有限公司,型號(hào):SA-900)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,通過(guò)陰道涂片法確定其動(dòng)情周期[13],根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)、形態(tài)及數(shù)量選出動(dòng)情周期規(guī)律的SD雌性大鼠40只,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、空白加艾灸組、模型組、艾灸組4組,每組10只。

痛經(jīng)大鼠模型采用苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素法制備。除空白組、空白加艾灸組外,其余組大鼠均在每日固定時(shí)間給予腹部皮下注射苯甲酸雌二醇注射液,連續(xù)10 d,第1天及第10天每只每日注射0.5 mg,第2～9天每只0.2 mg/d,末次給藥1 h后,腹腔注射縮宮素2 U/只,記錄大鼠20 min內(nèi)扭體反應(yīng)?？瞻捉M、空白加艾灸組皮下注射同等劑量的生理鹽水,連續(xù)10 d。

1.2.2 干預(yù)方法 從第11天起,開(kāi)始給予空白加艾灸組和艾灸組溫和灸治療,空白組和模型組同樣抓取、固定但不做治療,于每日固定時(shí)間開(kāi)始,連續(xù)10 d。大鼠穴位定位,常規(guī)消毒,定位依據(jù)余曙光《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[14]的動(dòng)物穴位圖譜,關(guān)元:臍下約25 mm處;三陰交:后肢內(nèi)踝尖上10 mm。溫和灸方法:空白加艾灸組和艾灸組各動(dòng)物著自制鼠衣,并固定在自制鼠架上,暴露腹部及后肢,去除大鼠關(guān)元、三陰交處毛發(fā)約1 cm×1 cm,點(diǎn)燃艾條放置在離大鼠皮膚2～3 cm處,進(jìn)行溫和灸。1次/d,20 min/次,連續(xù)10 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 扭體反應(yīng) 最后一次注射苯甲酸雌二醇1 h后,除空白組、空白加艾灸組外每只動(dòng)物腹腔注射催產(chǎn)素2 U,觀察20 min內(nèi)扭體反應(yīng)動(dòng)物數(shù)及扭體次數(shù),扭體反應(yīng)表現(xiàn)為:大鼠腹部收縮內(nèi)凹,軀干與后肢伸展,一側(cè)肢體內(nèi)旋。

1.2.3.2 子宮微血管管徑 參考文獻(xiàn)[15],于治療結(jié)束1 d后,給予大鼠10%水合氯醛麻醉,于腹部正中線外約0.5 cm處行2～3 cm縱行切口,游離一側(cè)子宮及其韌帶,并將其置于體式顯微鏡下。于40X線鏡視野中觀察各組大鼠子宮微血管的顏色和管徑,并拍攝照片。最后,將鏡下子宮微血管圖片導(dǎo)入Image-Pro Plus軟件,測(cè)量微血管管徑并記錄。

1.2.3.3 血液流變學(xué) 大鼠麻醉狀態(tài)下,分離頸動(dòng)脈,插管取血,使用SA-9000自動(dòng)血液流變測(cè)試儀分析系統(tǒng)檢測(cè)血液流變學(xué)指標(biāo)(全血黏度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞變形指數(shù)、紅細(xì)胞剛性指數(shù)、紅細(xì)胞沉降率)。

1.2.3.4 子宮組織形態(tài)學(xué)觀察 動(dòng)物處死后,迅速取出大鼠子宮,肉眼觀察并記錄子宮形態(tài)學(xué)改變。剔除脂肪和其他組織后,測(cè)量子宮分角橫徑并記錄。

2 結(jié)果

2.1 痛經(jīng)大鼠扭體反應(yīng)情況 與空白組與空白加艾灸組比較,模型組與艾灸組扭體潛伏期均顯著縮短,扭體次數(shù)均增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組與艾灸組扭體反應(yīng)、扭體潛伏期比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠扭體反應(yīng)比較

2.2 溫和灸對(duì)痛經(jīng)大鼠子宮組織形態(tài)及子宮橫徑的影響 雌激素刺激后,模型組大鼠子宮體明顯增大,子宮內(nèi)積液明顯增多,子宮橫徑較其余3組顯著增大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,艾灸組子宮體增大不明顯,子宮橫徑明顯減少(P<0.01)。空白組與空白加艾灸組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。溫和灸對(duì)實(shí)驗(yàn)性子宮增大有一定的抑制作用,而對(duì)正常狀態(tài)下的大鼠子宮形態(tài)影響不明顯。見(jiàn)圖1～2。

圖1 溫和灸對(duì)痛經(jīng)大鼠子宮橫徑的影響注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白加艾灸組比較,△△P<0.01;與模型組比較,▲P<0.05

圖2 溫和灸對(duì)痛經(jīng)大鼠子宮形態(tài)的影響注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白加艾灸組比較,△△P<0.01;與模型組比較,▲P<0.05

2.3 溫和灸對(duì)痛經(jīng)大鼠子宮微血管管徑的影響 與空白組比較,空白加艾灸組子宮微血管管徑輕微擴(kuò)張(P>0.05),模型組子宮微血管管徑顯著收縮(P<0.05),艾灸組子宮微血管管徑收縮明顯(P<0.05);與空白加艾灸組比較,模型組及艾灸組微血管管徑明顯收縮(P<0.05);與模型組比較,艾灸組子宮微循環(huán)管徑顯著擴(kuò)張(P<0.05)。溫和灸可顯著擴(kuò)張痛經(jīng)大鼠子宮微血管管徑,改善子宮微循環(huán)障礙,但對(duì)健康大鼠子宮微血管管徑無(wú)明顯擴(kuò)張作用。見(jiàn)圖3～4。

圖3 溫和灸對(duì)痛經(jīng)大鼠子宮微血管管徑的影響注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白加灸組比較,△△P<0.01;與模型組比較,▲▲P<0.05

圖4 大鼠子宮微血管管徑(×40)注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白加灸組比較,△△P<0.01;與模型組比較,▲▲P<0.05

2.4 溫和灸對(duì)痛經(jīng)大鼠全血黏度的影響 與空白組比較,模型組與艾灸組所有切變率下的全血黏度均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與空白加灸組比較,模型組全血黏度切變度5、30及200均降低(均P<0.05);與模型組比較,艾灸組全血黏度有增高趨勢(shì)(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 溫和灸對(duì)痛經(jīng)大鼠全血黏度的影響注:與空白組比較,**P<0.01;與空白加灸組比較,△△P<0.01

2.5 溫和灸對(duì)痛經(jīng)大鼠紅細(xì)胞變形指數(shù)、紅細(xì)胞剛性指數(shù)、紅細(xì)胞壓積及紅細(xì)胞沉降率方程K值的影響 與空白組比較,模型組紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞剛性指數(shù)及紅細(xì)胞沉降率方程K值下降較明顯(P<0.05),艾灸組紅細(xì)胞沉降率方程K值及紅細(xì)胞壓積下降明顯(P<0.05)。與空白加艾灸組比較,模型組及艾灸組紅細(xì)胞沉降率方程K值及紅細(xì)胞壓積下降明顯(P<0.05)。與模型組比較,艾灸組方程K值、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞剛性指數(shù)及變形指數(shù)有升高的趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其余指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素造模法可能導(dǎo)致大鼠紅細(xì)胞沉降率方程K值、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞變形及剛性指數(shù)降低。經(jīng)溫和灸干預(yù)后,痛經(jīng)模型大鼠紅細(xì)胞沉降率方程K值、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞變形及剛性指數(shù)均有上升的趨勢(shì)。見(jiàn)圖6。

圖6 溫和灸對(duì)痛經(jīng)大鼠紅細(xì)胞剛形指數(shù)、紅細(xì)胞變性指數(shù)、紅細(xì)胞壓積,紅細(xì)胞沉降率方程K值的影響注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白加灸組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.6 大鼠子宮微血管管徑與子宮橫徑、全血黏度各切變度相關(guān)性 大鼠微血管管徑與子宮橫徑、全血黏度各切變度間均存在線性關(guān)系,其中微血管管徑與子宮橫徑負(fù)相關(guān)(-1

3 討論

大鼠的動(dòng)情周期受下丘腦-垂體-性腺軸支配,為規(guī)律的非妊娠生殖活動(dòng)[16],因此,在痛經(jīng)模型制備前,篩選動(dòng)情周期規(guī)律的雌性大鼠至關(guān)重要。篩選完成后采用苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素造類(lèi)痛經(jīng)模型,在雌激素的作用下,非妊娠大鼠子宮肌層縮宮素受體含量上升[17],大鼠腹腔注射縮宮素后,縮宮素與子宮肌層的縮宮素受體相結(jié)合,從而引起子宮平滑肌劇烈痙攣收縮,誘發(fā)大鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)[18]。扭體反應(yīng)是目前應(yīng)用最廣的內(nèi)臟痛模型之一,也是痛經(jīng)模型成功與否的重要判定指標(biāo)[19]。本研究中,經(jīng)苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素造模法造模后大鼠出現(xiàn)扭體潛伏期縮短,扭體次數(shù)顯著性增加,均提示痛經(jīng)大鼠模型制備成功。

子宮循環(huán)系統(tǒng)中最基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)為子宮微血管與毛細(xì)血管間的血液循環(huán),研究表明,子宮微血管管徑范圍為11～100 μm,而<10 μm的血管管徑則為毛細(xì)血管,子宮微血管異常可引起包括PD在內(nèi)的一系列婦科疾病[20]。研究顯示,微血管通透性增加,血漿蛋白可隨液體滲出血管,導(dǎo)致組織液的生成超過(guò)回流,引起組織、器官水腫和功能障礙[21-22],外滲的水腫液可壓迫微血管,加劇管腔狹窄[23],進(jìn)而加快血液運(yùn)行,而血液運(yùn)行的加快及血漿蛋白的減少均可降低血液黏度[24],最終影響微血管灌注,導(dǎo)致組織缺血缺氧。雌二醇作為血管通透性誘導(dǎo)因子,可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá),使子宮內(nèi)膜微血管通透性增加,進(jìn)而導(dǎo)致子宮水腫的發(fā)生[25]。本研究中,經(jīng)苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素造模后大鼠出現(xiàn)子宮橫徑增大,子宮組織水腫增生,同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)子宮橫徑與子宮微血管管徑負(fù)相關(guān),表現(xiàn)為子宮微血管管徑狹窄收縮。而子宮微血管管徑與全血黏度正相關(guān),出現(xiàn)全血黏度各切變度下降,同時(shí)引起紅細(xì)胞沉降率方程K值、紅細(xì)胞變形指數(shù)、紅細(xì)胞剛性指數(shù)、紅細(xì)胞壓積均下降,影響紅細(xì)胞聚集及變形作用[26],導(dǎo)致血液黏度降低,最終造成子宮缺血缺氧,引發(fā)痛經(jīng)。經(jīng)溫和灸治療后,痛經(jīng)大鼠子宮橫徑減少明顯,子宮水腫明顯減輕,微血管管徑明顯擴(kuò)張,血液黏度則有恢復(fù)正常的趨勢(shì)。同時(shí)溫和灸作為應(yīng)激刺激,未引起正常大鼠即空白加艾灸組各項(xiàng)指標(biāo)的改變。

艾灸主要通過(guò)艾葉等易燃材料或藥物燃燒后的溫?zé)岽碳ぜ八幬镒饔眠M(jìn)行防病治病。研究表明,艾灸可以明顯改善PD的疼痛程度及癥狀評(píng)分,且安全可靠,不良反應(yīng)少,患者依從性高[9,27]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,PD屬“經(jīng)行腹痛”范疇,病位在胞宮、沖任,主要病機(jī)為“不通則痛”或“不榮則痛”。關(guān)元為足三陰與任脈交會(huì)穴,有升陽(yáng)補(bǔ)氣、調(diào)理沖任之功效。三陰交為足三陰之交會(huì)穴,具有疏肝理氣、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之功效。關(guān)元、三陰交配合可使沖任氣機(jī)通暢,氣血調(diào)和,相關(guān)研究顯示,灸法治療PD腧穴運(yùn)用頻次最高為關(guān)元、三陰交,兩穴配伍關(guān)聯(lián)亦最高[28]。因此,本研究最終選取關(guān)元、三陰交兩穴配伍使用。

本研究結(jié)果顯示,通過(guò)苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素造模法建立PD大鼠模型成功,與健康大鼠比較,PD大鼠存在子宮水腫,微血管管徑收縮,血液流變學(xué)指標(biāo)下降,這可能是PD的發(fā)病機(jī)制。溫和灸干預(yù)后子宮水腫減輕,子宮微血管管徑擴(kuò)張,血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)有上升的趨勢(shì),子宮微循環(huán)障礙顯著改善。表明改善PD大鼠子宮水腫、血液流變性及微循環(huán)狀態(tài)是溫和灸治療PD可能的作用基礎(chǔ),具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明:無(wú)。