蚯蚓對新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉、啶蟲脒污染紅壤中細菌群落結構的影響

王嬌嬌　武春媛　譚華東　李怡

關鍵詞：蚯蚓；細菌群落；吡蟲啉；啶蟲脒；紅壤；環(huán)境因子

中圖分類號：X53 文獻標識碼：A

新煙堿類殺蟲劑（neonicotinoids， NEOs）是在煙堿結構基礎上開發(fā)出來的一類新型殺蟲劑，也是目前世界上應用最廣泛的殺蟲劑之一[1]，廣泛應用于農業(yè)、景觀、動物領域的害蟲防治，主要包括吡蟲啉（ imidacloprid， IMI ）、啶蟲脒（acetamiprid， ACE）、噻蟲胺（clothianidin， CLO）、噻蟲啉（thiacloprid， THD）、噻蟲嗪（thiamethoxam，THM）、烯啶蟲胺（nitenpyram， NIT）和呋蟲胺（dinotefuran， DIN）等[2]。NEOs 是煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor， nAChR）的激動劑，主要通過選擇性控制昆蟲神經系統(tǒng)中煙堿型乙酰膽堿酯酶受體，阻斷昆蟲中樞神經系統(tǒng)的正常傳導，達到殺蟲目的[3]。NEOs 具有水溶性和持久性，在土壤當中的半衰期從幾十到幾百天不等；其較高的淋溶和徑流潛力，能在土壤中連續(xù)積累并隨地表徑流或滲透進入地表水和地下水[4]，世界上大多河流水體中都可監(jiān)測到新煙堿類殺蟲劑殘留[5]。其頻繁使用可在土壤、水體中累積毒性，使NEOs 在土壤、水體和生物中成為一個持續(xù)存在的環(huán)境問題[6-7]。多項研究發(fā)現(xiàn)，NEOs 殘留會對非靶標有益生物蜜蜂、鳥類、蚯蚓等構成傷害[8-10]；水體中的NEOs 殘留會對魚類、蝌蚪等水生生物造成不同程度的損傷[11-13]，除此之外，NEOs 可通過食物鏈致使人體中樞神經系統(tǒng)紊亂，嚴重會導致呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)損傷，甚至死亡[14]。鑒于NEOs 的危害，作為歐盟農業(yè)大國，法國已于2018 年開始全面禁止NEOs 用于植物蟲害防控[15]。

常見農田土壤污染修復技術主要為生物修復[16]。目前，生物修復的研究大多集中于微生物修復和植物修復，利用動物修復土壤的研究相對較少[17]。蚯蚓作為生物量最大的土壤動物，對土壤生態(tài)系統(tǒng)和環(huán)境質量影響深遠[4]。蚯蚓吸食污染物后，其作穴、排泄等行為可促進微生物活性、提高有益微生物數(shù)量，從而改變土壤養(yǎng)分轉化情況[18]；土壤微生物的群落結構及其平衡對土壤有重要的影響。而細菌作為微生物中含量最多、豐度最高的類群，能夠參與土壤中多數(shù)養(yǎng)分的轉化，在能量流動和信息傳遞上發(fā)揮著重要功能，因此常被認為是土壤生態(tài)系統(tǒng)質量變化的早期指標[19]。

南方紅壤區(qū)人口稠密，人均耕地面積少，農田開發(fā)強度大[20]；IMI、ACE 是使用較廣的2 種NEOs，它們普遍殘留在土壤和水體環(huán)境中；目前，已經有越來越多的研究關注到NEOs 在土壤當中的環(huán)境行為，但較少有關蚯蚓作用于IMI、ACE污染紅壤的修復機制研究。本研究以赤子愛勝蚯蚓（Eisenia foetida）為土壤修復動物，選取IMI、ACE 兩種常用新煙堿類殺蟲劑，利用16S rRNA高通量測序、冗余分析（RDA）等方法，研究蚯蚓對NEOs 污染紅壤的理化性質及細菌群落結構的影響，探究潛在的降解微生物類群及蚯蚓對農田紅壤NEOs 的去除能力，為NEOs 污染農田紅壤修復提供科學依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗土壤采自海南省澄邁縣（110°2′25″E，19°44′5″N）無吡蟲啉、啶蟲脒污染的土地。采集0～20 cm 深度土樣，自然風干后，研磨過20 目尼龍篩，經測定，土壤基本理化性質為：pH 為6.14，土壤有機質（SOM） 25.41 g/kg，全氮（TN）1.21 g/kg，全磷（TP） 1.32 g/kg，全鉀（TK）1.38 g/kg。供試蚯蚓品種為赤子愛勝蚓（Eiseniafoetida），來自中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生態(tài)農業(yè)基地。試驗前，選擇健康、具有相似長度和體重，且有環(huán)帶的成熟蚯蚓[21]，用無菌水清洗，并置于濕濾紙上，25 ℃，黑暗中清腸48 h，在試驗土壤中適應2 周。吡蟲啉和啶蟲脒為分析純。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 在開展試驗前，了解蚯蚓在不同濃度吡蟲啉、啶蟲脒污染紅壤中的存活情況。分別在農藥濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0 mg/kg 的試驗紅壤中加入蚯蚓，進行為期30 d的預試驗，每日觀察記錄蚯蚓的存活情況。預試驗結果顯示，在低于吡蟲啉2.5 mg/kg、啶蟲脒2.0 mg/kg 濃度農藥處理組中蚯蚓存活情況良好，從而確定試驗農藥濃度為吡蟲啉2.0 mg/kg、啶蟲脒1.5 mg/kg。

稱取200 g 過2 mm 篩的風干土樣至500 mL燒杯中，分別將相應濃度的吡蟲啉（2.0 mg/kg）、啶蟲脒（1.5 mg/kg）充分混勻至土樣中，每個燒杯中加入10 條大小、長度和體重相似的蚯蚓，放于避光處培養(yǎng)。共設置5 組：自然土壤（CK），土壤中添加吡蟲啉（BCK），土壤中添加啶蟲脒（DCK），土壤中添加吡蟲啉與蚯蚓（B），土壤中添加啶蟲脒與蚯蚓（D）。每處理設置3 個重復。培養(yǎng)條件為：持續(xù)黑暗，溫度控制在25 ℃，每天對蚯蚓進行生物學觀察，定期向土壤中加入無菌超純水，控制含水量在30%左右。待試驗結束（第28 天），將蚯蚓取出后，采土樣保存于–80 ℃冰箱，備用。

1.2.2 土壤養(yǎng)分含量測定 土壤理化性質測定參照《土壤農化分析》[22]。pH 采用電極法測定，全氮（TN）采用凱氏定氮法測定，全磷（TP）采用鉬銻顯色法測定，全鉀（TK）采用原子吸收分光光度法測定，土壤有機質（SOM）采用重鉻酸鉀容量法測定。

1.2.3 16S rRNA 高通量測序 根據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA kit（Omega Bio-tek， Norcross， GA， U.S.）說明書進行土壤總DNA 抽提，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質量，使用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度；使用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對16S rRNA 基因V3-V4可變區(qū)進行PCR 擴增，每個樣本設置3 個重復。將同一樣本的PCR 產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產物，利用AxyPrep DNA Gel ExtractionKit（Axygen Biosciences， Union City， CA，USA）進行回收產物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Quantus? Fluorometer（Promega， USA）對回收產物進行檢測定量，利用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平臺進行測序，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測序，通過比對Sliva 數(shù)據(jù)庫（版本138）分析不同樣品的細菌群落結構組成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用JMP Pro14.3.0、Origin 2019b 軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，采用Qiime 1.9.1、美吉生物云平臺、Gephi 0.9、RStudio 等軟件完成生物信息學分析。

2 結果與分析

2.1 樣品中所含OTUs 數(shù)目分析

對5 個處理，共15 個樣品進行高通量測序，按照97% 的相似水平對有效序列進行OTU（operational taxonomic unit， OTU）聚類，共獲得3501 個OTUs。對各組樣品的獨有OTUs 和組間樣品的重疊OTUs 進行Venn 圖分析（圖1）。自然土壤（CK）、土壤中添加吡蟲啉（BCK）、土壤中添加啶蟲脒（DCK）、土壤中添加吡蟲啉與蚯蚓（B）、土壤中添加啶蟲脒與蚯蚓（D）5 個處理的OTUs 總數(shù)分別為2598、1766、1903、2199 和2021，自然土壤的OTUs 數(shù)量最多，吡蟲啉農藥處理土壤的OTUs 數(shù)量最少；各處理組中特有的OTUs按數(shù)量高低排序為：CK>B>D>DCK>BCK，特有的OTUs 數(shù)目分別是247、135、80、45、27（表1）。

2.2 不同處理下土壤細菌α 多樣性的變化

α 多樣性可以確定微生物群落中物種豐富度及多樣性的變化。通過分別計算α 多樣性指數(shù)中Chao1 和Shannon 指數(shù)，對微生物群落中物種的豐富度和多樣性進行分析。土壤細菌α 多樣性的統(tǒng)計結果顯示（表2），Chao1 和Shannon 指數(shù)在CK 與BCK、DCK 處理間存在顯著差異（P<0.05），在所有處理中CK 的Chao1 和Shannon 指數(shù)最高；分別添加IMI、ACE 的BCK 和DCK 處理的Chao1和Shannon 指數(shù)最低；在引入蚯蚓之后的B 和D處理中，Chao1 和Shannon 指數(shù)有所提升。結果表明，自然土壤中的細菌群落物種豐富度和多樣性最高；IMI、ACE 暴露降低了土壤細菌群落的豐富度和多樣性，而添加蚯蚓提升了土壤細菌群落的豐富度和多樣性，說明蚯蚓在IMI、ACE 污染土壤中的生長活動能夠在一定程度上穩(wěn)定土壤細菌群落結構。

2.3 不同處理對門、屬水平下土壤細菌群落結構的影響

不同處理下土壤細菌群落物種門水平的相對豐度變化如圖2 所示。將相對豐度大于1%的細菌門視為優(yōu)勢細菌門，從圖2 中可以看出，在BCK和DCK 處理中， NEOs 對放線菌門（Actinobacteriota）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidota）的相對豐度有顯著影響。與CK 相比，BCK 和DCK處理的放線菌門（ 相對豐度分別為21.5% 和29.5%）、變形菌門（7.7%和10.1%）、擬桿菌門（1.6%和1.8%）、髕骨細菌門（Patescibacteria）（1.5%和1.8%），菌群豐度顯著下降；加入農藥前后，細菌優(yōu)勢菌門由CK 的放線菌門（39.5%）轉變?yōu)锽CK 和DCK 處理的厚壁菌門（55.8%和41.2%）；BCK 和DCK 處理的豐度變化基本相似。B、D 處理與BCK、DCK 處理相比較發(fā)現(xiàn)，加入蚯蚓顯著提高了放線菌門、變形菌門、綠彎菌門和擬桿菌門的豐度，厚壁菌門的豐度則有所下降。

屬水平上，對相對豐度大于2%的菌屬變化進行分析（圖3）。與CK 相比，BCK 和DCK 處理組中的芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）豐度明顯增加，弱酸桿菌屬（Ilumatobacter sp.）、甲基醌菌屬（Demequina sp.）、微桿菌屬（Microbacteriumsp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）等菌屬豐度減少；假芽孢桿菌屬（Fictibacillus sp.）只存在于農藥處理組；在加入蚯蚓的B 和D 處理中，芽孢桿菌屬的豐度顯著降低，而弱酸桿菌屬、假單胞菌屬和微桿菌屬的豐度均有所提升。結果表明，IMI、ACE 暴露顯著改變了土壤原有細菌群落結構組成，而蚯蚓的引入，在一定程度上恢復了IMI、ACE 暴露土壤的細菌群落結構。

為進一步了解細菌群落之間的相互關系，將所有處理后的細菌豐度前30 的菌屬進行了相關性網絡分析（R≥0.6， P<0.05）（圖4）。結果表明，由于正相關的邊數(shù)量（421）大于負相關的邊數(shù)量（46），可以推斷細菌菌群的協(xié)作關系大于競爭關系；從圖中可以看出，大多數(shù)菌屬屬于放線菌門和變形菌門，放線菌門的鏈霉菌屬、厚壁菌門中的芽孢桿菌屬與各菌屬之間的負相關關系較為明顯。

2.4 土壤細菌群落結構變化與土壤理化性質的關系

不同處理28 d 后的土壤理化性質如表3 所示。與CK 相比，BCK 和DCK 處理的SOM、TN含量顯著降低，TK 含量變化不明顯，TP 和pH的變化不顯著。添加蚯蚓后，與BCK 和DCK 處理相比，B 和D 處理中的TN、TK、TP 和pH 均有提高，SOM 含量顯著降低。將所有土壤細菌分類屬水平總豐度前30（R≥0.6， P<0.05）與5 個土壤環(huán)境因子之間的共現(xiàn)模式可視化為一個關聯(lián)網絡圖（圖5）。由圖5 可以看出，占比最多的菌門是放線菌門（ Actinobacteriota ）； 髕骨細菌門（Patescibacteria）與環(huán)境因子呈正相關；放線菌門、綠彎菌門（ Chloroflexi ） 和變形菌門（Proteobacteria）的大部分菌屬與環(huán)境因子呈正相關；厚壁菌門（Firmicutes）中的多數(shù)菌屬均與環(huán)境因子呈負相關。放線菌門中的大部分菌屬與環(huán)境因子呈正相關，小部分菌屬與環(huán)境因子呈負相關，如，微桿菌屬（Microbaterium sp.）與TN、TP、pH 呈正相關；微酸菌屬（Ilumatobacter sp.）與TN、TP、TK、pH 呈正相關；類諾卡氏菌屬（Nocardioides sp.）與pH 呈正相關；鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）與SOM 呈正相關，與TK、pH 呈負相關；馬杜拉放線菌屬（Actinomadura sp.）與SOM、pH 呈正相關，與TK 呈負相關。綠彎菌門（Chloroflexi）的大部分菌屬與TK 等環(huán)境因子呈正相關；變形菌門（Proteobacteria）在與環(huán)境因子相關的3 個菌屬中，2 個菌屬與TN、TP、TK、pH 等環(huán)境因子均呈較強正向關聯(lián)，1 個菌屬與TN、pH 呈正相關，2 個菌屬與SOM 呈負相關。在厚壁菌門（Firmicutes）中，多數(shù)菌屬與TK 呈負相關，與SOM 呈正相關，如，芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）與TN、TP、TK、pH 等環(huán)境因子均呈負相關，且關聯(lián)性較強，賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus sp.）與TP、TK 呈負相關，與SOM呈正相關。

在各處理的屬水平上進行冗余分析（圖6）。RDA 的2 個軸累積解釋了68.49%的總變量，第1個軸和第2 個軸分別解釋了65.64%和2.85%的變異度。其中，pH、TN、TK 和SOM 的箭頭連線較長，TN 和pH 與第一軸的夾角比較小，SOM 相對于TP 和TK 夾角和線長都有優(yōu)勢。說明在屬水平上，土壤pH、TN、TK 和SOM 能較好地解釋土壤細菌群落結構差異性。

3 討論

3.1 蚯蚓處理對吡蟲啉、啶蟲脒污染土壤細菌群落結構的影響

土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)中主要的分解者，土壤微生物種群結構是評價土壤質量的重要指標，較高的微生物多樣性對于維持健康的農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)至關重要[24]。

本研究在預試驗蚯蚓生存情況良好的基礎上，確定了土壤中吡蟲啉（IMI）、啶蟲脒（ACE）的濃度；試驗中，為減少其他因素的干擾，每天觀察記錄紅壤中蚯蚓的存活情況，及時將死亡蚯蚓挑出（用牙簽刺激蚯蚓尾部查看有無反應判斷蚯蚓是否死亡），因此，可基本排除蚯蚓死亡帶來的試驗干擾因素。高通量測序結果表明，加入IMI、ACE 顯著降低了土壤細菌群落的物種豐富度和多樣性；而添加蚯蚓，一定程度上穩(wěn)定了受IMI、ACE 污染土壤的微生物群落結構。對門水平細菌群落結構進行分析發(fā)現(xiàn)，與CK 相比，BCK和DCK 處理的放線菌門、變形菌門、擬桿菌門和髕骨細菌門的豐度均降低，優(yōu)勢菌門由CK 的放線菌門轉變?yōu)锽CK、DCK 處理的厚壁菌門。厚壁菌門細菌均為革蘭氏陽性菌，細胞壁中的肽聚糖結構使其具有較強的抗沖擊能力[25]；在BCK 和DCK 處理中，厚壁菌門作為優(yōu)勢菌門，可能是由于IMI、ACE 的加入，對土壤微生物造成毒害，導致土壤中不耐受IMI、ACE 的細菌失活死亡，促使厚壁菌門細菌逐漸成為優(yōu)勢菌并大量繁殖，以此應對土壤中的污染。添加蚯蚓后，B、D 處理土壤中的厚壁菌門的豐度明顯下降，變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和髕骨菌門的豐度有所提升。

變形菌門是富營養(yǎng)菌，在營養(yǎng)充足的情況下豐度會增加[26]，其外膜可抵抗外界環(huán)境的侵害，使細菌具有較好的環(huán)境適應能力[27]；其豐度增加，可能是由于蚯蚓的添加，在土壤中挖孔取食增加了土壤養(yǎng)分和微生物活性，提升了微生物數(shù)量；放線菌門豐度有所提升，可能是蚯蚓在土壤中生長的過程中，其排泄物產生的放線菌含量較高導致的[28]。放線菌門、變形菌門、擬桿菌門是土壤中具有殺蟲劑耐藥性和大分子有機物的主要降解者，這些降解和耐受菌門豐度的提升，可能加速了土壤中新煙堿類殺蟲劑的生物降解，減輕了其對土壤中微生物的毒害作用[29]。BCK 和DCK 處理中高豐度的厚壁菌門，暗示在其處理中可能存在有機污染物未被降解；B、D 處理中，蚯蚓引入后厚壁菌門的豐度明顯下降，推測在蚯蚓的生長活動過程中，土壤中部分有機污染物可能被降解。由此可得，與CK 相比，NEOs 的加入改變了土壤細菌群落結構，且對大部分細菌有毒副作用，導致細菌豐度下降；與未添加蚯蚓的處理相比，加入蚯蚓的處理細菌群落結構發(fā)生了顯著變化，土壤優(yōu)勢菌門組成也發(fā)生了改變，一定程度上恢復了土壤細菌群落結構。

3.2 蚯蚓與吡蟲啉、啶蟲脒污染土壤理化性質之間的關系

與CK 相比，隨著IMI、ACE 的添加，BCK和DCK 處理的SOM 和TN 降低。這可能是由于IMI、ACE 的添加致使土壤微生物遭受脅迫，改變了微生物群落結構。厚壁菌門菌群具有較強的代謝活性，能夠耐受大分子有機物的脅迫；作為BCK 和DCK 處理中的優(yōu)勢菌門，增加了部分重要氮循環(huán)過程所需微生物的豐度，導致土壤中的養(yǎng)分減少，這種變化與ZHANG 等[30]的研究結果一致。加入蚯蚓的B、D 處理的土壤pH 升高，說明蚯蚓的活動中和了土壤pH。土壤pH 作為影響土壤微生物多樣性的重要因子，土壤酸化會導致農作物產量和質量降低，也會對生態(tài)環(huán)境產生負面影響，是土壤退化的重要表現(xiàn)。本研究在IMI、ACE 污染土壤中添加蚯蚓，蚯蚓可能在生活、取食、挖孔過程中，腸道及體腔分泌物質呈中性，生成了大量含碳酸鈣或含氮類的堿性排泄物，從而提高了IMI、ACE 污染土壤的pH，對土壤酸堿進行了調節(jié)[31]。添加蚯蚓提高了土壤TN、TP、TK，這可能是由于蚯蚓吸食污染物后，其作穴、排泄等行為還可促進微生物活性、提高有益微生物數(shù)量，從而增加了土壤中的有效養(yǎng)分，改變了土壤養(yǎng)分的轉化情況[18]。與CK 相比，加入蚯蚓后土壤SOM 含量降低，其原因可能是：一方面，蚯蚓鉆孔掘穴可以增加孔隙度，加速土壤中有機物的分解；另一方面，蚯蚓在吞食土壤的過程中，加速了土壤SOM 的分解轉化[32]。

土壤環(huán)境因子對微生物的生長活動有著重要影響，土壤理化性質不同，微生物群落組成也不同[33]。在本研究中，添加NEOs 后，SOM 和TN含量降低，說明施用NEOs 在一定程度上影響了土壤理化性質，改變了土壤細菌的群落結構；而加入蚯蚓在一定程度上提高了土壤肥力，恢復了污染土壤的細菌群落結構。

4 結論

吡蟲啉、啶蟲脒的暴露使土壤中原有微生物種群的豐富度和多樣性降低，改變了細菌群落的結構組成；吡蟲啉、啶蟲脒的加入導致土壤中的有機質和全氮養(yǎng)分含量下降；蚯蚓的引入提高了受吡蟲啉、啶蟲脒污染土壤的pH 和土壤肥力，改善了吡蟲啉、啶蟲脒污染土壤中的細菌群落結構，提高了土壤中具有殺蟲劑耐藥性和降解殺蟲劑能力的放線菌門、變形菌門、擬桿菌門等的豐度，研究結果為從蚯觸圈中篩選出高效吡蟲啉、啶蟲脒降解菌提供了可行性。