鴨晝夜節(jié)律相關(guān)基因RORB與蛋重的相關(guān)性分析

陶志云，朱春紅，徐文娟，章雙杰，宋衛(wèi)濤，劉宏祥，屠琦，王志成，李慧芳*

(1. 江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125；2. 蘇州海關(guān)綜合技術(shù)中心，江蘇 蘇州 225100)

RORs為維甲酸相關(guān)孤兒受體，屬于核受體超家族的一個(gè)亞家族，該亞家族由RORα(NR1F1、RORA或RZRα)[1-3]，RORβ(NR1F2、RORB或RZRβ)[4-6]，和RORγ(NR1F3、RORC或TOR)組成[7-11]，在晝夜節(jié)律、代謝、炎癥和癌癥中發(fā)揮重要作用[12]。研究表明，RORα表達(dá)在肝臟、腎臟、視網(wǎng)膜和肺中表現(xiàn)出微弱的晝夜節(jié)律振蕩，并且ROR α通過(guò)2個(gè)保守的RORα響應(yīng)元件直接激活BMAL1的轉(zhuǎn)錄，從而維持穩(wěn)健的晝夜節(jié)律[13]。RORβ在小鼠松果體和視網(wǎng)膜中顯示出節(jié)律性表達(dá)模式[14]。RORγ在肝臟、棕色脂肪組織和腎臟中表現(xiàn)出振蕩表達(dá)模式，但在骨骼肌和胸腺中不存在[15-16]。RORα或RORβ缺陷的小鼠表現(xiàn)出異常的晝夜行為[6，17-18]，而在RORγ-/-小鼠中未發(fā)現(xiàn)晝夜行為異常[19]。這些研究表明，ROR的節(jié)律表達(dá)在很大程度上取決于ROR亞型和組織類型。振蕩器的核心環(huán)由異二聚體激活劑BMAL1和CLOCK組成，它們激活PERs和CRYs的表達(dá)。PER和CRY異二聚體與BMAL1時(shí)鐘復(fù)合物相互作用并負(fù)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性[12，20-22]。但在家禽中尚未見RORs相關(guān)研究報(bào)道。

本課題組在前期對(duì)高蛋重和低蛋重兩組鴨的全基因組混池重測(cè)序中發(fā)現(xiàn)RORB基因?yàn)轼啴a(chǎn)蛋量相關(guān)的受選擇候選基因之一，且該基因上存在多個(gè)差異SNP位點(diǎn)(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，提示該基因在產(chǎn)蛋性能的調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步確認(rèn)該基因在產(chǎn)蛋中的作用，本研究采用Illumina方法對(duì)鴨RORB的基因序列進(jìn)行個(gè)體測(cè)序，以分析這些SNP的差異，并將這些差異SNP與產(chǎn)蛋性能進(jìn)行相關(guān)分析，同時(shí)檢測(cè)RORB及其相關(guān)基因在蛋重不同鴨組織中的mRNA表達(dá)水平差異，進(jìn)一步探討鴨RORB基因在產(chǎn)蛋性能中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

試驗(yàn)鴨為金定鴨，共250只，按照蛋鴨飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，90日齡時(shí)進(jìn)行體重稱量，剔除個(gè)體過(guò)大和過(guò)小的鴨只，將個(gè)體適中的鴨進(jìn)行上籠飼養(yǎng)，上籠后逐漸增加光照時(shí)間，在達(dá)到產(chǎn)蛋高峰期后維持16 h光照直到試驗(yàn)期結(jié)束，在299、300、301和449、450、451日齡時(shí)分別稱量連續(xù)3 d蛋重，作為個(gè)體300和450日齡的平均蛋重，根據(jù)個(gè)體300日齡時(shí)蛋重情況分別選取高蛋重，低蛋重2種極端表型以及中蛋重組個(gè)體各30只，共90只進(jìn)行蛋重差異分析，并采集這90只鴨的血液，供后續(xù)提取DNA用。

1.2 個(gè)體選擇和樣品采集

分別在高蛋重、中蛋重和低蛋重組450日齡時(shí)各組分別隨機(jī)選擇8只鴨屠宰，采集卵巢髓質(zhì)部組織，-80 ℃冰箱用于RNA提取。

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增和文庫(kù)構(gòu)建

采用血液小量提取試劑盒提取各樣本DNA(TIANGEN，DP348)，以提取的各DNA為模板，采用多重PCR方法對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物分別為Z-35251072-F：5′-tcctagtccaagcagtatattcac-3′，Z-35251072-R：5′-cagtggaggcctacataataaaag-3′；Z-35256947-F：5′-tttacagcacctcttctatctacc-3′；Z-35256947-R：5′-tacatgtccagaatactttgcaag-3′；Z-35278196-F：5′-aatttaagagggagaaaaaccag-3′；Z-35278196-R：5′-ttgatatgacactacaacagttcc-3′。第一輪擴(kuò)增體系為：Primer Mix(50 nmol/L)2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.8 μL，Taq酶(5 U/μL)0.1 μL，10× buffer 1 μL，基因組DNA(20 ng/μL)2 μL，Mg2+(100 mmol/L)1 μL，石蠟油10 μL，ddH2O 3.2 μL，共計(jì)20 μL；第一輪PCR反應(yīng)條件如下：①95 ℃ 15 min 預(yù)變性，1個(gè)循環(huán)；②94 ℃ 30 s，60 ℃ 10 min，4個(gè)循環(huán)；③94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，20個(gè)循環(huán)。第二輪PCR擴(kuò)增體系為：Barcode (2 μmol/L)3.6 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.8 μL，Taq酶(5 U/μL)0.1 μL，一輪產(chǎn)物樣本稀釋液10 μL，Mg2+(100 mmol/L)1 μL，10×buffer 2 μL，ddH2O 3.6 μL，石蠟油20 μL，總體系40 μL。第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：①95 ℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)；②94 ℃ 30s，60 ℃ 4 min，5個(gè)循環(huán)；③94 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，10個(gè)循環(huán)。對(duì)預(yù)變性二輪擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物進(jìn)行混樣，對(duì)混樣后的文庫(kù)進(jìn)行純化并精確定量后稀釋至測(cè)序所需濃度(10 ng/μL)。

1.4 第二代測(cè)序

基于Illumina X-10測(cè)序平臺(tái)對(duì)RORB上3個(gè)遺傳變異進(jìn)行單個(gè)樣本的DNA高通量測(cè)序。具體方法為：①橋式PCR：使用NaOH將雙鏈DNA文庫(kù)變性為單鏈；將單鏈DNA模板雜交到Flow Cell 上；以Flow Cell 表面上的oligos為引物合成第一鏈；沖走單鏈DNA模板，以合成的第一鏈為模板進(jìn)行35循環(huán)的橋式PCR；將與P5接頭連接的DNA鏈從Flow Cell 上去除；阻斷3′-OH防止在后續(xù)測(cè)序過(guò)程中繼續(xù)延伸DNA鏈；雜交測(cè)序引物。② 測(cè)序反應(yīng)：將橋式PCR產(chǎn)物于Illumina X-10測(cè)序平臺(tái)上機(jī)測(cè)序，操作流程按照標(biāo)準(zhǔn)化工作流程進(jìn)行。根據(jù)測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本各位點(diǎn)的基因變異情況。

1.5 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄成cDNA

卵巢組織的總RNA提取按照TRNzol- A+總RNA提取試劑(DP421，TIANGEN公司)說(shuō)明書進(jìn)行。提取后的RNA用分光光度計(jì)測(cè)其純度和濃度。參照cDNA第一鏈合成試劑盒(KR118，TIANGEN公司)說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.6 熒光定量PCR反應(yīng)

根據(jù)NCBI上PER2、BMAL1、CLOCK和RORB基因組信息，Primer Premier 5.0軟件在外顯子區(qū)設(shè)計(jì)基因的PCR引物。以β-actin作為內(nèi)參基因，基因及引物信息見表1。

表1 試驗(yàn)用基因及引物信息

采用SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑彩色版(SYBR Green)試劑(TIANGEN，F(xiàn)P215)，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，20 μL反應(yīng)體系：2×SuperReal Color Pre Mix 10 μL，正反向引物共0.8 μL，cDNA模版2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL，反應(yīng)條件為：①95 ℃ 5 min預(yù)變性；②95 ℃ 25 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，40個(gè)循環(huán)；③95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。qRT-PCR試驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來(lái)表示，采用SPSS 20.0軟件中的單因素方差分析和相關(guān)回歸分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P< 0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組別鴨蛋重差異分析

由表2可見，低蛋重組、中蛋重組和高蛋重組三組間無(wú)論在300日齡還是450日齡蛋重差異均顯著(P<0.05)。

表2 不同組別鴨蛋重差異分析

2.2 RORB基因突變位點(diǎn)不同基因型鴨蛋重差異分析

由于RORB基因位于母鴨的Z號(hào)染色體，該染色體僅有1條，由表3可見，RORB基因Z-35251072 C>T和Z-35256947 T>C突變位點(diǎn)的堿基類型在300 d蛋重差異不顯著(P>0.05)，450 d蛋重差異顯著(P<0.05)，RORB基因Z-35278196 T>C的突變位點(diǎn)的不同堿基類型在300 d和450 d的蛋重差異均顯著(P<0.05)。

表3 RORB基因突變位點(diǎn)不同堿基類型鴨蛋重差異分析

2.3 鴨RORB各突變位點(diǎn)相互間及與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性分析

由表4可見，鴨RORB基因Z-35251072 C>T，Z-35256947 T>C，Z-35278196 T>C 3個(gè)突變位點(diǎn)相互間呈顯著正相關(guān)，即若Z-35251072位點(diǎn)是野生型C，則Z-35251072 和Z-35256947位點(diǎn)也多為野生型T，反之亦然；Z-35278196 T>C和Z-35256947 T>C 2突變位點(diǎn)與300 d蛋重呈不顯著負(fù)相關(guān)(P>0.05)，與450d蛋重呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；Z-35278196 T>C突變位點(diǎn)與300日齡蛋重和450日齡蛋重均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

2.4 鴨RORB及其相關(guān)基因表達(dá)量差異分析

由表5可見，RORB和PER2基因在低蛋重組的表達(dá)量顯著高于中蛋重和高蛋重組(P<0.05)，在高蛋重和中蛋重組間的差異不顯著(P>0.05)，CLOCK和BMAL1基因在高蛋重組的表達(dá)量顯著高于中蛋重和低蛋重組(P<0.05)，在中蛋重和低蛋重組間差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

生物節(jié)律是一種被廣泛認(rèn)知的生物體隨晝夜周期變化而呈現(xiàn)的生命活動(dòng)周期性變化的現(xiàn)象。在家禽中生物節(jié)律對(duì)性腺發(fā)育、產(chǎn)蛋周期以及生長(zhǎng)等具有調(diào)節(jié)作用[23]，而其本質(zhì)是受時(shí)鐘基因的節(jié)律性表達(dá)的影響。在雞中對(duì)產(chǎn)蛋量高和低的母雞的大白卵泡、小黃卵泡和大黃卵泡3個(gè)發(fā)育階段的卵泡轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)18個(gè)與產(chǎn)卵相關(guān)的候選基因，其中包括RORB[24]，提示RORB與禽產(chǎn)卵相關(guān)的發(fā)育相關(guān)，本研究首次發(fā)現(xiàn)影響鴨的300日齡和/或450日齡蛋重的鴨RORB基因Z-35251072上C→T，Z-35256947上T→C，Z-35278196上T→C 3個(gè)突變位點(diǎn)，且這3個(gè)遺傳突變相互間呈正相關(guān)，與蛋重呈顯著負(fù)相關(guān)。遺傳上，產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重呈負(fù)相關(guān)，且高達(dá)-0.4[25]，在茶花雞上的研究表明43周齡蛋重與43周齡產(chǎn)蛋數(shù)相關(guān)系數(shù)為-0.043[26]，由此推測(cè)鴨的RORB的遺傳突變與鴨的300日齡和450日齡產(chǎn)蛋量呈正相關(guān)，再次為RORB基因在禽產(chǎn)卵過(guò)程中發(fā)揮作用提供理論依據(jù)。

本課題組前期通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法對(duì)不同產(chǎn)蛋量鴨基因表達(dá)差異研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)蛋鴨卵巢中晝夜節(jié)律信號(hào)通路相關(guān)基因尤其是生物鐘基因CLOCK，PER2的表達(dá)水平與產(chǎn)蛋量密切相關(guān)[27]，而且CLOCK和PER2在鴨的不同等級(jí)卵泡中均有表達(dá)。也有研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋雞漏斗部(捕獲蛋黃的部位)和子宮部(形成蛋殼的部位)的生物鐘基因BMAL1、CLOCK、PER2和PER3在排卵過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[28]。在本研究中，鴨RORB和PER2在蛋重低組表達(dá)量顯著增高，而CLOCK和BMAL1在蛋重高組表達(dá)量顯著增高，這一結(jié)果提示晝夜節(jié)律相關(guān)基因RORB、PER2、CLOCK、BMAL1在調(diào)節(jié)鴨的蛋重中可能發(fā)揮重要作用。研究表明，在分子水平上，時(shí)鐘系統(tǒng)由幾個(gè)互為聯(lián)系的負(fù)反饋和正前饋回路組成的整體網(wǎng)絡(luò)。生物鐘的基本分子循環(huán)系統(tǒng)在組織之間是相似的，正環(huán)主要由基本螺旋-環(huán)-螺旋/PAS型轉(zhuǎn)錄激活子BMAL1和CLOCK或其旁系同源物NPAS2組成，而2種隱色素(CRY)和3個(gè)周期蛋白(PER)參與循環(huán)通路的負(fù)性調(diào)控[12，19-21，29]。BMAL1時(shí)鐘異二聚體通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)中的E-box增強(qiáng)子(CACGTG)相互作用，積極調(diào)節(jié)許多基因的晝夜節(jié)律表達(dá)，包括PER和CRY。當(dāng)PER和CRY蛋白積累到臨界水平時(shí)，其又通過(guò)直接與BMAL1-CLOCK復(fù)合物相互作用抑制BMAL1-CLOCK介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，包括其自身的轉(zhuǎn)錄，隨后導(dǎo)致PER和CRY蛋白水平降低，并導(dǎo)致新的激活和抑制循環(huán)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，CLOCK和BMAL1基因呈現(xiàn)一致性的表達(dá)變化，與PER2基因的表達(dá)變化相反，這一結(jié)果與上述的循環(huán)通路的調(diào)控理論是相符的，而RORB與PER2的基因表達(dá)呈一致性的變化，據(jù)此推測(cè)鴨RORB對(duì)晝夜節(jié)律時(shí)鐘網(wǎng)絡(luò)具有負(fù)調(diào)控作用。本研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了鴨晝夜節(jié)律相關(guān)基因，尤其是鴨RORB的相關(guān)研究，為鴨的產(chǎn)蛋性能調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)Illumina測(cè)序的方法檢測(cè)了金定鴨RORB基因上Z-35251072、 Z-35256947、Z-35278196這3個(gè)位點(diǎn)的SNP突變情況，并分析了其與蛋重的相關(guān)性，證實(shí)3個(gè)SNP的突變與蛋重顯著負(fù)相關(guān)；RORB及相關(guān)基因的表達(dá)在不同蛋重組中差異顯著；這些結(jié)果提示RORB基因在蛋重的調(diào)節(jié)中可能具有重要作用。