活性氧對(duì)牛乳β- 乳球蛋白結(jié)構(gòu)、功能特性和致敏性的影響

楊子瀅，葛新宇，閆欣，楊永新，于春娣，楊慶利，呂良濤

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109）

食物過敏已成為全球范圍內(nèi)重要的食品安全問題。牛乳是可能導(dǎo)致人類食物過敏的食品之一，嚴(yán)重影響了部分人群特別是嬰幼兒的身體健康，輕度癥狀表現(xiàn)為腹瀉、蕁麻疹等，重度或引發(fā)休克反應(yīng)甚至死亡[1]。隨著牛乳及其制品的消費(fèi)量逐年增加，牛乳過敏的人群也在逐漸增加[2]，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）認(rèn)定牛乳及其制品為“八大”致敏性食物之一[3]。牛乳β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）是牛乳中的主要蛋白質(zhì)成分，在牛乳乳清中占蛋白總量的50%，分子量為16～18 kDa[4]，具有多方面的營養(yǎng)作用。β-LG 是一種具有良好功能特性的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，常用其作為功能性配料在食品加工中廣泛應(yīng)用[5]。

天然存在于牛乳中的β-LG 被認(rèn)為是牛乳的主要過敏原[6]。由于β-LG 高度結(jié)構(gòu)化與耐水解特性，在人體腸道內(nèi)消化后仍存在部分肽段分子，從而引起過敏癥狀[7]。近年來，有研究學(xué)者探究不同加工技術(shù)對(duì)牛乳β-LG 致敏性的影響。Jia 等[8]發(fā)現(xiàn)利用高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)可導(dǎo)致β-LG 致敏性降低。Yang 等[9]研究表明利用低頻超聲可促進(jìn)β-LG 的消化，使其致敏性降低。王明禮等[10]利用輻照技術(shù)對(duì)β-LG 進(jìn)行處理，結(jié)果表明β-LG經(jīng)過輻照加工后，其構(gòu)象表位破壞，導(dǎo)致其致敏性降低。Fei 等[11]利用靜態(tài)高壓技術(shù)使β-LG 的致敏性降低。這些研究在食品產(chǎn)業(yè)鏈中為控制過敏原風(fēng)險(xiǎn)提供技術(shù)支持，但由于加工過程中化學(xué)反應(yīng)眾多，影響因素復(fù)雜，尚不足以闡明牛乳過敏原的變化規(guī)律。牛乳在加工過程中影響蛋白質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)多樣，其中氧化是非常普遍且重要的化學(xué)反應(yīng)之一[12]。目前，有關(guān)活性氧氧化對(duì)牛乳β-LG 致敏性影響的研究鮮見。本研究旨在分析活性氧氧化對(duì)牛乳β-LG 結(jié)構(gòu)、功能特性和致敏性的影響。通過聚十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、圓二色譜、表面疏水性、內(nèi)源熒光等方法分析牛乳β-LG 氧化前后結(jié)構(gòu)的變化；乳化性、起泡性等方法分析牛乳β-LG 的功能特性變化；采用酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），大鼠嗜堿性細(xì)胞白血病細(xì)胞（rat basophilic leukemia cells，RBL-2H3）試驗(yàn)等方法分析牛乳β-LG 的致敏性變化。通過上述研究，有助于更好地了解加工過程中氧化對(duì)牛乳功能特性和致敏性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

H2O2水溶液（3%）：商丘圣邦生物科技有限公司；牛乳β-LG（純度≥90%）、標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker、三羥甲基氨基甲烷、磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽吐溫緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、十二烷基硫酸鈉（均為分析純）：北京Solarbio 公司；過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白E（Immunoglobulin E，IgE）抗體：北京中杉金橋生物科技公司；三硝基苯磺酸、四甲基聯(lián)苯胺、8-苯胺-1-萘磺酸（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G250、EMEM 培養(yǎng)基（含厄爾平衡鹽、L-谷氨酰胺、D-纈氨酸）：美國Sigma 公司；牛乳過敏血清（特異性IgE 水平＞0.5 kU/L）：青島大學(xué)附屬醫(yī)院；ELISA 試劑盒：美國Minneapolis 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光分光光度計(jì)（F2700）：日本日立公司；分光光度計(jì)（Characin V100）：英國應(yīng)用物理攝影有限公司；DYY-12 電泳儀：北京六一儀器廠；Tanon 4100 凝膠成像儀：上海天能公司；CD 偏光光譜儀（J-815）：日本分光株式會(huì)社；原子力顯微鏡（SPM-9700HT）：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

利用超純水將牛乳β-LG 溶液調(diào)整為2 mg/mL，采用芬頓氧化體系[13]（100 μL FeCl3分別與0、25、50、100 μL H2O2混合后加入5 mL 蒸餾水）對(duì)等體積2 mg/mL 牛乳β-LG 進(jìn)行氧化處理，最終H2O2濃度分別為0、2.5、5、10 mmol/L 4 組濃度梯度，在37 ℃避光環(huán)境下反應(yīng)12 h。

1.3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

參考Sharman 等[14]的方法對(duì)氧化后的牛乳β-LG進(jìn)行電泳試驗(yàn)。按照4 ∶1 的體積比將樣品和上樣緩沖液混合，混合后的樣品沸水浴7 min 后3 000 r/min 離心50 s。將樣品按順序裝入12%預(yù)制膠孔中，在120 V電壓下進(jìn)行SDS-PAGE 試驗(yàn)，待藍(lán)線即將拋出時(shí)停止電泳。將凝膠取出后，在染色盒中加入考馬斯亮藍(lán)R-250 染色液沒過凝膠，搖床上50 r/min 輕搖染色2 h，倒盡染色液后用超純水漂洗，倒入脫色液，直至凝膠上條帶清晰。最后用雙蒸水漂洗后，采用Tanon 4100 凝膠成像儀拍照。

1.3.3 圓二色譜分析

利用CD 偏光光譜儀檢測(cè)氧化前后牛乳β-LG 二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[15]。以超純水為空白，將氧化前后的牛乳β-LG 樣品用超純水稀釋至0.6 mg/mL。測(cè)定參數(shù)設(shè)置為掃描波長(zhǎng)190～260 nm，時(shí)間間隔0.25 s，掃描速率100 nm/min。數(shù)據(jù)以平均摩爾橢圓率表示，利用JASCO 軟件分析試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.4 內(nèi)源熒光強(qiáng)度檢測(cè)

根據(jù)Ju 等[16]的研究方法稍有改動(dòng)，將氧化的牛乳β-LG 樣品溶解于超純水中，使得上清液中蛋白濃度調(diào)整到0.5 mg/mL。以超純水為空白，每個(gè)樣品取1 mL到熒光比色皿中，利用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)樣品的內(nèi)源熒光強(qiáng)度。設(shè)置參數(shù)為激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)300～400 nm，掃描速度1 200 nm/min，狹縫寬度2.5 nm。

1.3.5 表面疏水性測(cè)定

采用Rodriguez 等[17]的方法略作修改，用超純水稀釋氧化前后的牛乳β-LG 樣品，使樣品濃度為0.05～0.5 mg/mL。取不同濃度的樣品1.5 mL，加入15 μL ANS 溶液，振蕩后靜置3 min，設(shè)置熒光分光光度計(jì)激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)分別為370 nm 與490 nm（狹縫校正均為5 nm），以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖并外推至蛋白濃度為0，曲線初始階段斜率即為樣品表面疏水性指數(shù)。

1.3.6 微觀結(jié)構(gòu)觀察

根據(jù)Hu 等[18]的方法分析氧化前后β-LG 的微觀結(jié)構(gòu)變化。各組樣品按體積比1 ∶1 000 稀釋，將蛋白懸浮液（10 μL，1 μg/mL）沉積到新鮮裂解的云母上，并在加熱燈下干燥。使用Bioscope（BS3-02）ScanAsyst 模式通過原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）在多個(gè)點(diǎn)進(jìn)行成像。掃描尺寸和掃描頻率分別為10.0 μm×10.0 μm，0.997 Hz。分析每個(gè)樣品3×512 nm 視場(chǎng)下的原子力顯微鏡（AFM）圖像。

1.3.7 功能特性測(cè)定

1.3.7.1 乳化性與乳化穩(wěn)定性測(cè)定

根據(jù)梁肖娜[19]的方法測(cè)定乳化性和乳化穩(wěn)定性。用超純水配制質(zhì)量濃度1 mg/mL 的β-LG 溶液，向溶液中加入體積比為1 ∶4 的大豆油，15 000 r/min 勻漿1 min后立即倒入試管中。分別于靜置0、10 min 時(shí)，在距離試管底0.5 cm 處用移液槍吸取50 μL 的乳液于5 mL 0.1%的SDS 溶液中，充分混勻后于500 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。計(jì)算β-LG 的乳化活性指數(shù)（emulsification activity index，EAI） 和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsification stability index，ESI）。

式中：E 為乳化活性指數(shù)，m2/g；S 為乳化穩(wěn)定性指數(shù)，%；ρ 為β-LG 質(zhì)量濃度，g/mL；φ 為油相所占體積分?jǐn)?shù)；A500nm為波長(zhǎng)500 nm 處的吸光值；A10為靜置10 min時(shí)乳液的吸光值；A0為靜置0 min 時(shí)乳液的吸光值。

1.3.7.2 起泡能力與起泡穩(wěn)定性測(cè)定

同樣采取1.3.7.1 中梁肖娜[19]的方法，取10 mL 的β-LG（1 mg/mL）溶液在10 000 r/min 條件下均質(zhì)勻質(zhì)2 min，迅速倒入50 mL 量筒，讀取泡沫體積V0，靜置30 min 后讀取泡沫體積V。計(jì)算β-LG 的起泡能力（foaming capacity，F(xiàn)C）與起泡穩(wěn)定性（Foaming stability，F(xiàn)S）。

式中：C 為起泡能力，%；F 為起泡穩(wěn)定性，%。

1.3.8 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)

參照Liu 等[20]的方法，利用間接ELISA 檢測(cè)活性氧氧化對(duì)牛乳β-LG 的IgE 結(jié)合能力。將各組樣品在50 mmol/L 碳酸鹽緩沖液中稀釋至10 μg/mL，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒提供的方案進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.3.9 RBL-2H3 細(xì)胞試驗(yàn)

RBL-2H3 細(xì)胞試驗(yàn)根據(jù)Yang 等[21]的方法稍作修改。大鼠肥大細(xì)胞RBL-2H3 接種于EMEM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素與100 g/mL 鏈霉素，在37 ℃下置于5% CO2/95%空氣環(huán)境中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到2×106個(gè)/mL 的密度時(shí)，接種于96 孔培養(yǎng)板中，將細(xì)胞用來自牛乳過敏患者的血清（1 ∶10 稀釋）致敏24 h，用臺(tái)氏液洗滌3 次，在培養(yǎng)基中加入100 ng/mL β-LG 進(jìn)行激發(fā)。參考Kuehn 等[22]的方法測(cè)定β-己糖苷酶的釋放率。將所有樣品1 000 r/min離心15 min 后收集上清液，采用ELISA 試劑盒測(cè)定β-己糖苷酶、組胺、半胱氨酰白三烯、前列腺素D2、白介素-4 與白介素-13 的釋放量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究中所有試驗(yàn)平行操作3 次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用Prism 軟件作圖。SPSS 19.0 軟件用于試驗(yàn)中各組數(shù)據(jù)的單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性氧氧化牛乳β-LG 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

活性氧氧化β-LG 產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖1 所示。

圖1 β-乳球蛋白與不同濃度過氧化氫反應(yīng)后產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of the products of β-LG after reaction with different concentrations of hydrogen peroxide

由圖1 可知，所用蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量為11～180 kDa，活性氧氧化的β-LG 經(jīng)電泳分析后，結(jié)果顯示隨著氧化反應(yīng)濃度的增加，β-LG 條帶向上發(fā)生輕微遷移。未經(jīng)氧化的β-LG 在16 kDa 處有一條蛋白條帶，當(dāng)芬頓氧化體系中H2O2濃度為10 mmol/L 時(shí)，在更高分子量的位置形成了聚合物，即在17 kDa 左右處形成新的條帶。

2.2 活性氧氧化牛乳β-LG 構(gòu)象結(jié)構(gòu)的變化

活性氧氧化牛乳β-LG 構(gòu)象結(jié)構(gòu)的變化如圖2 所示。

圖2 活性氧氧化對(duì)牛乳β-LG 構(gòu)象結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of reactive oxygen species oxidation on conformational structure of bovinemilk β-LG

由圖2A 可知，0 mmol/L 組的牛乳β-LG 在195 nm附近顯示2 個(gè)正峰，208 nm 處有一個(gè)明顯的負(fù)峰。195 nm 處的正峰和208 nm 處的負(fù)峰表示牛乳β-LG中存在β-螺旋結(jié)構(gòu)。隨著H2O2濃度增加，活性氧氧化引起牛乳β-LG 二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，主要表現(xiàn)在α-螺旋含量減少。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)丙烯醛氧化乳球蛋白后，α-螺旋結(jié)構(gòu)也下降[23]。

利用內(nèi)源熒光光譜評(píng)估蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，對(duì)活性氧氧化牛乳β-LG 的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。由圖2B 可知，牛乳β-LG 的熒光強(qiáng)度的峰值λmax 在346 nm處，隨著芬頓氧化體系濃度的增加，氧化修飾的牛乳β-LG熒光強(qiáng)度有持續(xù)下降趨勢(shì)。當(dāng)芬頓氧化體系濃度達(dá)到10 mmol/L 時(shí)，牛乳β-LG 的熒光強(qiáng)度的峰值相較于氧化體系濃度0 mmol/L 組降低了48%，λmax 從346 nm藍(lán)移到342 nm。氧化后牛乳β-LG 引起λmax 藍(lán)移，推測(cè)可能是牛乳β-LG 分子外部處于極性環(huán)境中，色氨酸和酪氨酸殘基被轉(zhuǎn)移到內(nèi)部非極性環(huán)境中[24]，這是由于活性氧氧化牛乳β-LG 發(fā)生聚集變化引起的。

2.3 活性氧氧化牛乳β-LG 疏水性的變化

蛋白質(zhì)的表面疏水性也是評(píng)估其構(gòu)象變化的特征指標(biāo)之一。氧化前后牛乳β-LG 的表面疏水性結(jié)果如圖3 所示。

圖3 活性氧氧化對(duì)牛乳β-LG 表面疏水性的影響Fig.3 Effect of reactive oxygen species oxidation on surface hydrophobicity of bovine milk β-LG

由圖3 可知，隨著H2O2濃度的增加，牛乳β-LG的表面疏水性逐漸增加。當(dāng)H2O2濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí)，牛乳β-LG 的表面疏水性是H2O2濃度為0 mmol/L時(shí)的2.4 倍。根據(jù)以上的結(jié)果推測(cè)芬頓體系氧化修飾的牛乳β-LG 產(chǎn)生聚集可能是由于蛋白質(zhì)通過折疊使疏水基團(tuán)暴露，暴露的疏水基團(tuán)可以通過疏水相互作用形成聚集體[25]。進(jìn)一步說明，蛋白質(zhì)表面疏水性與疏水側(cè)鏈氧化程度的強(qiáng)弱、蛋白質(zhì)去折疊以及蛋白質(zhì)聚集程度有關(guān)。

2.4 活性氧氧化牛乳β-LG 微觀結(jié)構(gòu)的變化

使用原子力顯微鏡確定氧化前后牛乳β-LG 顆粒的聚集和表面形貌。用芬頓氧化體系處理牛乳β-LG的AFM 高度圖像如圖4 所示。

圖4 牛乳βLG 的AFM 高度圖像Fig.4 AFM height image of bovine milk βLG

由圖4 可知，未經(jīng)氧化處理的牛乳β-LG 在形狀周圍顯示并堆疊形成較厚的蛋白質(zhì)層，其頂部幾乎沒有蛋白質(zhì)聚集體。然而，當(dāng)芬頓氧化體系濃度增加到2.5 mmol/L 時(shí)，觀察到少量的βLG 聚集體，這表明低過氧化氫氧化劑濃度誘導(dǎo)βLG 的分段聚集。隨著芬頓氧化體系濃度的逐漸增加，蛋白質(zhì)聚集程度增加?？赡苁且?yàn)榈鞍踪|(zhì)表面存在靜電作用，由于正負(fù)電荷排斥放大其暴露的疏水表面，疏水表面形成聚集傾向區(qū)域，從而促進(jìn)了蛋白質(zhì)顆粒的聚集[18]。

2.5 活性氧氧化牛乳β-LG 功能特性的變化

活性氧氧化對(duì)牛乳β-LG 功能特性的影響如圖5所示。

圖5 活性氧氧化對(duì)牛乳β-LG 功能特性的影響Fig.5 Effect of reactive oxygen species oxidation on functional characteristics of bovine milk β-LG

由圖5A 可知，與對(duì)照組相比，添加2.5 mmol/L 過氧化氫后，牛乳β-LG 的EAI 從26.12 m2/g 降至23.36 m2/g，ESI 升高至10.11%。隨著芬頓氧化體系濃度升高至10 mmol/L，EAI 降低至19.02 m2/g，而ESI 升高至12.52%。乳化活性隨著芬頓氧化體系濃度的增加而降低，而乳化穩(wěn)定性卻升高?？赡苁且?yàn)檫^氧化氫導(dǎo)致β-LG 表面疏水性升高，親水能力下降，吸附在油-水界面蛋白質(zhì)含量減少，這是影響β-LG 乳化活性的關(guān)鍵因素，故導(dǎo)致EAI 下降[26]。乳化穩(wěn)定性提高可能歸因于靜置后蛋白質(zhì)在分層處重排乳化形成一層高彈性膜，阻止油滴聚集上浮，從而提高乳化穩(wěn)定性[27]。

由圖5B 可知，隨著過氧化氫濃度增加，牛乳β-LG 的FC 及FS 都有不同程度增高，過氧化氫濃度從0 mmol/L增加到10 mmol/L 時(shí)，F(xiàn)C 由21.47%升高至25.38%，F(xiàn)S 由21.31%升高至23.46%。可能是因?yàn)榛钚匝跹趸古Ｈ棣?LG 的疏水基暴露在蛋白表面，同時(shí)增強(qiáng)其分子間相互作用，從而增強(qiáng)表面張力與表面彈性，F(xiàn)C 與FS 得到提高[28]。

2.6 活性氧氧化牛乳β-LG 潛在致敏性的變化

為進(jìn)一步評(píng)估芬頓氧化體系對(duì)牛乳β-LG IgE 結(jié)合能力的影響，通過間接ELISA 來測(cè)定與牛乳過敏患者血清的結(jié)合能力，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 活性氧氧化對(duì)牛乳β-LG 致敏性的影響Fig.6 Effect of reactive oxygen species oxidation on sensitization of bovine milk β-LG

由圖6 可知，相比于純化的牛乳β-LG，芬頓氧化體系氧化的牛乳β-LG 的IgE 結(jié)合能力降低。當(dāng)芬頓氧化體系濃度為10 mmol/L 時(shí)，牛乳β-LG 的IgE 結(jié)合能力相較于氧化體系濃度為0 mmol/L 下降了50%。有研究表明，在氧化過程中，氨基酸側(cè)鏈被修飾導(dǎo)致某些表位的破壞，或者修飾后產(chǎn)生的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致牛乳β-LG 過敏原IgE 結(jié)合能力降低[29]。因此，原因可能是隨著芬頓氧化體系濃度的增加，牛乳β-LG 氨基酸側(cè)鏈發(fā)生改變，引起蛋白質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)生聚集體，破壞了其相應(yīng)的過敏表位，從而引起其IgE 結(jié)合能力下降。由于過敏原能夠和IgE 高效結(jié)合，這其中肥大細(xì)胞在IgE 介導(dǎo)的過敏中起到了關(guān)鍵的作用，是過敏反應(yīng)過程中重要的效應(yīng)細(xì)胞。因此，過敏反應(yīng)在體外研究中常常運(yùn)用大鼠嗜堿性細(xì)胞白血病細(xì)胞（RBL-2H3）作為肥大細(xì)胞模型[30]。采用RBL-2H3 測(cè)定芬頓體系氧化的牛乳β-LG 致敏性的變化，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 RBL-2H3 細(xì)胞模型中各過敏介質(zhì)對(duì)應(yīng)釋放率與釋放量變化Fig.7 Changes in cytokine release rate and content in RBL-2H3 cell model

由圖7 可知，未添加過氧化氫的對(duì)照組RBL-2H3的β-己糖苷酶釋放率為64.46%，組胺釋放量為166.23 ng/mL，半胱氨酰白三烯釋放量為538.01 pg/mL，前列腺素D2 釋放量為124.55 pg/mL，白介素-4 釋放量為109.56 pg/mL，白介素-13 釋放量為71.83 pg/mL，隨著過氧化氫濃度升高，各細(xì)胞因子釋放率或釋放量逐步下降。在β-己糖苷酶釋放率的測(cè)定中，當(dāng)過氧化氫濃度為10 mmol/L 時(shí)，β - 己糖苷酶釋放率降低至23.36%（圖7A），結(jié)果說明芬頓體系氧化的牛乳β-LG能夠有效地抑制RBL-2H3 釋放β-己糖苷酶。在組胺釋放量測(cè)定中，10 mmol/L 芬頓體系氧化的牛乳β-LG刺激細(xì)胞組胺釋放量下降了57.2 ng/mL（圖7B）。在半胱氨酰白三烯釋放量的測(cè)定中，10 mmol/L 芬頓體系氧化的牛乳β-LG 刺激細(xì)胞后半胱氨酰白三烯釋放量下降到386.73 pg/mL（圖7C），抑制率為28.12%。在前列腺素D2 釋放量的測(cè)定中，芬頓體系氧化修飾的牛乳β-LG 刺激細(xì)胞后前列腺素D2 釋放量下降，尤以10 mmol/L 組最為顯著，其釋放量降低至63.89 pg/mL（圖7D），抑制率達(dá)為48.70%。白介素-4 釋放量與白介素-13 釋放量相較于未添加過氧化氫組均表現(xiàn)出顯著抑制，抑制率分別為46.54%與32.72%（圖7E、圖7F）。

上述試驗(yàn)結(jié)果表明芬頓體系氧化的牛乳β-LG 能夠有效的抑制RBL-2H3 釋放活性介質(zhì)和細(xì)胞因子。

3 結(jié)論

通過活性氧氧化牛乳β-乳球蛋白，探究其對(duì)牛乳β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)、功能特性和致敏性的影響。結(jié)果表明，加工過程中適當(dāng)氧化可以改變牛乳β-LG 構(gòu)象結(jié)構(gòu)，從而影響其功能特性和致敏性。β-LG 的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，當(dāng)過氧化氫濃度達(dá)到10 mmol/L 時(shí)，表面疏水性升高至原來的2.4 倍，內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低了48%，起泡能力由21.47%升高至25.38%，起泡穩(wěn)定性由21.31%升高至23.46%，乳化活性由26.12 m2/g降低至19.02 m2/g，但乳化穩(wěn)定性由21.31%升高至23.46%。β-LG 的IgE 結(jié)合能力升高，RBL-2H3 中各過敏介質(zhì)釋放率及釋放量發(fā)生顯著變化。本研究為探究食品加工過程中牛乳β-LG 功能特性及致敏性的變化規(guī)律提供參考。