超聲協(xié)同酶法提取紅菇多糖工藝優(yōu)化及不同產(chǎn)地紅菇多糖分析

鐘碧萍,吳曉青

((福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院,福建 福州 350002))

紅菇(Russula)被譽(yù)為“中國純自然高級野生山珍”之一[1],在我國多個省市均有分布,較多出現(xiàn)在福建、云南、遼寧、江蘇、江西、廣東、廣西、四川等地[2],它不僅僅是一類珍稀的野生菌類,還富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖和其他人類健康所必需的營養(yǎng)素物質(zhì)[3],紅菇多糖是紅菇中重要的成分之一,不同產(chǎn)地紅菇中多糖成分有所差異,但都具有抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、抗肝功能衰退[6]、降血壓、降血脂[7]等方面的藥理作用。

目前文獻(xiàn)報道的紅菇多糖提取方法主要有熱水提取[8-9]、微波輔助提取[10-11]、超聲輔助提取[12-13]等方法。熱水提取法環(huán)保、經(jīng)濟(jì)安全,需要儀器簡單,但有耗時長,容易得到酸性多糖的缺點;微波提取法耗時短、節(jié)能,但容易產(chǎn)生局部高溫導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;單獨的超聲波輔助提取法效率高、耗時短,但有效范圍較小,現(xiàn)有的三種紅菇提取方法各有優(yōu)缺點。而超聲波協(xié)同酶法可兼具兩種提取方法的優(yōu)點,與這幾種方法相比,具有提取效率高、耗時少、操作簡單等優(yōu)點。

近年來,超聲波-酶解法已經(jīng)成為植物多糖提取的重要手段,梁樂欣等[14]使用超聲波協(xié)同纖維素酶法提取紫蘇葉多糖;孫燕麗等[15]使用超聲波-復(fù)合酶法協(xié)同提取馬齒莧多糖;秦令祥等[16]使用超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取香菇多糖。然而,紅菇多糖的提取技術(shù)尚未得到充分的研究,目前還沒有用超聲波-酶法提取紅菇多糖的相關(guān)文獻(xiàn),因此,本文將探索采用超聲波-纖維素酶法來提取紅菇多糖以及對不同產(chǎn)地的紅菇多糖含量差異進(jìn)行分析,旨在為紅菇多糖提取提供新研究方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅菇:產(chǎn)自福建省三明市、云南省、廣東省,均為市售干貨;纖維素酶(50 000 U/g)購自上海阿拉丁化學(xué)試劑公司;葡萄糖、硫酸、苯酚、乙醇、三氯化鐵、氯仿、正丁醇等均購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

UV-1810型紫外可見光分光光度計(購自上海市美普達(dá)儀器設(shè)備服務(wù)公司)、AL204型電子天平儀器(購自浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠)、KQ-500B型超聲清洗器(購自昆山市超聲儀器服務(wù)公司)、HH-2S數(shù)顯恒溫式水浴鍋(購自常州市國旺儀器設(shè)備服務(wù)公司)、電熱鼓風(fēng)恒溫式風(fēng)干箱(購自上海市東星建筑實驗機(jī)械設(shè)備服務(wù)公司)、TG16-WS型離心機(jī)(購自長沙湘智離心機(jī)儀器設(shè)備服務(wù)公司)、SHD-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(購自保定高新區(qū)陽光科教儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)曲制備

稱取無水葡萄糖0.15 g,精密稱定,置于100 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,即得1.5 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mL置于100 mL容量瓶中,加水至刻度,搖勻。分別吸取系列濃度溶液1.0 mL再加入新配制的5%的苯酚溶液1.0 mL,濃硫酸4.0 mL,混勻,沸水浴30 min,冷卻。在490 nm波長處測定吸光度,而后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,用于紅菇多糖測定。

1.3.2 紅菇多糖制備

將野生紅菇烘干至恒重后用粉碎機(jī)粉碎,用密封袋分裝后放入干燥箱中備用。精密稱取0.25 g,根據(jù)實驗設(shè)計的液料比、超聲時間、超聲功率、酶解時間和酶解溫度提取多糖,過濾后,再將其和Sevage溶劑(氯仿和正丁醇的體積配比為4∶1)以體積比 5 ∶ 1 加以混勻,除去蛋白質(zhì)[17]。分離有機(jī)相和水相,水相使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其加以濃縮,然后將其與3倍體積量的無水乙醇混勻,抽濾,沉淀用丙酮經(jīng)過3遍清洗,抽濾干燥,最終得到紅菇多糖的粗品。

1.3.3 多糖含量計算

采用苯酚-硫酸法[18]測定紅菇多糖含量,將按照1.3.2所述方法操作得到的粗多糖,溶解定容至500 mL,搖勻。取1.0 mL加入新配制的5%的苯酚溶液1.0 mL,濃硫酸4.0 mL,混勻,沸水浴30 min,冷卻,在490 nm波長處測定吸光度,測定紅菇多糖含量,參考文獻(xiàn)[19]計算多糖質(zhì)量。多糖得率=多糖質(zhì)量/原料取樣質(zhì)量。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計

1.3.4.1 液料比試驗

選取20,30,40,50,60 mL/g五種濃度的液料比,在超聲時間40 min、超聲功率150 W、酶解時間30 min、酶解溫度40 ℃時,按照苯酚-硫酸法測定吸光度,得到紅菇多糖提取率。

1.3.4.2 超聲時間試驗

選取30,40,50,60,70 min五種不同超聲時間,在液料比30 mL/g、超聲功率150 W、酶解時間30 min、酶解溫度40 ℃時,按照苯酚-硫酸法測定吸光度,得到紅菇多糖提取率。

1.3.4.3 超聲功率試驗

選取100,150,200,250,300 W五種超聲功率,在液料比30 mL/g、超聲時間40 min、酶解時間30 min、酶解溫度40 ℃時,按照苯酚-硫酸法測定吸光度,得到紅菇多糖提取率。

1.3.4.4 酶解時間試驗

選取20,30,40,50,60 min五種酶解時間,在液料比30 mL/g、超聲時間40 min、超聲功率150 W,酶解溫度40 ℃時,按照苯酚-硫酸法測定吸光度,得到紅菇多糖提取率。

1.3.4.5 酶解溫度試驗

選取30,35,40,45,50 ℃五種酶解溫度,在液料比30 mL/g、超聲時間40 min、超聲功率150 W,酶解時間30 min時,用苯酚-硫酸法測定吸光度,得到紅菇多糖提取率。

1.3.5 正交試驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,將超聲功率定為200 W,選擇液料比(A)、超聲時間(B)、酶解時間(C)和酶解溫度(D)四個因素作為變量,將紅菇多糖的提取百分率為響應(yīng)值,進(jìn)行了四因素三水平正交測定,見表1。

表1 正交設(shè)計因素與水平表

1.3.6 驗證試驗

以選定的四因素三水平正交實驗確定出的最優(yōu)提取條件進(jìn)行驗證實驗,測出紅菇多糖提取率,驗證方法可靠性。

1.3.7 不同產(chǎn)地野生紅菇多糖含量測定

以正交試驗確定的最優(yōu)提取條件測定福建三明、云南、廣東三種產(chǎn)地紅菇多糖的提取率,比較不同產(chǎn)地紅菇多糖含量差異性。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 液料比對多糖得率的影響

選取20∶1,30∶1,40∶1,50∶1,60∶1(mL∶g)五種液料比,在超聲時間40 min、超聲功率150 W、酶解時間30 min、酶解溫度40 ℃時,測定三種不同產(chǎn)地紅菇多糖提取得率(圖1)。結(jié)果顯示,液料比為40∶1(mL∶g)時多糖得率最高,原因可能是足夠的溶劑量是多糖溶出的必要條件,而當(dāng)液料比達(dá)到一定時,多糖溶出率基本飽和,提取率趨于平穩(wěn),故不再繼續(xù)增加[20]。因此液料比40∶1(mL∶g)為最佳提取料液比,選擇液料比 30∶1,40∶1,50∶1(mL∶g)進(jìn)行正交實驗。

圖1 液料比對多糖得率的影響

2.1.2 超聲時間對多糖得率的影響

選取30,40,50,60,70 min五種不同超聲時間,在液料比30 mL/g、超聲功率150 W、酶解時間30 min、酶解溫度40 ℃時,測定提取多糖得率(圖2)。結(jié)果顯示,超聲時間50 min時多糖得率最高,隨著超聲時間繼續(xù)增加,多糖提取率反而下降,原因可能是超聲時間超過一定時,會破壞多糖的分子結(jié)構(gòu),故而多糖提取率降低[21]。因此超聲時間選取50 min為最佳超聲時間,選擇超聲時間40,50,60 min進(jìn)行正交實驗。

圖2 超聲時間對多糖得率的影響

2.1.3 超聲功率對多糖得率的影響

選取100,150,200,250,300 W五種超聲功率,在液料比30 mL/g、超聲時間40 min、酶解時間30 min、酶解溫度40 ℃時,測定多糖得率(圖3)。結(jié)果顯示,超聲功率200 W時多糖得率最高,繼續(xù)增加超聲功率,提取率反而下降,超聲功率不宜太大原因是功率太大,會破壞多糖分子的結(jié)構(gòu)[22]。因此超聲功率選取200 W為最佳超聲功率。在正交試驗中選取200 W超聲功率用于紅菇多糖提取。

圖3 超聲功率對多糖得率的影響

2.1.4 酶解時間對多糖得率的影響

選取20,30,40,50,60 min五種酶解時間,在液料比30 mL/g、超聲時間40 min、超聲功率150 W,酶解溫度40 ℃時,測定紅菇多糖提取得率(圖4)。結(jié)果顯示,酶解時間30 min時,多糖得率最高,繼續(xù)增加酶解時間,得率不再增加,原因是超過30 min時,多糖提取已經(jīng)較為完全,得到的多糖會出現(xiàn)分解,因此酶解時間選取30 min為最佳酶解時間,選擇酶解時間 20,30,40 min進(jìn)行正交實驗。

圖4 酶解時間對多糖得率的影響

2.1.5 酶解溫度對多糖得率的影響

選取30,35,40,45,50 ℃五種酶解溫度,在液料比30∶1(mL∶g)、超聲時間40 min、超聲功率150 W,酶解時間30 min時,測定紅菇多糖得率(圖5)。結(jié)果顯示,酶解溫度35 ℃時,紅菇多糖得率最高,溫度超過35 ℃,多糖提取得率反而有所下降,原因是溫度太高,會導(dǎo)致多糖的降解,因此酶解溫度選取35 ℃為最佳酶解溫度,選擇酶解溫度 30,35,40 ℃進(jìn)行正交實驗。

圖5 酶解溫度對多糖得率的影響

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

進(jìn)行四個不同的因素的三水平正交試驗,將液料比(A)、超聲時間(B)、酶解時間(C)和酶解溫度(D)作為四個重要的參數(shù),液料比選擇30∶1,40∶1,50∶1(mL∶g),超聲時間選擇40,50,60 min,酶解時間選擇20,30,40 min,酶解溫度選擇30,35,40 ℃,將紅菇多糖的提取率(%)作為評估的指標(biāo),實驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果與分析表

由表2可知,四個因素對紅菇多糖的提取率均有影響,比較極差R可以看出,料液比(A)對多糖提取率的影響最大,而后依次為酶解時間、超聲時間、酶解溫度。采用A2B2C2D2作為提取紅菇多糖的最佳參數(shù),即液料比40∶1(mL∶g)、超聲時間50 min、酶解時間30 min、酶解溫度35 ℃。

2.3 驗證性試驗

通過正交試驗得到最優(yōu)條件下,即液料比40∶1(mL∶g)、超聲時間50 min、酶解時間30 min、酶解溫度35 ℃條件下做 3 次平行試驗,得到紅菇多糖提取率為8.753%。經(jīng)過實驗,我們發(fā)現(xiàn)提取率與正交實驗最高提取率略高,說明了提取方法穩(wěn)定可靠。

2.4 不同產(chǎn)地野生紅菇多糖含量測定

以正交試驗確定的最優(yōu)提取條件,即液料比40∶1(mL∶g)、超聲時間50 min、酶解時間30 min、酶解溫度35 ℃條件下做3次平行試驗,測定福建三明產(chǎn)地的紅菇多糖提取率為8.753%、云南產(chǎn)地的紅菇多糖提取率為7.953%、廣東產(chǎn)地的紅菇多糖的提取率為8.836%。從數(shù)據(jù)中可知,福建、廣東產(chǎn)地的紅菇多糖提取率差別并不顯著,而云南產(chǎn)地的多糖提取率與其余兩種產(chǎn)地相比多糖含量較低,原因可能與紅菇生長土壤、環(huán)境及天氣有關(guān),文獻(xiàn)中得知,目前紅菇屬有300多種,國內(nèi)有90多種[23],后續(xù)可研究其他產(chǎn)地種屬紅菇,以期發(fā)現(xiàn)多糖含量更高的種屬,文章所研究的三種產(chǎn)地紅菇均可作為多糖進(jìn)一步開發(fā)利用的原料。

3 結(jié)論

本試驗通過單因素試驗和正交試驗設(shè)計,得出超聲波-酶法協(xié)同提取紅菇多糖在液料比40∶1(mL∶g)、超聲時間50 min、酶解時間30 min、酶解溫度35 ℃時,可以獲得紅菇多糖的最優(yōu)提取效果,福建三明產(chǎn)地的紅菇多糖提取率為8.753%、云南產(chǎn)地的紅菇多糖提取率為7.953%、廣東產(chǎn)地的紅菇多糖的提取率為8.836%。提取方法為超聲協(xié)同纖維素酶法,可以兼具兩種提取方法的優(yōu)點,與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的紅菇多糖方法相比,試劑用量小、耗時短、生物活性強(qiáng)且提取率更高,故此方法可為后續(xù)紅菇多糖研究提供更多參考,為紅菇在保健與食品等方面的應(yīng)用提供依據(jù)。