膿毒癥的免疫監(jiān)測(cè)和免疫治療

劉鳳琪 唐坎凱 張根生

1 湖州市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科， 湖州 313000；2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，多臟器衰竭預(yù)警與干預(yù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（浙江大學(xué)），杭州 310009

膿毒癥是病原體和宿主免疫系統(tǒng)之間的一場(chǎng)死亡競(jìng)賽[1]。 盡管在早期識(shí)別、預(yù)防和治療方面已經(jīng)取得了巨大進(jìn)展， 膿毒癥的發(fā)病率和死亡率仍居高不下。 2017 年，全球有4 890 萬例患者發(fā)生膿毒癥，其中有1 100 萬例與膿毒癥相關(guān)的死亡， 占當(dāng)年死亡人數(shù)的19.7%[2]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，膿毒癥不僅會(huì)引起過度炎癥， 還會(huì)同時(shí)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能障礙和抗菌免疫力受損。 因此， 免疫治療是提高宿主感染抵抗力最有希望的潛在方法。 本文主要聚焦膿毒癥免疫紊亂的主要機(jī)制、免疫監(jiān)測(cè)的手段，以及新型免疫診療進(jìn)展。

一、膿毒癥免疫紊亂機(jī)制

膿毒癥除早期對(duì)感染產(chǎn)生炎癥反應(yīng)或部分發(fā)生過度炎癥反應(yīng)外， 代償性抗炎反應(yīng)引起的嚴(yán)重免疫抑制是膿毒癥死亡的主要原因， 而宿主的免疫失調(diào)是膿毒癥發(fā)病以及進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制[3]。 膿毒癥早期促炎反應(yīng)的特點(diǎn)是激活多個(gè)復(fù)雜的分子和細(xì)胞過程，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)，引發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，共同導(dǎo)致微循環(huán)和大循環(huán)失調(diào)，包括毛細(xì)血管滲漏、組織水腫、血管擴(kuò)張和凝血功能障礙等，最終導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（MODS）。 過度炎癥僅僅是膿毒癥的開始，一旦免疫紊亂得不到及時(shí)穩(wěn)定，后續(xù)將發(fā)生嚴(yán)重的免疫麻痹狀態(tài)。 膿毒癥免疫抑制期間發(fā)生淋巴細(xì)胞消耗和衰竭、抗炎免疫細(xì)胞擴(kuò)增、人類白細(xì)胞抗原DR（HLA-DR）和細(xì)胞程序性死亡受體-1/細(xì)胞程序性死亡-配體1(PD1/PD-L1)表達(dá)異常以及代謝和表觀遺傳學(xué)改變， 這些機(jī)制共同作用形成了復(fù)雜的免疫抑制環(huán)境， 從而導(dǎo)致繼發(fā)感染甚至死亡風(fēng)險(xiǎn)的增加。 膿毒癥免疫紊亂具體機(jī)制見圖1。

圖1 膿毒癥免疫紊亂機(jī)制

二、膿毒癥免疫抑制識(shí)別

監(jiān)測(cè)膿毒癥常用的生物標(biāo)志物為降鈣素原、C反應(yīng)蛋白和白細(xì)胞。 然而， 這些標(biāo)記物的主要缺陷是特異性不高， 既不能反映宿主對(duì)感染反應(yīng)的嚴(yán)重程度，也不能幫助識(shí)別參與免疫失調(diào)的細(xì)胞或組織。在膿毒癥狀態(tài)下， 先天免疫細(xì)胞通過介導(dǎo)病原體清除，有助于激活和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。 因此，中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、DC 和NK 細(xì)胞等數(shù)量和功能狀態(tài)的改變以及細(xì)胞亞群間的不平衡是監(jiān)測(cè)膿毒癥先天性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵指標(biāo)，而T 細(xì)胞和B 細(xì)胞是獲得性免疫系統(tǒng)功能障礙的主要監(jiān)測(cè)對(duì)象。 目前大量的臨床研究發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)記物有助于膿毒癥的診斷、 疾病狀態(tài)的監(jiān)測(cè)和不良臨床結(jié)局的預(yù)測(cè)（見表1）[4-6]。根據(jù)最近發(fā)表的《膿毒癥免疫抑制監(jiān)測(cè)和治療專家共識(shí)》[5]，推薦將mHLA-DR 下降、單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素（LPS）刺激的反應(yīng)性降低、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs）的比例增加、Th1/Th2比例失衡和免疫球蛋白（IgA、IgM 和IgG）濃度降低作為膿毒癥所致免疫抑制的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

表1 膿毒癥免疫監(jiān)測(cè)指標(biāo)

三、膿毒癥的免疫治療

目前， 已經(jīng)有一些膿毒癥免疫制劑在動(dòng)物模型和臨床實(shí)踐中進(jìn)行了研究和驗(yàn)證， 具有代表性的包括粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、IFN-γ、抗PD-1/PD-L1 抗體和胸腺肽α1（Tα1）等。 近年也有一些新的免疫制劑問世，并取得了令人驚喜的療效。

1. Tα1

Tα1 能激活DC、NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，刺激T 細(xì)胞增殖和活化，增強(qiáng)Th1 細(xì)胞的抗菌作用。最近的研究表明，Tα1 可通過增加重癥COVID-19 患者CD4+和CD8+T 細(xì)胞數(shù)量，降低CD8+T 細(xì)胞上PD-1和Tim-3 的表達(dá)， 以恢復(fù)淋巴細(xì)胞數(shù)量和逆轉(zhuǎn)T 細(xì)胞耗竭，進(jìn)而降低重癥COVID-19 患者的死亡率[7]。

2. IFN-γ

IFN-γ 是Ⅱ型IFN 家族的唯一成員， 具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和殺菌， 促進(jìn)消滅病原體的能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)最新證明，IFN-γ 通過PI3K/Akt/mTOR 通路促進(jìn)Warburg 效應(yīng)逆轉(zhuǎn)膿毒癥小鼠引起的免疫抑制[8]，該研究闡明了IFN-γ 對(duì)膿毒癥免疫治療的潛在作用機(jī)制， 為膿毒癥的治療提供了新的靶點(diǎn)。 但在一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究中，與安慰劑相比，IFN-γ 治療并未顯著降低機(jī)械通氣的成年危重患者第28 天醫(yī)院獲得性肺炎發(fā)生率或死亡率[9]。 此外，由于IFN-γ 治療安全性問題，該試驗(yàn)提前終止。因此，IFN-γ 在膿毒癥中的防治作用及其臨床安全性均值得進(jìn)一步關(guān)注。

3. GM-CSF

GM-CSF 作為一種促炎細(xì)胞因子和骨髓生成生長(zhǎng)因子在介導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和肺部炎癥中發(fā)揮著重要作用[10]。 在一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究中，使用GMCSF 單克隆抗體治療重癥COVID-19，第28 天時(shí)存活且無呼吸衰竭的患者比例與對(duì)照組的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[11]。 另一項(xiàng)前瞻性臨床研究正在評(píng)估新型吸入式GM-CSF 制劑在改善COVID-19 相關(guān)急性缺氧性呼吸衰竭患者的氧合以及短期和長(zhǎng)期的療效（臨床試驗(yàn)注冊(cè)號(hào)：NCT04326920）[12]， 以驗(yàn)證其在膿毒癥治療中的作用。

4. 抗PD-1/PD-L1 抗體

抗PD-1/PD-L1 抗體能恢復(fù)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞在膿毒癥免疫抑制中的功能。在Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)中， 膿毒癥誘導(dǎo)的免疫抑制患者靜脈給予抗PD-1 抗體治療，結(jié)果顯示960 mg 單藥劑量具有良好臨床耐受性，且未誘發(fā)任何“細(xì)胞因子風(fēng)暴”[13]，但是需要后續(xù)的Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其療效。

5. 重組人IL-7

IL-7 能誘導(dǎo)膿毒癥免疫抑制狀態(tài)患者的淋巴細(xì)胞增殖和防止淋巴細(xì)胞凋亡。 最新一項(xiàng)前瞻性的RCT 研究， 發(fā)現(xiàn)無論是靜脈還是肌肉注射IL-7，均能夠逆轉(zhuǎn)膿毒癥誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞減少癥， 同時(shí)未觀察到細(xì)胞因子風(fēng)暴和針對(duì)IL-7 的抗體的形成[14]。 但靜脈注射IL-7 可引起短暫的呼吸窘迫和發(fā)熱，故優(yōu)先推薦肌肉注射。 此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，肌肉注射IL-7能夠促進(jìn)血液中的淋巴細(xì)胞恢復(fù)到參考水平， 其可逆轉(zhuǎn)危重癥COVID-19 導(dǎo)致的病理損傷， 而且不會(huì)加劇炎癥或肺損傷[15]。

6. 重組人Prokineticin-2（rPK2）

rPK2 是rPK 家族的成員，與多種生物學(xué)功能有關(guān)，包括神經(jīng)發(fā)育、血管生成和炎癥反應(yīng)等，其在膿毒癥中的研究才剛剛興起。 近期研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重膿毒癥患者血清rPK2 的濃度顯著降低[16]。 在動(dòng)物模型中，重組rPK2 可以提高膿毒癥小鼠的存活率， 并減輕膿毒癥引起的多器官損傷[16]。 在體外細(xì)胞模型中，rPK2 通過rPK2-PKR1-ST3 信號(hào)通路可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和殺菌能力[16]。 這些研究提示，rPK2 既可作為膿毒癥和膿毒性休克的潛在生物標(biāo)志物，同時(shí)又為膿毒癥免疫治療提供了新的策略。

7. 巴瑞替尼

巴瑞替尼是一種酪氨酸蛋白激酶抑制劑， 可防止炎癥刺激引起的毛細(xì)血管滲漏和肺泡水腫。 荷蘭一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與安慰劑相比， 口服巴瑞替尼能減少危重癥COVID-19 住院患者機(jī)械通氣時(shí)間（7 dvs.12 d），而且能降低28 d死亡率（8%vs. 14%）[17]。 最新一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，巴瑞替尼盡管對(duì)接受機(jī)械通氣COVID-19 患者的肺水腫或臨床結(jié)局沒有顯著改善作用，但可減輕以高IL-6、高腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）和高表面活性蛋白-D（SP-D）為特征的亞表型患者的肺水腫[18]。 因此，這些結(jié)果為后續(xù)繼續(xù)探索巴瑞替尼治療膿毒癥或者COVID-19 患者提供科學(xué)依據(jù)。

8. 抗IL-6 受體抗體

IL-6 是感染時(shí)由多種免疫細(xì)胞釋放的一種重要的炎癥細(xì)胞因子。 鑒于嚴(yán)重COVID-19 患者體內(nèi)存在過度炎癥反應(yīng)、 淋巴細(xì)胞功能缺陷、 內(nèi)皮功能障礙、血栓栓塞形成等復(fù)雜的病理生理[19]，IL-6 途徑抑制劑已作為一種重要的生物標(biāo)志物驅(qū)動(dòng)免疫治療手段在COVID-19 大流行期間開展應(yīng)用， 并取得了較好的臨床療效[20-21]。 REMAP-CAP 試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IL-6 受體拮抗劑可提高COVID-19 患者6 個(gè)月生存率的獲益概率超過99.9%[22]。 總的來說，IL-6 受體拮抗劑對(duì)COVID-19 患者是一種很有吸引力的免疫治療策略， 但其是否能夠應(yīng)用于其他病原體如金黃色葡萄球菌等引起的膿毒癥感染有待進(jìn)一步研究。

9. 中醫(yī)藥治療

研究表明， 中藥制劑可通過抑制炎癥和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、 減少氧化應(yīng)激和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)來減輕膿毒癥引起的器官功能障礙[23]。一些中藥復(fù)方制劑，如血必凈、黃連解毒湯和參附注射液，已在膿毒癥導(dǎo)致的免疫失調(diào)方面顯示出療效。 現(xiàn)有研究顯示， 血必凈對(duì)膿毒癥具有糾正促炎/抗炎失衡、減少免疫細(xì)胞凋亡和改善凝血功能障礙等方面發(fā)揮作用， 且不良反應(yīng)少[24-25]。 最新一項(xiàng)大規(guī)模隨機(jī)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血必凈能夠降低膿毒癥患者28 d 的死亡率[26]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明， 黃連解毒湯在膿毒癥模型中表現(xiàn)出很強(qiáng)的保護(hù)作用[27]，這種作用主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞凋亡過程的負(fù)調(diào)控、對(duì)缺氧的反應(yīng)等生物學(xué)過程，為以后的臨床和基礎(chǔ)研究提供參考[28]。參附注射液可通過加強(qiáng)固有免疫延長(zhǎng)膿毒癥大鼠的存活時(shí)間，保護(hù)腸道黏膜[29]。在燒傷并發(fā)的膿毒癥患者中，參附注射液可有效提高患者的免疫力，改善臨床預(yù)后[30]。

四、免疫監(jiān)測(cè)和治療需要解決的問題和展望

首先， 膿毒癥免疫生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用仍存在著巨大的阻礙：（1）大多數(shù)免疫相關(guān)生物標(biāo)志物缺乏特異性， 不能反映膿毒癥免疫的全部動(dòng)態(tài)過程；（2） 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)等常用的生物標(biāo)記物缺少量化標(biāo)準(zhǔn)，無法指導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)治療以及啟動(dòng)和調(diào)整的時(shí)機(jī)；（3）免疫學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化；（4）常規(guī)臨床檢驗(yàn)室使用傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)、ELISA 和qPCR 等監(jiān)測(cè)膿毒癥，目前無法開展飛行時(shí)間細(xì)胞計(jì)數(shù)（CytoF）和單細(xì)胞RNA 測(cè)序（scRNA-seq）等技術(shù)，而這些多組學(xué)技術(shù)能夠更好地識(shí)別膿毒癥免疫抑制相關(guān)的免疫細(xì)胞簇和細(xì)胞狀態(tài)[31-32]。 基于現(xiàn)狀，聯(lián)合多個(gè)免疫相關(guān)參數(shù)指導(dǎo)膿毒癥免疫治療很有必要。 比如單核細(xì)胞/高密度脂蛋白膽固醇比值聯(lián)合中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值在預(yù)測(cè)膿毒癥患者死亡率方面比單一參數(shù)效果更好[33]；聯(lián)合血清鐵蛋白和HLA-DR/CD14 可以對(duì)膿毒癥免疫狀態(tài)進(jìn)行分層， 指導(dǎo)個(gè)性化輔助免疫治療[34]。另外，需要對(duì)膿毒癥患者免疫狀態(tài)進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)以便了解免疫抑制的進(jìn)展和疾病的嚴(yán)重程度，進(jìn)而指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后。

其次， 用于模擬膿毒癥免疫治療的動(dòng)物模型本身存在差異性， 動(dòng)物模型亦不能充分反映膿毒癥患者病理生理狀態(tài)。 年齡、 合并癥和同時(shí)進(jìn)行的支持性治療（包括機(jī)械通氣、激素或血管活性藥）等，因素均導(dǎo)致臨床應(yīng)用與人體實(shí)驗(yàn)的偏差，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

另外，目前免疫抑制患者越來越多，如惡性腫瘤尤其是血液系統(tǒng)惡性腫瘤接受放療或化療出現(xiàn)中性粒細(xì)胞減少患者、老年患者（≥60 歲）、長(zhǎng)期使用類固醇和免疫抑制劑者， 這些患者常處于免疫抑制狀態(tài)，主要是細(xì)胞免疫抑制，容易發(fā)生潛伏病毒（如巨細(xì)胞病毒）重新激活和機(jī)會(huì)病原體（如念珠菌）感染的巨大風(fēng)險(xiǎn)。 因此， 本身存在這些免疫抑制高危因素的膿毒癥患者更需要考慮免疫調(diào)節(jié)治療[5]。 然而，這樣的研究數(shù)據(jù)相對(duì)稀少， 有待今后開展更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究。

五、結(jié)語

膿毒癥引起復(fù)雜的免疫紊亂， 導(dǎo)致機(jī)體長(zhǎng)期處于免疫抑制、易感染狀態(tài)，甚至死亡。 盡管有較多的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究來闡述膿毒癥免疫治療的病理生理機(jī)制、有效性以及遠(yuǎn)期預(yù)后，但仍不清楚膿毒癥患者免疫治療的時(shí)機(jī)以及獲益/風(fēng)險(xiǎn)比。膿毒癥免疫治療成功的關(guān)鍵是確定哪些患者可能受益于哪種免疫治療， 并制定相應(yīng)個(gè)體化的免疫治療策略。 借助個(gè)性化的生物標(biāo)志物以指導(dǎo)和監(jiān)測(cè)對(duì)膿毒癥的療效，這將是未來的重大挑戰(zhàn)；因此，需根據(jù)個(gè)體的免疫狀態(tài)進(jìn)行分層，達(dá)到有效識(shí)別和精準(zhǔn)干預(yù)，制定目標(biāo)導(dǎo)向的個(gè)性化膿毒癥免疫治療方案以達(dá)到最佳的臨床療效， 將使免疫治療在未來有望成為一種有前景的治療策略。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突