限制性胎盤嵌合體的妊娠與分娩結(jié)局

張妙蓮, 李婳婳, 潘焯儀, 趙強

江門市中心醫(yī)院產(chǎn)科、婦產(chǎn)兒生殖醫(yī)學(xué)臨床轉(zhuǎn)化及應(yīng)用重點實驗室(廣東江門 529000)

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(non-invasive prenatal testing,NIPT)是近年發(fā)展最快的產(chǎn)前染色體疾病篩查手段,檢測的是母體血漿中的胎兒游離DNA,主要來源于胎盤,因此NIPT所檢測到的染色體異常可分為以下3種情況:(1)胎兒染色體及胎盤染色體均異常;(2)限制性胎盤嵌合體(CPM),即只有胎盤染色體異常,胎兒染色體正常;(3)真性胎兒嵌合體(TFM),即異常染色體只存在胎兒組織中,胎盤染色體正常。有部分研究認(rèn)為,CPM與流產(chǎn)、胎兒生長受限、宮內(nèi)死胎、孕高癥等相關(guān)[1-3]。對于胎兒染色體異常,已有大量病例數(shù)據(jù)及研究以預(yù)測胎兒預(yù)后情況。但對于CPM,目前國內(nèi)外關(guān)于胎兒妊娠結(jié)局的數(shù)據(jù)仍較少,對臨床遺傳咨詢造成困擾。以往研究一般是通過產(chǎn)前絨毛檢測意外發(fā)現(xiàn)的CPM,檢出率約為1.9%[4],但隨著NIPT在臨床上的廣泛應(yīng)用,越來越多的CPM被檢出。本研究回顧性分析CPM病例染色體檢測結(jié)果,結(jié)合妊娠年齡、妊娠期合并癥、胎兒出生后情況等病史資料,探討CPM與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 數(shù)據(jù)來源于2017年10月至2021年11月行NIPT結(jié)果提示異常,羊水染色體檢測結(jié)果與NIPT結(jié)果不一致的孕婦的胎盤組織樣本。剔除羊水染色體檢測結(jié)果異常、拒絕產(chǎn)前診斷、胎盤留取或檢測失敗樣本。剔除羊水染色體檢測結(jié)果異常、拒絕產(chǎn)前診斷、胎盤留取或檢測失敗樣本,共48例納入研究。

研究經(jīng)江門市中心醫(yī)院倫理審查(江心醫(yī)倫理審查[2023]42號)

1.2 方法

1.2.1 NIPT檢測 抽取孕婦外周血約10 mL,離心采集血漿后提取胎兒游離DNA,使用胎兒染色體非整倍體(2號三體1、18號三體、13號三體)檢測試劑盒,按照實驗室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行文庫制備,使用BGISEQ-500測序儀進(jìn)行測序及數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 染色體核型分析 抽取羊水20 mL或外周血3 mL,按照實驗操作規(guī)程進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)(羊水雙人雙線操作)、收獲、制片和G顯帶,使用全自動掃描儀分析系統(tǒng)掃描(德國蔡司),命名規(guī)則按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 CMA檢測 抽取羊水10 mL提取基因組DNA,排除母血污染后,按照實驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行片段化、PCR擴增、純化及標(biāo)記,使用Cytoscan 750k芯片(美國Affymetrix公司)進(jìn)行雜交。拷貝數(shù)目變異判讀規(guī)則按照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)和臨床基因組資源機構(gòu)(ClinGen)2019 年聯(lián)合發(fā)布的共識建議。命名規(guī)則按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 胎盤染色體組織二代測序檢測 新鮮胎盤沖洗干凈后在胎盤子面及母面上、中、下各取3個黃豆大小胎盤組織,提取基因組DNA后,使用華大基因檢測平臺的低深度全基因組測序(CNV-Seq)進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 羊水染色體檢測結(jié)果 根據(jù)產(chǎn)前診斷及胎盤染色體檢測結(jié)果,分為CPM組及對照組。CPM組樣本NIPT結(jié)果陽性,產(chǎn)前診斷染色體檢測結(jié)果為陰性,但胎盤染色體檢測結(jié)果提示染色體非整倍體。對照組為NIPT結(jié)果陽性,產(chǎn)前診斷及胎盤染色體檢測結(jié)果均為陰性。CPM組有21例,對照組有27例樣本納入研究。

48例羊水細(xì)胞核型分析均未檢出異常核型,CPM組21號樣本CMA檢出21q22.3區(qū)域存在1.69 Mb可能致病的缺失片段(表1),其余47例樣本均未發(fā)現(xiàn)致病性拷貝數(shù)目變異或覆蓋致病性印記基因的純合區(qū)域(ROH)。

表1 22例CPM染色體檢測及臨床資料

2.2 胎盤染色體檢測結(jié)果 CPM組21例樣本胎盤驗證結(jié)果均涉及染色體非整倍體,結(jié)果見表1,檢出13號染色體三體5例(24%),7號染色體三體4例(19%),X染色體單體3例(14%),2號染色體三體2例(9.5%),X合并21號染色體單體1例,8號染色體三體、12號染色體三體、15號染色體三體、16號染色體三體、18號染色體三體、2號染色體三體0及2號染色體三體1各有1例。

2.3 CPM組及對照組妊娠情況分析 對照組孕婦妊娠年齡21～43歲,平均(31.43±5.02)歲,CPM組孕婦預(yù)產(chǎn)期年齡24～42歲,平均為(31.71±5.18)歲。對照組高齡妊娠有6例(22.22%),CPM組有7例(33.33%)。對照組孕婦在妊娠期間發(fā)生合并癥的有5例(18.52%),1例子癇前期,2例為妊娠期糖尿病(GDM),1例妊娠期高血壓,1例妊娠期血小板減少合并水腫。CPM組孕婦妊娠期合并癥有6例(30.00%),4例GDM,1例重度子癇前期,1例血栓前狀態(tài)。

2.4 CPM組及對照組妊娠結(jié)局 對照組無流產(chǎn)、宮內(nèi)死胎或引產(chǎn),1例胎兒右腎輕度分離(7.2 mm),1例羊水偏少,其余25例胎兒超聲未見異常,27例新生兒順利分娩。分娩時孕周為31.3～40.9周,平均孕周為(38.71±2.0)周。CPM組1例胎兒超聲提示右手多指,3例提示羊水少,其中1例合并胎兒生長受限(FGR)。21號樣本因羊水細(xì)胞檢出21q22.3區(qū)域可能存在致病性缺失,孕婦堅決要求引產(chǎn),其余20例新生兒均順利分娩。CPM組分娩時孕周為35～41.3周,平均分娩孕周為(38.63±1.8)周(表2)。

表2 CPM組與對照組妊娠及新生兒出生情況分析

對照組新生兒出生體重1.25～3.68 kg,平均為(2.88±0.5)kg,平均出生體重Z-score為(-0.54±0.28)kg,小于胎齡兒(指出生體重<10%或<-2SD,SGA)有2例(7.41%),出生體重Z-Score分別為-3.01SD及-4.63SD。CPM組新生兒出生體重1.7～3.94 kg,平均為(2.88±0.5) kg,平均出生體重Z-score為(-0.48±0.36)kg,SGA有4例(20%)。4例SGA分別為16號染色體三體 1例(出生體重Z-Score: -2.61SD),13號染色體三體 1例(出生體重Z-Score: -3.29SD),嵌合X染色體單體2例(出生體重Z-Score分別為-2.79SD及-3.47SD)。

3 討論

染色體嵌合的發(fā)生是由于有絲分裂錯誤導(dǎo)致,體細(xì)胞有絲分裂染色體不分離,導(dǎo)致三體細(xì)胞及單體細(xì)胞的形成,但常染色體單體細(xì)胞會迅速凋亡,X單體細(xì)胞則一般能存活,三體細(xì)胞也可能在后續(xù)復(fù)制中丟失一條染色體而恢復(fù)成整倍體細(xì)胞[5]。胚胎組織分化發(fā)生于受精早期,囊胚一小部分細(xì)胞分化為胎兒,其他細(xì)胞則分化為胚胎外組織,如胎盤。因此,染色體有絲分裂錯誤發(fā)生的時間對異常細(xì)胞在胚胎的嵌合部位及嵌合比例影響重大。根據(jù)異常細(xì)胞嵌合的部位不同,可分為3種情況,即CPM、TFM及胎兒染色體及胎盤染色體均發(fā)生嵌合。

CPM根據(jù)異常染色體細(xì)胞的分布,分為3型。CPM Ⅰ型異常染色體細(xì)胞僅限于細(xì)胞滋養(yǎng)層,CPM Ⅱ型異常細(xì)胞局限于絨毛間質(zhì)核心,CPM Ⅲ型異常細(xì)胞同時分布在細(xì)胞滋養(yǎng)層及絨毛間質(zhì)層。根據(jù)細(xì)胞分布可以推測CPM Ⅰ及CPM Ⅲ會造成NIPT結(jié)果假陽性,Ⅱ型則不會干擾NIPT結(jié)果[6]。Grati等[7]在952例CPM中發(fā)現(xiàn)Ⅱ型CPM發(fā)生頻率最高,約46.73%,Ⅰ型及Ⅲ型分別占41.28%及11.97%。CPM Ⅰ及Ⅲ型三體細(xì)胞嵌合比例≥70%時,就有可能被NIPT檢出[7]。

因為只有Ⅰ型及Ⅲ型CPM才會對NIPT造成假陽性結(jié)果,本研究只納入Ⅰ型及Ⅲ型CPM作為研究對象。CPM中不同的異常染色體發(fā)生率差異大,有文獻(xiàn)報道在395例Ⅰ型及Ⅲ型CPM中,非整倍體發(fā)生率最高的依次為X染色體單體、7號染色體三體、13號染色體三體、3號染色體三體及2號染色體三體[6]。本研究CPM組中,發(fā)生率最高的為13號染色體三體、7號染色體三體、X染色體單體及2號染色體三體,共15例(68%)。

孕婦高齡是非整倍體配子形成的高危因素,且年齡越大,染色體異常配子的發(fā)生率越高[8-10],因此高齡也可能是形成CPM的潛在因素。但有多個研究發(fā)現(xiàn)CPM組與正常胎盤妊娠年齡無明顯差異[8-11],也有研究發(fā)現(xiàn)CPM Ⅲ組妊娠年齡更大[(39.7±2.6)歲vs. (37.1±3.2)歲][1]。本研究中CPM組與對照組妊娠年齡差異不大[(31.71±5.18)歲vs. (31.43±5.02)歲],但高齡妊娠比例CPM組要高于對照組(33.33%vs. 22.22%)。

胎盤在妊娠過程中發(fā)揮重要作用,一方面胎盤為胎兒提供發(fā)育所需的氧氣及營養(yǎng)物質(zhì),同時清除代謝廢物,另一方面胎盤有重要的內(nèi)分泌功能,使母體環(huán)境適應(yīng)胎兒的生長。CPM在臨床上并不罕見,CPM的胎盤功能是否會發(fā)生改變,從而導(dǎo)致妊娠狀態(tài)改變、胎兒發(fā)育異常及妊娠期合并癥等目前結(jié)論尚不明確。有研究觀察到CPM組妊高癥及CPM Ⅰ型組SGA發(fā)生率明顯高于對照組(10%vs. 2%、15%vs. 5%),而死胎、早產(chǎn)、先兆子癇和GDM的發(fā)生率則相似[1]。Tuohy等[12]報道分娩周數(shù)在正常胎盤與CPM (Ⅱ型+Ⅲ型)中差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但在單獨的Ⅲ型中分娩周數(shù)明顯小于正常胎盤組[(35.7±3.77)周vs. (39.0±2.14)周]。值得注意的是,不同染色體非整倍體的CPM不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率差別較大。多篇文獻(xiàn)報道16號染色體三體的胎兒及CPM與子癇前期密切相關(guān)[13-14],13號染色體三體胎兒的孕婦罹患妊娠高血壓疾病及子癇前期風(fēng)險比普通孕婦高2～20倍[15-17]。Spinillo等[18]總結(jié)多個研究的病例,發(fā)現(xiàn)CPM早產(chǎn)風(fēng)險及低出生體重兒(<2.5 kg)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但SGA發(fā)生率是對照組2.45倍,在16號染色體三體 CPM組SGA發(fā)生率是對照組11.64倍。Wolstenholme等[5]研究發(fā)現(xiàn)CPM組不良妊娠結(jié)局風(fēng)險不會增加,但出生低體重兒及出生高體重兒明顯增加。Eggenhuizen等[19]總結(jié)多篇文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),2、3、7、13、15、16 及22號染色體三體CPM與正常胎盤相比,發(fā)生FGR、早產(chǎn)、SGA風(fēng)險明顯增高。

本研究通過27例對照組及20例CPM組樣本發(fā)現(xiàn)(第21例樣本孕婦堅決要求引產(chǎn)),CPM組孕期未出現(xiàn)先兆流產(chǎn)、宮內(nèi)死胎,產(chǎn)程順利,新生兒Apgar評分均為10分。CPM組妊娠期合并癥主要是GDM,重度子癇前期在CPM組發(fā)現(xiàn)1例,為13號染色體三體 CPM。但CPM組妊娠期合并癥、胎兒超聲異常及SGA發(fā)生率均比對照組高,其中CPM組SGA發(fā)生率更是對照組的3.13倍(20%vs. 7.41%),分別為1例16號染色體三體、1例13號染色體三體及2例X染色體單體CPM。文獻(xiàn)[5]總結(jié)了80例CPM樣本,發(fā)現(xiàn)只有16號染色體三體 CPM及2號染色體三體 CPM各有1例宮內(nèi)死胎,其他染色體CPM均未發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在流產(chǎn)和宮內(nèi)死胎,FGR則在多種CPM中均能發(fā)現(xiàn),包括16號染色體三體、13號染色體三體、2號染色體三體、15號染色體三體、X染色體單體、7號染色體三體等,與本研究樣本的觀察結(jié)果基本相符。7號染色體三體在CPM中較常見,有部分胎兒可有SGA。本研究有4例7號染色體三體,均是嵌合體,嵌合比例在37%～65%,推測50%左右嵌合型7號染色體三體CPM對胎盤功能影響較小,故未觀察到SGA病例。與宮內(nèi)死胎、妊娠期子癇及SGA高度相關(guān)的16號染色體三體及13號染色體三體 CPM[20-21],本研究受限于樣本量,目前只能收集到1例16號染色體三體 CPM及13號染色體三體 CPM 5例。16號染色體三體 CPM孕期發(fā)現(xiàn)羊水少,無妊高癥,新生兒出生體重為2.25 kg(-2.61SD),與Grau Madsen等[17]報道的1例16號染色體三體CPM癥狀相同,該例同樣孕期羊水過少出生后發(fā)現(xiàn)SGA。涉及13號染色體三體的CPM有4例為嵌合型CPM,除1例發(fā)現(xiàn)GDM外,其余均未發(fā)現(xiàn)妊娠期合并癥及新生兒異常。1例為13號染色體三體 CPM,新生兒右手多指且出生體重為2.12 kg(-3.47SD),目前未檢索到關(guān)于13號染色體三體 CPM出現(xiàn)多指的文獻(xiàn)病例報道。有3例胎兒超聲顯示羊水少(1例16號染色體三體 CPM、1例18號染色體三體 CPM及1例X染色體單體CPM。多篇文獻(xiàn)報道,除了妊娠期高血壓和子癇前期外,羊水減少或增多也常見于CPM病例中[19]。吳小青[21]發(fā)現(xiàn)1例13號染色體三體 CPM胎兒不僅有FGR還合并有大腦中動脈血流異常、左心室偏小、主動脈狹窄、羊水過少,1例2號染色體三體 CPM胎兒重度FGR,1例9號染色體三體 CPM胎兒FGR合并臍動脈阻力增高、大腦中動脈阻力減低、羊水減少、腸管回聲增強?？梢?羊水少在CPM中較常見。此外,CPM胎兒也是多器官先天畸形的高危人群[22-23]。Eggenhuizen等[19]總結(jié)了多個文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)2號染色體三體、5號染色體三體、13號染色體三體及22號染色體三體等CPM均有胎兒畸形病例報道,癥狀有NT增厚、小頭畸形、搖椅足、脊柱畸形、FGR等,16號染色體三體 CPM胎兒畸形報道的病例最多,癥狀集中在單臍動脈、房室間隔缺損、NF增厚、顱面部畸形、尿道下裂。

文獻(xiàn)報道,在一些特殊的情況下,如異常細(xì)胞在不同組織嵌合比例差異大、三體及單體自救等,即使羊水穿刺染色體檢測,胎兒也可能由于低比例染色體非整倍體嵌合及單親二體(UPD)導(dǎo)致印記基因疾病或隱性基因遺傳病而發(fā)生先天性畸形[16]。本研究CPM組羊水均進(jìn)行CMA檢測,可以排除4例胎兒超聲異常是由于胎兒組織存在UPD導(dǎo)致的隱性遺傳病引起,但難以排除胎兒組織局部出現(xiàn)細(xì)胞非整倍體低比例嵌合而沒有被羊水樣本捕獲到或者沒有被CMA及核型分析檢測到。

本研究顯示CPM組妊娠期合并癥、胎兒超聲異常及SGA發(fā)生率均比對照組高,SGA發(fā)生率更是對照組的3倍。由于受限于樣本量因素,并未進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗。上述研究結(jié)果也提示了通過NIPT意外發(fā)現(xiàn)的CPM,特別是對于13號染色體三體、16號染色體三體及X染色體單體CPM,孕期需要密切監(jiān)測妊娠期間生化指標(biāo)的變化及胎兒B超,注意胎兒生長發(fā)育。

利益相關(guān)聲明:論文全體作者均知曉并同意論文投稿,并承諾無任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:全體作者均參與了論文形成的全程工作。通信作者趙強提出研究選題及指導(dǎo)論文撰寫,張妙蓮負(fù)責(zé)課題設(shè)計、論文撰寫、數(shù)據(jù)分析工作,李婳婳和潘焯儀參與數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理和分析。