哮喘患兒外周血炎癥因子及肺功能水平與TLR4基因多態(tài)性的相關(guān)性研究*

劉洋, 王爽, 李權(quán)倫, 張超

1十堰市婦幼保健院檢驗科(湖北十堰 442000); 2湖北醫(yī)藥學(xué)院臨床技能教學(xué)培訓(xùn)中心(湖北十堰 442002)

支氣管哮喘是涉及多種細胞和炎性因子參與的以氣道慢性炎癥為特征的異質(zhì)性疾病,這種慢性炎癥與氣道高反應(yīng)性相關(guān)[1-3]。據(jù)不完全統(tǒng)計我國兒童哮喘的患病率呈逐年升高的趨勢,哮喘不僅影響青少年兒童的發(fā)育和身體健康,而且影響兒童的心理健康,因此有效的預(yù)防和早期的診療,對減少兒童哮喘的發(fā)生具有重要意義[4-5]。研究顯示哮喘的發(fā)生、發(fā)展與多個基因和環(huán)境因素密切相關(guān)[6-8],Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是模式識別受體(PPRs)的一種,TLR具有單個的跨膜的蛋白,可識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP),是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子,也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[9-11],作為Toll樣受體家族成員之一的TLR4近年來受到研究者的廣泛關(guān)注。TLR4可識別細菌細胞壁中的脂多糖(LPS),并可調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡,影響體內(nèi)白細胞介素-4(IL-4)和γ干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)的水平[12-13],其與哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),但TLR4基因多態(tài)性與兒童哮喘及患兒病情預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)尚不明確,本研究旨在探索哮喘兒童外周血IL-4和IFN-γ水平及其與TLR4基因多態(tài)性的相關(guān)性,為兒童哮喘的診療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年4月至2022年10月收治的哮喘患兒172例為實驗組(男88例,女84例)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡6～14周歲;(2)符合兒童支氣管哮喘規(guī)范化診治建議(2020年版)[14]診斷標(biāo)準(zhǔn);(3)無心肺、肝臟、腎臟等器官的功能障礙;(4)無其他自身免疫缺陷癥疾病或者先天性疾病。并根據(jù)患兒哮喘的嚴重程度,將實驗組分為輕度(34例)、中度(35例)、重度(45例)和危重(58例),診斷依據(jù)見表1。選擇同期在醫(yī)院兒童保健科門診體檢兒童136例作為對照組,研究對象均為漢族人群。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審查(十堰婦幼-倫理-20190204),所有受試者均簽署知情同意書。

表1 ≥6歲兒童哮喘急性發(fā)作嚴重度分級

1.2 試劑及材料 IL-4、IFN-γ測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,DNA提取試劑盒及PCR試劑盒購自購自寶生物工程(大連) 有限公司,低溫離心肌購自Thermo Scientific公司,PCR儀購自公司,DYY-6C電泳儀購自北京六一儀器廠,引物設(shè)計及合成購自上海生工生物工程公司,凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司,血細胞分析儀為深圳邁瑞公司,NO分析儀購自江蘇無錫尚沃公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的采集及處理 收集納入患者的年齡、性別等一般資料,于患者入院24 h內(nèi)采集患者外周血3 mL于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-2K)真空抗凝管,混勻,離心(3 000 r/min)10 min,分離血漿和細胞,-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 IL-4、IFN-γ、外周血嗜酸性粒細胞百分率(Eos)、IgE水平的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血漿中的IL-4、IFN-γ水平,測定方法嚴格按照碧云天公司產(chǎn)品試劑盒說明書進行操作,利用血細胞分析儀測定Eos,利用化學(xué)發(fā)光發(fā)檢測血清總IgE。

1.3.3 肺功能指標(biāo)第1秒用力呼氣容積(FEV1)占用力肺活量(FVC)百分比(FEV1/FVC %)和呼出氣一氧化氮(FeNO)的測定 肺功能檢查過程中,受試者需要夾住鼻腔,用嘴呼吸,測試過程中按照醫(yī)生的口令,深呼吸,然后用盡全力呼氣,FEV1/FVC %=第1秒呼出氣體量/最大呼氣量×100%,利用便攜式NO分析儀,指導(dǎo)受試者進行FeNO測定,共測定3次,取最佳值。

1.3.4 TLR4基因多態(tài)性的檢測 按照DNA快速抽提試劑盒說明進行操作,快速抽提全血基因組DNA,NanoDrop分光光度計檢測提取樣本的吸光度值,A260/A280介于1.6～1.8,將提取的樣本DNA于-80℃低溫冰箱保存,采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RELP)技術(shù)對TLR4基因多態(tài)性的檢測分析,上下游引物見表2。PCR擴增條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)30次,之后72℃延伸 5 min。PCR擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶進行酶切,酶切產(chǎn)物在3.5%的瓊脂糖凝膠上電泳,然后通過Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果,判斷樣本的基因型。

表2 TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile上下游引物

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料比較 對照組、實驗組在性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 各組間一般資料比較

2.2 對照組和實驗組哮喘患兒臨床相關(guān)指標(biāo)比較 實驗組患兒外周血中IL-4、Eos、IgE的水平、FeNO水平顯著高于對照組,而IFN-γ水平顯著低于對照組;肺功能指標(biāo)FEV1/FVC%顯著低于對照組(均P<0.05),見表4。

表4 兩組哮喘患兒臨床相關(guān)指標(biāo)比較

2.3 TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile位點單核苷酸多態(tài)性Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗 TLR9基因Asp299Gly、Thr399Ile位點的SNPs的預(yù)期基因型頻率處于哈迪-溫伯格平衡(HWE;P>0.05),樣本具有群體代表性;實驗組與對照組TLR4基因多態(tài)性位點Asp299Gly的基因型和等位基因分布相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),Thr399Ile的基因型和等位基因分布相比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中實驗組T等位基因分布頻率顯著高于對照組(P<0.05),見表5、6。TLR4基因Thr399Ile位點PCR-RFLP電泳圖譜(29 bp條帶在瓊脂糖凝膠電泳中未能顯示出),見圖1。

注:Lane1、Lane4為CC基因型(406 bp);Lane2為CT基因型(406 bp、377 bp、29 bp);Lane3、Lane5為TT基因型(377 bp、29 bp)。29 bp條帶在瓊脂糖凝膠電泳中未能顯示出

表5 各組Asp299Gly基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗及分布頻率比較

表6 各組Thr399Ile基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗及分布頻率比較

2.4 TLR4基因Thr399Ile多態(tài)性和哮喘患兒臨床相關(guān)指標(biāo)比較 TLR4基因Thr399Ile多態(tài)性與哮喘患兒外周血Eos、IgE的水平、肺功能指標(biāo)FEV1/FVC%無相關(guān)性(P>0.05)。但攜帶Thr399Ile TT基因型哮喘患兒的IL-4和FeNO水平比高于CC和CT基因型,IFN-γ水平顯著低于CC和CT基因型(P<0.05),見表7。

表7 TLR4基因Thr399Ile多態(tài)性和兒童哮喘臨床相關(guān)指標(biāo)比較

2.5 TLR4基因Thr399Ile多態(tài)性和患兒哮喘嚴重程度比較 有序logistic回歸分析顯示攜帶Thr399Ile TT基因型哮喘患兒比攜帶CC和CT基因型者哮喘發(fā)病程度更嚴重(Wald2=11.898,P=0.001),見表8。

表8 TLR4基因Thr399Ile多態(tài)性和患兒哮喘嚴重程度比較 例(%)

2.6 二元logistic回歸分析TLR4基因Thr399Ile位點的單倍體基因型與兒童哮喘的相關(guān)性 共顯性模型中,TT基因型人群是CC基因型人群患病風(fēng)險的2.353倍(OR=2.353,P<0.05);顯性模型中,CT+TT基因型人群是CC基因型人群患病風(fēng)險的1.962倍(OR=1.962,P<0.05);隱形模型中,TT基因型人群是CT+CC基因型人群患病風(fēng)險1.875倍(OR=1.875,P<0.05)。TLR4基因Thr399Ile位點的基因多態(tài)性與兒童哮喘存在相關(guān)性,TT基因型是兒童哮喘的獨立危險因素。見表9。

表9 二元logistic回歸分析TLR4基因Thr399Ile位點與兒童哮喘的關(guān)系 例

3 討論

哮喘是兒童比較常見的疾病之一,主要與遺傳和環(huán)境因素相關(guān),目前雖然關(guān)于哮喘的分子機制研究已有很多,但是因其復(fù)雜的致病因素和發(fā)病機制,目前尚未明確。本課題研究旨在探索哮喘兒童外周血IL-4和IFN-γ水平及其與Toll樣受體4基因多態(tài)性的相關(guān)性,為兒童哮喘的診療提供新的思路。

國內(nèi)外研究表明[15-16]哮喘患兒體內(nèi)的細胞因子和免疫細胞水平異常,外周血中IL-4主要由Th2淋巴細胞釋放,IFN-γ主要由Th1淋巴細胞釋放,機體內(nèi)的Th1/Th2比例失衡導(dǎo)致2型炎癥。TLR是模式識別受體(PPRs)的一種,TLR具有單個的跨膜的蛋白,可識別PAMP,是參與天然免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子。該基因編碼的蛋白質(zhì)是TLR家族的成員,該家族在病原體識別和先天免疫激活中起著基本作用。TLR是高度保守的,并具有結(jié)構(gòu)和功能上的相似性。它們識別在傳染原上表達的PAMP,并介導(dǎo)有效免疫力發(fā)展所必需的細胞因子的產(chǎn)生。作為Toll樣受體家族成員之一的TLR4近年來受到研究者的廣泛關(guān)注,有研究表明[17-18],TLR4途徑可觸發(fā)核因子-κB(NF-κB)信號通路的活化,影響基因表達的調(diào)控,進而影響機體的炎癥因子和免疫細胞水平。

本研究選取172例符合納入標(biāo)準(zhǔn)的哮喘患兒進行分析,研究結(jié)果顯示,哮喘患兒外周血中IL-4水平升高,IFN-γ水平降低,而IL-4主要由Th2淋巴細胞釋放,IFN-γ主要由Th1淋巴細胞釋放,說明哮喘患兒機體內(nèi)的Th1 /Th2比例失衡導(dǎo)致2型炎癥。此外,哮喘患兒肺功能指標(biāo)FEV1/FVC%顯著低于對照組,FeNO水平比顯著高于對照組,FeNO是氣道上皮細胞及炎癥細胞的一氧化氮合酶催化L-精氨酸產(chǎn)生的,當(dāng)氣道受外界刺激誘發(fā)2型炎癥時,可導(dǎo)致氣道上皮細胞中一氧化氮合酶表達增多,從而催化L -精氨酸產(chǎn)生更多的NO,是目前被廣泛認可的氣道2型炎癥的分子標(biāo)志物,其不僅能反映氣道炎癥水平,還能預(yù)測評估抗炎效果,其檢測具有無創(chuàng)簡便的優(yōu)點,在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用[19]。通過進一步研究發(fā)現(xiàn),TLR4基因Thr399Ile多態(tài)性與哮喘患兒外周血Eos、IgE水平、肺功能指標(biāo)FEV1/FVC%無相關(guān)性,但攜帶Thr399Ile TT基因型哮喘患兒的IL-4和FeNO水平比高于CC和CT基因型,IFN-γ水平顯著低于CC和CT基因型,且TT基因型的哮喘患兒比CC和CT基因型者哮喘發(fā)病程度更嚴重,表明炎癥反應(yīng)在兒童哮喘的進展中有著重要的作用,TLR4基因、IL-4、IFN-γ可能是哮喘輕癥進展成重癥的關(guān)鍵因子,FeNO水平比可預(yù)測哮喘的嚴重程度。從基因水平檢測發(fā)現(xiàn),TLR4基因多態(tài)性位點Asp299Gly的基因型和等位基因分布差異不明顯,Thr399Ile的基因型和等位基因分布存在顯著差異,其中實驗組T等位基因分布頻率顯著高于對照組,二元logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)TLR4基因Thr399Ile位點的基因多態(tài)性與兒童哮喘存在相關(guān)性,TT基因型是兒童哮喘的獨立危險因素。但本研究納入樣本量較小,且并未進行多因素的分層分析,因此后續(xù)我們還需進一步擴大樣本量,同時進一步探索不同因素對TLR4基因多態(tài)性與兒童哮喘相關(guān)性的影響。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)TLR4 基因多態(tài)性與哮喘患兒體內(nèi)免疫球蛋白IgE、Eos、肺功能指標(biāo)FEV1/FVC%水平無關(guān),但與哮喘嚴重程度及IL-4、IFN-γ、FeNO水平比相關(guān),TLR4、IL-4、IFN-γ參與兒童哮喘的過程,并可能是哮喘由輕癥進展成重癥的關(guān)鍵因子,同時TLR4基因Thr399Ile位點多態(tài)性與兒童哮喘存在較大關(guān)聯(lián)。

利益相關(guān)聲明:本論文所有作者聲明不涉及利益沖突。

作者貢獻說明:劉洋為本研究的主要實施和貢獻者,王爽和李權(quán)倫為本研究的參與者,張超為通信作者,參與論文的指導(dǎo)修改潤色。