紅景天苷介導(dǎo)p38 MAPK信號(hào)通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡及氧化損傷*

王明燕, 宣清清, 許玲

諸暨市中醫(yī)醫(yī)院 1中藥房, 2臨床藥學(xué)室(浙江諸暨 311800)

心血管疾病主要是指與循環(huán)系統(tǒng)有關(guān)的一系列疾病,有著高發(fā)病率和高病死率的特點(diǎn),是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一[1]。心力衰竭是一種多因素的全身性疾病,目前抗心力衰竭的藥物很多,常規(guī)使用的有4類,但均有一定的不良反應(yīng)。為此,尋找新的治療藥物是目前研究的熱點(diǎn)之一。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為心力衰竭總病機(jī)是“氣虛血瘀水停”,心力衰竭治療總原則應(yīng)以益氣活血利水為法[2]。紅景天苷是藏藥紅景天的主要活性成分,其藥理活性已引起廣泛的研究關(guān)注[3]。氧化應(yīng)激和炎癥作為心力衰竭綜合征的關(guān)鍵病理生理因素和心力衰竭進(jìn)展的潛在因素引起了人們的關(guān)注。細(xì)胞焦亡是一種程序性細(xì)胞死亡,表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放進(jìn)而激活強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[4],多種心血管疾病中已發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞焦亡現(xiàn)象,核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體的激活與此密切相關(guān)。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)是一種介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥等的信號(hào)通路,可被促炎因子、應(yīng)激刺激及細(xì)菌內(nèi)毒素等激活,從而導(dǎo)致心肌損傷的發(fā)生,而抑制p38 MAPK的活化則可一定程度上緩解心肌損傷[5]。但紅景天苷是否能通過p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)心肌細(xì)胞的焦亡和氧化損傷進(jìn)行調(diào)節(jié)尚未可知。脂多糖(LPS)可刺激許多促炎標(biāo)記物,從而觸發(fā)多種免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)[6],由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的炎癥途徑也會(huì)受到LPS的刺激[7]?；诖?2022年2—12月本研究通過體外培養(yǎng)H9C2細(xì)胞,探討紅景天苷干預(yù)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡及氧化損傷的影響以及對(duì)p38 MAPK信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)購自河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心。

1.2 藥品與試劑 紅景天苷(純度≥98%)、LPS(純度≥98%)、p38 MAPK通路抑制劑SB203580(純度≥98%)、p38 MAPK通路激活劑C16-PAF(純度≥98%)(上海源葉生物科技有限公司),DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司),活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)(南京諾唯贊有限公司),酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(杭州主諾生物技術(shù)有限公司),RIPA裂解液(上海生工生物工程股份有限公司),BCA蛋白試劑盒(英國Abcam公司),鼠抗人[細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-1、Gasdermin-D(GSDMD)、炎性小體(NLRP3)、p38 MAPK和p-p38 MAPK及β-actin一抗]、辣根過氧化物酶堿性磷酸酯酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(二抗)(英國Abcam公司)。

1.3 儀器 XSP-BM-13C型倒置熒光顯微鏡購自青島明博環(huán)?？萍加邢薰?BPN-40RHP型二氧化碳培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器(美國ABI公司);酶標(biāo)儀(MultiskanAscent,美國Thermo公司);DYCZ-24KF型四板垂直蛋白電泳儀(北京六一生物科技有限公司)等。

1.4 方法

1.4.1 H9C2細(xì)胞培養(yǎng) 心肌細(xì)胞株H9C2接種于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中,并置于5% CO2、37℃、70%～80%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔2～3 d更換1次培養(yǎng)液,待細(xì)胞貼壁后生長密度達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代選取對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 分組與干預(yù) 將心肌細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS組、LPS+10、20、40、80 μmol/L紅景天苷組,對(duì)照組細(xì)胞不做干預(yù),LPS組以1 μg/mL LPS刺激24 h構(gòu)建體外炎癥模型[8];LPS+10、20、40、80 μmol/L紅景天苷組在LPS組的基礎(chǔ)上加入10、20、40、80 μmol/L紅景天苷;ELISA和CCK-8法檢測出最佳紅景天苷濃度后,又分組:對(duì)照組、LPS組、LPS+20 μmol/L紅景天苷組、SB203580組、LPS+20 μmol/L紅景天苷+SB203580組和LPS+20 μmol/L紅景天苷+C16-PAF組。SB203580組加入1 μg/mL LPS+1 μmol/L SB203580;LPS+20 μmol/L紅景天苷+SB203580組在LPS組的基礎(chǔ)上,加入20 μmol/L紅景天苷,同時(shí)加入1 μmol/L SB203580;LPS+20 μmol/L紅景天苷+C16-PAF組在LPS組的基礎(chǔ)上,加入20 μmol/L紅景天苷,同時(shí)加入10 μmol/L C16-PAF。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.5 測定指標(biāo)

1.5.1 ELISA法測定H9C2細(xì)胞因子表達(dá)情況 細(xì)胞分組方法同2.2,干預(yù)24 h的細(xì)胞,取各組細(xì)胞上清液,分別遵循白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)ELISA試劑盒說明書操作步驟,測定細(xì)胞炎癥因子IL-6、TNF-α、MDA和SOD的表達(dá)水平。

1.5.2 CCK-8法測定H9C2細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種在96孔板中,每孔接種細(xì)胞懸液100 μL(含8 000個(gè)細(xì)胞),藥物干預(yù)24 h后,每孔補(bǔ)加10 μL CCK-8溶液培養(yǎng),2 h后使用酶標(biāo)儀測450 nm處各孔的吸光度值(OD),計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=(LPS組或LPS+10、20、40、80 μmol/L紅景天苷組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)測定H9C2細(xì)胞中Cyclin D1和Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量 干預(yù)24 h的細(xì)胞,用Trizol試劑進(jìn)行裂解和總RNA提取操作,具體步驟按照說明書進(jìn)行;利用超微量分光光度計(jì)法檢測提取RNA樣品的濃度及純度,取1 μg作為模板在1st cDNA合成試劑盒的幫助下由PCR儀合成模板鏈cDNA;然后取2 μL cDNA在SYBR qPCR MasterMix、特殊引物對(duì)的幫助下由RT-qPCR儀進(jìn)行cDNA擴(kuò)增和檢測。每個(gè)樣品設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。以GAPDH作為內(nèi)參基因,相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt法計(jì)算。引物序列見表1。

表1 Cyclin D1和Caspase-3 RT-qPCR引物序列

1.5.4 蛋白免疫印跡(WB)法檢測H9C2細(xì)胞中增殖、凋亡、焦亡與p38 MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 細(xì)胞分組同2.2,干預(yù)24 h時(shí),收集各組細(xì)胞,提取蛋白定量后上樣,跑膠后轉(zhuǎn)膜,封閉2 h后參照抗體說明書加入一定稀釋比例的一抗(p38 MAPK、p-p38 MAPK、Caspase-3、Cyclin D1、Caspase-1、GSDMD、NLRP3及β-actin),4℃孵育過夜,次日TBST洗滌后加入山羊抗鼠IgG二抗,孵育2 h,洗滌3次,最后加入顯影液,在凝膠成像系統(tǒng)中對(duì)膜進(jìn)行拍照,蛋白條帶的灰度值用Image-J圖像分析軟件進(jìn)行分析,并以β-actin為內(nèi)參蛋白,計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)大鼠心肌H9C2細(xì)胞損傷模型的建立 ELISA結(jié)果見表2。與對(duì)照組相比,LPS組細(xì)胞炎癥因子IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,加入紅景天苷處理后,除LPS+10 μmol/L紅景天苷組的IL-6和TNF-α含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05),LPS+20、40、80 μmol/L紅景天苷組IL-6和TNF-α含量均顯著性降低(P<0.05)。

表2 各組H9C2細(xì)胞活力及IL-6、TNF-α表達(dá)水平比較

2.2 紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞活力的影響 使用CCK-8法檢測紅景天苷對(duì)H9C2細(xì)胞活力的影響(表2),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干預(yù)24 h時(shí),與對(duì)照組比較,LPS組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05);與LPS組相比,LPS+20 μmol/L紅景天苷組細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05),其余組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),為排除細(xì)胞活力對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響,所以選擇與LPS組有顯著差異且有較好抑炎效果的LPS+20 μmol/L紅景天苷組加入p38 MAPK信號(hào)通路抑制劑SB203580和通路激活劑C16-PAF進(jìn)行p38 MAPK通路驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.3 紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞氧化損傷的影響 干預(yù)24 h后,與對(duì)照組相比,LPS組細(xì)胞SOD含量顯著降低(P<0.05),MDA含量顯著升高(P<0.05)。與LPS組比較,LPS+20 μmol/L紅景天苷組和SB203580組細(xì)胞SOD含量顯著升高(P<0.05),MDA含量顯著降低(P<0.05)。與LPS+20 μmol/L紅景天苷組相比,LPS+20 μmol/L紅景天苷+SB203580組細(xì)胞SOD含量顯著升高(P<0.05),MDA含量顯著降低(P<0.05),LPS+20 μmol/L紅景天苷+C16-PAF組MDA含量顯著升高(P<0.05),SOD含量顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組SOD與MDA水平比較

2.4 紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞Cyclin D1和Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 對(duì)增殖凋亡相關(guān)基因Cyclin D1和Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測,結(jié)果見圖1、表4。與對(duì)照組相比,LPS組Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低,而Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與LPS組相比,LPS+20 μmol/L紅景天苷組和SB203580組Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高,而Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與LPS+20 μmol/L紅景天苷組相比,LPS+20 μmol/L紅景天苷+SB203580組Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高,而Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),而LPS+20 μmol/L紅景天苷+C16-PAF組Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低,Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

注:A:對(duì)照組;B:LPS組;C:LPS+20 μmol/L紅景天苷組;D:SB203580組;E:LPS+20 μmol/L紅景天苷+SB203580組;F:LPS+20 μmol/L紅景天苷+C16-PAF組

表4 紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.5 紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 對(duì)焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1、GSDMD和NLRP3蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測,結(jié)果見圖2、表5。與對(duì)照組相比,LPS組Caspase-1、GSDMD和NLRP3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,LPS+20 μmol/L紅景天苷組和SB203580組Caspase-1、GSDMD和NLRP3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與LPS+20 μmol/L紅景天苷組相比,LPS+20 μmol/L紅景天苷+SB203580組Caspase-1、GSDMD和NLRP3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),LPS+20 μmol/L紅景天苷+C16-PAF組Caspase-1、GSDMD和NLRP3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

注:A:對(duì)照組;B:LPS組;C:LPS+20 μmol/L紅景天苷組;D:SB203580組;E:LPS+20 μmol/L紅景天苷+SB203580組;F:LPS+20 μmol/L紅景天苷+C16-PAF組

表5 紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.6 紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞p38 MAPK通路活化的影響 為了確定紅景天苷對(duì)p38 MAPK信號(hào)通路活化狀態(tài)的影響,本研究檢測了該通路的關(guān)鍵性蛋白p38 MAPK和p-p38 MAPK的表達(dá)水平見表6、圖3。蛋白定量分析結(jié)果顯示,各組之間p38 MAPK蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組相比,LPS組p-p38 MAPK表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,LPS+20 μmol/L紅景天苷組和SB203580組p-p38 MAPK表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與LPS+20 μmol/L紅景天苷組相比,LPS+20 μmol/L紅景天苷+SB203580組p-p38 MAPK表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),LPS+20 μmol/L紅景天苷+C16-PAF組p-p38 MAPK表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

注:A:對(duì)照組;B:LPS組;C:LPS+20 μmol/L紅景天苷組;D:SB203580組;E:LPS+20 μmol/L紅景天苷+SB203580組;F:LPS+20 μmol/L紅景天苷+C16-PAF組

表6 紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞p38 MAPK通路活化的影響

3 討論

心力衰竭是常見的心血管疾病,目前抗心力衰竭的藥物很多,但該病仍不能被治愈,患者生活質(zhì)量和壽命未有顯著提升,國家醫(yī)療支出不斷在增加,給患者家庭和社會(huì)造成了巨大的負(fù)擔(dān)及經(jīng)濟(jì)壓力[8]。為此,尋找新的治療藥物尤為重要。近年來,中醫(yī)領(lǐng)域在心力衰竭的防治領(lǐng)域有深入的研究,中醫(yī)學(xué)將心力衰竭歸為“痰飲”“怔忡”“水腫”“喘證”等范疇。紅景天苷作為中藥紅景天的主要有效成分之一,具有活血化瘀、扶正固本、通脈止痛的功效,特別是在心血管系統(tǒng)方面,紅景天苷可減弱心臟缺血/再灌注損傷,增加心肌存活率,減少心肌凋亡[9]。萬云茹[10]研究表明,紅景天苷可通過誘導(dǎo)抗凋亡蛋白的表達(dá),抑制促凋亡蛋白水平,進(jìn)而抑制心力衰竭,起到心臟保護(hù)作用。譚洪玲等[11]分析了紅景天苷對(duì)心肌缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用,發(fā)現(xiàn)紅景天苷增加了缺氧/復(fù)氧損傷下心肌細(xì)胞的活力,對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。以上研究表明,紅景天苷對(duì)心肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,LPS誘導(dǎo)大鼠心肌H9C2細(xì)胞后炎癥因子IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著升高,細(xì)胞活力顯著降低,提示LPS誘導(dǎo)大鼠心肌損傷細(xì)胞模型構(gòu)建成功。與LPS組相比,加入20、40和80 μmol/L紅景天苷后IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著降低,LPS+20 μmol/L紅景天苷組細(xì)胞活力顯著升高,說明20 μmol/L紅景天苷可以抑制LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥,提高細(xì)胞的活力,因此選擇20 μmol/L紅景天苷進(jìn)行后續(xù)通路驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

由Gasdermin蛋白介導(dǎo)的促炎性細(xì)胞死亡稱為細(xì)胞焦亡,其中以NLRP3炎癥小體最受關(guān)注。NLRP3炎癥小體廣泛分布于免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞中,由凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)、NLRP3受體和pro-caspase-1組成,參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡與心血管疾病相關(guān)的心肌損傷中發(fā)揮重要角色,且氧自由基(ROS)增多、離子穩(wěn)態(tài)失衡等都會(huì)誘導(dǎo)心臟炎癥反應(yīng)[12]。干預(yù)NLRP3炎癥小體是許多中藥發(fā)揮心血管保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn),參葵通脈顆粒能降低心臟組織中IL-1β、Caspase-1的蛋白水平,通過調(diào)控心肌細(xì)胞焦亡,顯著改善慢性心力衰竭大鼠模型心功能[13]。此外,紅景天苷也被發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控腺苷酸活化蛋白激酶-雷帕霉素靶蛋白(AMPK-mTOR)途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬,保護(hù)其免受氧化應(yīng)激引發(fā)的凋亡[14]。Xing等[15]發(fā)現(xiàn),紅景天苷可通過抑制NLRP3炎癥小體活性,減輕Caspase-1介導(dǎo)的GSDMD剪切作用,從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡,發(fā)揮改善動(dòng)脈粥樣硬化的作用。而紅景天苷對(duì)心肌細(xì)胞的焦亡及氧化應(yīng)激損傷是否起到一定的保護(hù)作用尚未可知。本研究結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷后,MDA含量、焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1、GSDMD和NLRP3表達(dá)均顯著升高,而SOD含量顯著降低;與LPS組相比,LPS+20紅景天苷組和SB203580組的MDA含量、Caspase-1、GSDMD、NLRP3蛋白表達(dá)顯著降低,SOD含量顯著升高,提示紅景天苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞的氧化應(yīng)激、焦亡有保護(hù)作用,并且可能與p38 MAPK信號(hào)通路有關(guān)。有研究表明,MAPK在損傷的心肌細(xì)胞中被激活,是心肌損傷的主要調(diào)節(jié)劑[16]。其中,p38 MAPK可以由ROS激活,它可以導(dǎo)致線粒體內(nèi)ROS水平升高,造成線粒體損傷[17]。有報(bào)道指出,抑制p38 MAPK信號(hào)通路激活可緩解I/R所致的小鼠心肌損傷[18]。但紅景天苷是否通過p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)心肌細(xì)胞焦亡和氧化應(yīng)激起保護(hù)作用尚未可知。本研究結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷后,細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及蛋白Caspase-3表達(dá)顯著升高,而增殖相關(guān)基因及蛋白CyclinD1的表達(dá)顯著降低;與LPS組相比,LPS+20紅景天苷組和SB203580組的Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)顯著降低,CyclinD1蛋白表達(dá)顯著升高,提示紅景天苷對(duì)心肌H9C2的增殖、凋亡的作用機(jī)制可能與p38 MAPK信號(hào)通路有關(guān);與LPS+20 μmol/L紅景天苷組相比,LPS+20 μmol/L紅景天苷+SB203580組的Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)、Caspase-1、GSDMD、NLRP3和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)顯著降低,CyclinD1蛋白表達(dá)顯著升高,而LPS+20 μmol/L紅景天苷+C16-PAF組則顯著扭轉(zhuǎn)了上述指標(biāo),表明紅景天苷可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞增殖,抑制其凋亡、焦亡并對(duì)氧化應(yīng)激損傷有一定的保護(hù)作用,可能是通過負(fù)調(diào)控p38 MAPK信號(hào)通路發(fā)揮作用。

綜上所述,紅景天苷可促進(jìn)大鼠心肌H9C2細(xì)胞增殖、抑制凋亡和焦亡,對(duì)氧化應(yīng)激損傷有一定保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與負(fù)調(diào)控p38 MAPK信號(hào)通路有關(guān),能夠?yàn)榧t景天苷通過調(diào)控p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)心力衰竭的治療提供理論支持。但不足的是,紅景天苷在心力衰竭中是否存在其他信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制等,仍需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

利益相關(guān)聲明:文章所有作者無利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:王明燕負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及論文審核修改;宣清清負(fù)責(zé)細(xì)胞處理及實(shí)驗(yàn);許玲負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)整理與論文撰寫。