2019—2020年桂林市食源性沙門菌耐藥分析及PFGE分型研究

王春旭,王彥文,黃輝,唐勇,鄧潔妤,賀漓漓

(廣西桂林市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科,廣西桂林 541001)

沙門菌作為導(dǎo)致食源性疾病的重要致病菌之一,廣泛分布于自然界,因易污染食品、水等外環(huán)境以及存在于一些帶菌的禽畜類動(dòng)物中,通過食物鏈傳遞給人類,危害公共衛(wèi)生健康[1-2]。我國(guó)每年約有上億人因感染沙門菌而患病,占食源性疾病致病菌首位[3-5]。桂林市歷年食源性風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)中也以沙門菌檢出為最多[6-7]。為了進(jìn)一步揭示桂林市沙門氏菌的血清型分布及其耐藥性和基因型,桂林市疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室對(duì)2019年檢出的32株沙門氏菌和2020年檢出的37株沙門氏菌進(jìn)行了血清型的鑒定和菌株的耐藥性分析,同時(shí)采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳法(PFGE)對(duì)其進(jìn)行分子分型研究。

1 材料與方法

1.1 材料所分析的沙門菌菌株來自2019年收集的32株(其中21株為桂林市食源性致病菌監(jiān)測(cè)的分離株,11株為同年腹瀉患者檢出菌株)和2020年收集的37株(其中21株為桂林市食源性致病菌監(jiān)測(cè)的分離株,16株為同年腹瀉患者檢出菌株);所有菌株均經(jīng)由廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)核和血清學(xué)分型鑒定。血清型的質(zhì)控菌株為鼠傷寒沙門菌ATCC14028(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心提供),藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心提供),脈沖場(chǎng)凝膠電泳使用的分子量標(biāo)準(zhǔn)菌株為沙門菌H9812(廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心提供)。

1.2 儀器及試劑全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(法國(guó)生物梅里埃公司);全自動(dòng)藥敏試驗(yàn)菌液接種判讀儀(Thermo賽默飛世爾);CHEF Mapper XA脈沖場(chǎng)電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司);Gel Doc XR+全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。沙門菌顯色培養(yǎng)基(法國(guó)科瑪嘉CHROMagar,生產(chǎn)批號(hào)P002060);誘導(dǎo)培養(yǎng)基(法國(guó)科瑪嘉CHROMagar,生產(chǎn)批號(hào)20201201);沙門菌診斷血清(丹麥SSI公司,生產(chǎn)批號(hào)20200701);革蘭陰性需氧菌藥敏檢測(cè)板(中國(guó)上海星佰生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)批號(hào)102012);蛋白酶K(德國(guó)Merck公司,生產(chǎn)批號(hào)VL558866);GelRed染液(美國(guó)Biotium公司,生產(chǎn)批號(hào)19G0326);Seakem Gold瓊脂糖(美國(guó)Cambrex公司,生產(chǎn)批號(hào)0000990000);Xba I限制性內(nèi)切酶(NEW England公司,生產(chǎn)批號(hào)AL12042A)。

1.3 方法

1.3.1 食源性疾病病例信息與相關(guān)樣本采集對(duì)于食源性疾病病例個(gè)案信息按照《2019年國(guó)家食品污染物和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》[8]收集,同時(shí)采集患者的新鮮糞便或肛拭子標(biāo)本進(jìn)行沙門菌檢驗(yàn),對(duì)陽性的沙門菌分離株再進(jìn)行PFGE分子分型分析和藥敏試驗(yàn)。

1.3.2 食品樣品的采集與檢驗(yàn)食品樣品參照 《國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》進(jìn)行采集,并參照GB 4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門菌檢驗(yàn)》[9]鑒定沙門菌,同時(shí)依據(jù)White-Kauffmann-LeMinor抗原表[10]判定其血清型。

1.3.3 藥物敏感試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)參照標(biāo)準(zhǔn)為2020年的CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)標(biāo)準(zhǔn)[11],折點(diǎn)判斷(S：敏感;I：中介;R：耐藥)。多重耐藥(multi drug resistance,MDR)定義：至少同時(shí)耐3種和(或)以上的不同類型抗生素菌株。

1.3.4 沙門菌分子分型根據(jù)國(guó)家食源性疾病溯源網(wǎng)絡(luò)(TraNet China)沙門菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)化分型方法進(jìn)行沙門菌分子分型,具體方法為：待測(cè)沙門菌先經(jīng)瓊脂糖包埋,然后進(jìn)行蛋白酶K裂解,最后用限制性內(nèi)切酶Xba I(50U)進(jìn)行酶切,從而得到限制性DNA片段,進(jìn)行CHEF-mapper脈沖場(chǎng)凝膠電泳(以沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株H9812為分子量標(biāo)記)。最后的結(jié)果標(biāo)示為經(jīng)GelRed染色后成像的圖譜導(dǎo)入Bionumerics 6.6軟件進(jìn)行聚類分析后的結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 桂林市2019—2020年沙門菌血清型分布2019年的32株沙門菌和2020年的37株沙門菌,分別為B、C、D、E 4個(gè)群,共20個(gè)血清型,主要為鼠傷寒沙門菌,占菌株總數(shù)的27.54%(19/69),其次是腸炎沙門菌占14.49%(10/69),科瓦利斯沙門菌占13.04%(9/69),肯塔基沙門菌占5.80%(4/69),其余各型菌株數(shù)量較少,分型結(jié)果及比例見表1。

表1 2019—2020年桂林市食源性沙門菌血清型分布[n(%)]

2.2 沙門菌耐藥情況

2.2.1 2019—2020年沙門菌耐藥情況如表2所示,受試的12種抗生素中,69株菌株對(duì)磺胺異噁唑、四環(huán)素、氨芐西林、萘啶酸、氯霉素、復(fù)方新諾明、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、頭孢西丁、氨芐西林/舒巴坦的耐藥率分別為82.61%、75.36%、60.87%、52.17%、42.03%、28.99%、23.19%、14.49%、13.04%、5.80%、4.35%,對(duì)美羅培南100.00%敏感。

表2 2019—2020年沙門菌12種抗生素藥敏結(jié)果[株(%)]

2.2.2 2019—2020年沙門菌耐藥譜分布如表3所示,2019年的32株菌共產(chǎn)生17個(gè)耐藥譜。其中9株鼠傷寒沙門菌對(duì)TET 100%耐藥、對(duì)AMP 88.89%(8/9)耐藥、對(duì)Sul 66.67%(6/9)耐藥,AMP-TET-NAL和AMP-Sul-TET-AXO為鼠傷寒沙門菌的優(yōu)勢(shì)耐藥譜,分別有3株菌存在同型耐藥情況;腸炎沙門菌優(yōu)勢(shì)耐藥譜為AMP-Sul-NAL,5株菌株100.00%對(duì)此耐藥。3株德爾卑沙門菌優(yōu)勢(shì)耐藥譜為TET-NAL;3株科瓦利斯沙門菌對(duì)Sul-TET 100.00%耐藥。

表3 2019年32株不同血清型的沙門菌耐藥譜分布

如表4所示,2020年的37株菌共產(chǎn)生24個(gè)耐藥譜。其中10株鼠傷寒沙門菌對(duì)Sul 100.00%耐藥、對(duì)TET 90.00%(9/10)耐藥、對(duì)AMP 80.00%(8/10)耐藥,AMP-Sul-TET為鼠傷寒沙門菌的優(yōu)勢(shì)耐藥譜,有3株菌存在同型耐藥情況;科瓦利斯沙門菌優(yōu)勢(shì)耐藥譜為Sul-TET,有5株菌株對(duì)此耐藥;5株腸炎沙門菌100%對(duì)AMP和NAL耐藥;3株阿貢納沙門菌全部對(duì)Sul耐藥。

表4 2020年37株不同血清型的沙門菌耐藥譜分布

2.3 PFGE分析結(jié)果

2.3.1 2019年32株沙門菌PFGE聚類分析對(duì)32株沙門菌酶切并進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳后,DNA片段得到較好地分離,可見大小不一的電泳條帶,然后進(jìn)行聚類分析,根據(jù)電泳產(chǎn)生條帶的位置和數(shù)量的不同,依據(jù)國(guó)家食源性疾病溯源網(wǎng)絡(luò)手冊(cè),獲得電泳圖譜,通過Bionumerics 6.6軟件采用不加權(quán)算數(shù)平均組對(duì)方法(UPG-MA),自動(dòng)將這些PFGE帶型分為多個(gè)大小不一的聚類群,獲得不同菌株間的遺傳克隆關(guān)系。菌株間相似度在49.40%～100.00%,呈現(xiàn)多樣性(圖1)。

圖1 2019年32株沙門菌PFGE聚類分析圖

2.3.2 分別對(duì)2019年4種菌型進(jìn)行PFGE聚類分析聚類分析結(jié)果所示,9株鼠傷寒沙門菌共有6個(gè)不同的PFGE帶型(圖2),按照90%的相似度,這些PFGE帶型又可分為4個(gè)大小不一的聚類群;5株腸炎沙門菌共有4個(gè)不同的 PFGE帶型(圖3),按照90%的相似度,這些PFGE帶型又可分為2個(gè)大小不一的聚類群;3株德爾卑沙門菌共有3個(gè)不同的PFGE帶型(圖4),按照90%的相似度,這些PFGE帶型又可分為2個(gè)大小不一的聚類群;3株科瓦利斯沙門菌共有3個(gè)不同的PFGE帶型(圖5),按照85%的相似度,這些PFGE帶型可以分為2個(gè)大小不一的聚類群。

圖2 2019年9株鼠傷寒沙門菌PFGE聚類分析圖

圖3 2019年5株腸炎沙門菌PFGE聚類分析圖

圖4 2019年3株德爾卑沙門菌PFGE聚類分析圖

圖5 2019年3株科瓦利斯沙門菌PFGE聚類分析圖

2.3.3 2020年34株沙門菌PFGE聚類分析對(duì)2020年的37株沙門菌酶切并進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳后,有3株菌發(fā)生降解,其余34株沙門菌的DNA片段得到較好地分離,可見大小不一的電泳條帶,然后對(duì)34株沙門菌進(jìn)行聚類分析,根據(jù)電泳產(chǎn)生條帶的位置和數(shù)量的不同,這些PFGE帶型可以分為多個(gè)大小不一的聚類群,菌株間相似度在49.60%～100.00%,呈現(xiàn)多樣性(圖6)。

圖6 2020年34株沙門菌PFGE聚類分析圖

2.3.4 分別對(duì)2020年3種菌型進(jìn)行PFGE聚類分析對(duì)10株鼠傷寒沙門菌進(jìn)行聚類分析,共分為10個(gè)不同的PFGE帶型(圖7),按照90%的相似度,這些PFGE帶型又可以分為5個(gè)大小不一的聚類群;對(duì)6株科瓦利斯沙門菌進(jìn)行聚類分析,共分為3個(gè)不同的PFGE帶型(圖8),按照90%的相似度,這些PFGE帶型又可以分為2個(gè)大小不一的聚類群;對(duì)5株腸炎沙門菌進(jìn)行聚類分析,共分為4個(gè)不同PFGE帶型(圖9),按照90%的相似度,這些PFGE帶型又可以分為2個(gè)大小不一的聚類群。

圖7 2020年10株鼠傷寒沙門菌PFGE聚類分析圖

圖8 2020年6株科瓦利斯沙門菌PFGE聚類分析圖

圖9 2020年5株腸炎沙門菌PFGE聚類分析圖

3 討 論

沙門菌是導(dǎo)致公共衛(wèi)生安全事件頻發(fā),威脅人畜健康的一種主要的食源性致病菌,不同血清型沙門菌的致病性存在差異。本研究顯示,桂林市2019年、2020年食源性風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和食物中毒突發(fā)公共衛(wèi)生事件中檢出的沙門菌優(yōu)勢(shì)血清型主要是鼠傷寒沙門菌,占27.54%,其次為腸炎沙門菌,占14.49%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2,10,12,13],在我國(guó)多地引起食源性食物中毒的最常見沙門菌血清型是鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌等,與本研究結(jié)論一致。同時(shí),桂林市分離檢出的沙門菌分屬于B、C、D、E 4個(gè)群20個(gè)血清型,說明桂林市食品中及腹瀉樣本沙門菌呈現(xiàn)多態(tài)性,但存在著優(yōu)勢(shì)菌。

研究顯示,沙門菌的耐藥性日益嚴(yán)重且與臨床疾病治療關(guān)系密切,同時(shí)涉及外環(huán)境中如養(yǎng)殖業(yè)禽畜動(dòng)物抗生素耐藥,引起食源污染影響到人源的問題,因此受到醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)和農(nóng)業(yè)部門等的重視[14]。本研究發(fā)現(xiàn)桂林市沙門菌同一血清型的菌種其耐藥譜有很大相似性,如本研究發(fā)現(xiàn)2019年桂林市9株鼠傷寒沙門菌對(duì)四環(huán)素100.00%耐藥,對(duì)氨芐西林88.89%耐藥,對(duì)磺胺異噁唑66.67%耐藥;2020年桂林市10株鼠傷寒沙門菌對(duì)磺胺異噁唑100.00%耐藥、對(duì)四環(huán)素90.00%耐藥、對(duì)氨芐西林80.00%耐藥。這一耐藥情況與上海市鼠傷寒沙門菌82.30%對(duì)四環(huán)素耐藥率[15]、安徽鼠傷寒沙門菌60.50%對(duì)四環(huán)素耐藥率[16]情況類似,但桂林市鼠傷寒沙門菌四環(huán)素耐藥率已達(dá)90.00%～100.00%,值得相關(guān)醫(yī)療機(jī)構(gòu)警惕。國(guó)內(nèi)各地報(bào)道鼠傷寒沙門菌耐藥最高的抗生素種類不同,原因有待進(jìn)一步探討。同時(shí)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)腸炎沙門菌和德爾卑沙門菌、科瓦利斯沙門菌存在同型優(yōu)勢(shì)耐藥譜。

PFGE通過對(duì)細(xì)菌分子分型開展同源溯源分析,是目前國(guó)內(nèi)外鑒別菌株以及溯源的金標(biāo)準(zhǔn)[17-18],也是實(shí)踐中應(yīng)用較為廣泛的溯源分析技術(shù)。經(jīng)過對(duì)2019—2020年桂林市69株沙門菌進(jìn)行PFGE分子分型分析,69株沙門菌有多種帶型,基因型呈多樣性,存在優(yōu)勢(shì)的流行基因型。此外,帶型無明顯的地域、時(shí)間、聚集特征,提示沙門菌在桂林市食源性風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目以及突發(fā)公共衛(wèi)生事件呈散發(fā)存在。但由于分離菌株數(shù)量較少,且缺乏年份時(shí)序性研究,尚需不斷建立并完善菌株及分子分型數(shù)據(jù)庫,為預(yù)警以及干預(yù)食源性疾病暴發(fā)做好技術(shù)和數(shù)據(jù)儲(chǔ)備。

本研究建立了2019—2020年桂林市食源性風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目以及突發(fā)公共衛(wèi)生事件中分離檢出的沙門菌的分子分型數(shù)據(jù)庫,本數(shù)據(jù)庫為今后及時(shí)發(fā)現(xiàn)和食源性疾病暴發(fā)的處置奠定了基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)2019—2020年桂林市沙門菌存在鼠傷寒和腸炎優(yōu)勢(shì)菌,菌株存在耐藥現(xiàn)象。鼠傷寒沙門菌耐藥較為嚴(yán)重,結(jié)果提示在本地區(qū)食源性致病菌均可能存在耐藥基因或耐藥菌株擴(kuò)散現(xiàn)象。收集的沙門菌數(shù)據(jù)資源充實(shí)了本市一級(jí)區(qū)域性食源性致病菌數(shù)據(jù)資源庫,為今后開展疾病和食源性疾病的監(jiān)測(cè)、暴發(fā)溯源、控制預(yù)警以及建立和應(yīng)用大數(shù)據(jù)提供科學(xué)的依據(jù)。