分散液液微萃取/氣相色譜法檢測植物油中11種有機磷農(nóng)藥殘留

李芳芳,王艷麗,李潔,陳倩倩,田其燕,陳克云,鞠香,趙發(fā),張卉,劉艷明

(山東省食品藥品檢驗研究院,國家市場監(jiān)管重點實驗室(肉及肉制品監(jiān)管技術(shù)),山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心,山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心,山東 濟南,250101)

植物油在人們生活中所占的比例日益增加,其質(zhì)量安全至關(guān)重要。目前,國內(nèi)植物油產(chǎn)量增長緩慢,需依靠國外進口來彌補植物油產(chǎn)需的缺口。國內(nèi)外對植物油中農(nóng)藥殘留問題的關(guān)注程度日益增加,各個國家對其最高殘留限量要求也有所不同。我國國家標準GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定在食用植物油及油料作物中允許使用敵敵畏、甲基對硫磷等有機磷農(nóng)藥,禁止使用嘧啶磷、抑草磷等農(nóng)藥。對于我國已經(jīng)禁止使用的部分有機磷農(nóng)藥,其他國家及組織對其制定了最高殘留限量。比如韓國制定了嘧啶磷在花生中的最高殘留限量,歐盟制定了滅蚜磷在芝麻籽、大豆等農(nóng)作物中的最高殘留限量。

植物油基質(zhì)復(fù)雜,對其農(nóng)藥殘留檢測時需進行一定的樣品前處理以減少基質(zhì)干擾?，F(xiàn)有前處理技術(shù)主要為固相萃取法、液液萃取法、凝膠滲透色譜法、分散固相萃取和QuEChERS[1-6]。這些前處理方式普遍存在溶劑消耗量大、分析時間長、成本高、對環(huán)境不友好等弊端。隨著綠色化學(xué)理念的推廣,2006年,REZAEE等[7]創(chuàng)造性發(fā)明了分散液液微萃取技術(shù)(dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)。該技術(shù)使用微量有機試劑就可實現(xiàn)對分析物的高效提取和富集,綠色環(huán)保、簡單快捷、節(jié)約成本。目前,DLLME技術(shù)已被成功應(yīng)用于鄰苯二甲酸酯[8-9]、農(nóng)藥殘留[10-13]、多環(huán)芳烴[14-15]以及食品添加劑[16]的測定。

農(nóng)藥殘留常規(guī)前處理技術(shù)有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17-21]。氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖然定性定量準確,但存在儀器造價高、耗材昂貴等問題,在一般生產(chǎn)企業(yè)及基層實驗室推廣比較困難。氣相色譜儀的配套設(shè)備價格低,普適性強,有利于食品質(zhì)量安全監(jiān)測的常規(guī)應(yīng)用。

本研究擬結(jié)合DLLME新型前處理技術(shù)和氣相色譜-火焰光度檢測器(gas chromatography-flame photometric detector, GC-FPD)專一性的優(yōu)勢,建立測定植物油中有機磷農(nóng)藥殘留的分析方法。該方法可以精確、快速地分析植物油中有機磷農(nóng)藥殘留含量,對保障食用者的安全有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

敵敵畏、甲基對硫磷、嘧啶磷、滅蚜磷、乙拌磷、丙蟲磷、滅菌磷、毒死蜱、抑草磷、三唑磷、硫丙磷(質(zhì)量濃度均為100 mg/L),北京曼哈格生物科技有限公司;甲醇、正己烷、三氯甲烷、丙酮、甲苯、乙腈、二氯甲烷(dichloromethane, CH2Cl2)、1,1,2-三氯乙烷、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)(均為色譜純),德國Merck公司;氯化鈉(分析純),國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2030氣相色譜儀配置火焰光度檢測器系統(tǒng),日本島津公司;冷凍離心機,德國Sigma公司;渦旋混合器,德國IKA公司;Milli-Q去離子水制備器,美國Millipore公司;電子天平,美國塞多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別用刻度吸量管移取0.1 mL的11種有機磷農(nóng)藥標準品于同一10 mL容量瓶,用CH2Cl2定容至刻度。配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標準儲備液,4 ℃保存。使用時根據(jù)實際工作稀釋成不同濃度的混合工作標液。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 樣品提取

選取玉米油樣品進行分析測定。稱取樣品1 g(精確至0.01 g),加入2 mL正己烷,渦旋2 min。加入2 mL DMF進行提取,渦旋2 min,將DMF層移入15 mL離心管中備用。

1.3.2.2 DLLME

將樣品提取中的0.9 mL DMF提取液和260 μL CH2Cl2混合,加入到含有1 mL去離子水的15 mL離心管中。將離心管渦旋60 s,然后離心2 min(6 000 r/min),用微量注射器取出CH2Cl2層于進樣瓶中,進行GC-FPD分析。

1.3.3 基質(zhì)效應(yīng)

稱取空白樣品,按1.3.2節(jié)前處理過程制備空白基質(zhì)溶液?；|(zhì)效應(yīng)(matrix effects,ME)的計算如公式(1)所示?；|(zhì)效應(yīng)結(jié)果為負值、0、正值分別表示基質(zhì)抑制效應(yīng)、無基質(zhì)效應(yīng)、基質(zhì)增強效應(yīng),且絕對值越大表明基質(zhì)效應(yīng)越強[22]。

(1)

1.3.4 色譜條件

色譜柱:DB-1(30 m×0.53 mm, 1.50 μm);柱流量:1.0 mL/min;進樣量:1 μL;不分流進樣;升溫程序:起始溫度為100 ℃,保持2 min,以6 ℃/min升至210 ℃,不保持,以5 ℃/min升至250 ℃,保持10 min;載氣:氮氣;進樣口溫度:250 ℃;檢測器溫度:300 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗結(jié)果采用Origin 9.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

由于植物油樣品脂肪含量高,基體干擾大,對有機磷農(nóng)藥殘留檢測必須除去干擾才能獲得高的靈敏度和準確性。本文為了避免油脂對檢測的干擾,先將樣品中的目標物提取到有機試劑中,再結(jié)合DLLME來進一步凈化分析。

2.1 樣品提取條件優(yōu)化

2.1.1 溶解試劑的選擇

正己烷對油脂含量高的樣品溶解度較大,本文選其作為溶解試劑。為了更好地溶解樣品,需要對正己烷體積進行優(yōu)化,研究了1～5 mL體積正己烷對提取效率的影響。結(jié)果表明,當選擇正己烷體積為2 mL時,所有目標物的提取效率最高。

2.1.2 提取劑的選擇

本研究樣品提取步驟中的提取劑起到承上啟下的作用,一方面從植物油中提取出目標物,另一方面作為下一步DLLME中的分散劑,所以它的選擇尤為重要。提取試劑的選擇有以下原則:a)對目標物有較強的提取能力;b)與目標物有良好的分離能力;c)能使DLLME中的萃取劑均勻分散在樣品溶液中。綜合考慮,本研究分別選取乙腈、DMF、丙酮和甲醇作為提取劑。結(jié)果表明(圖1-a),當選用丙酮時,它能與正己烷混溶,無法分層;選擇甲醇作為提取劑時,基線波動比較大,并且目標物回收率相對不高;選擇DMF和乙腈作為提取劑時,基線都較穩(wěn)定,DMF組目標物的回收率高于乙腈組,另外,DMF在DLLME步驟與萃取劑和水的混溶性更好,更易形成穩(wěn)定的乳濁液體系,因此選擇DMF作為樣品提取步驟的提取試劑。

a-提取劑種類;b-提取劑體積圖1 樣品提取步驟中提取劑對目標物回收率的影響Fig.1 Effect of extractant on recovery of target substance in sample extraction step

為了研究DMF體積對提取結(jié)果的影響,分別使用不同體積(1、2、3、4 mL)的DMF進行提取實驗。研究結(jié)果表明(圖1-b),當DMF體積小于2 mL時,樣品中有機磷農(nóng)藥的提取率隨提取試劑體積的增大而逐漸增大,其原因為DMF體積太小時不能將有機磷農(nóng)藥充分提取。當DMF體積大于2 mL時,不同體積的DMF對提取效率的影響相差不大。選取DMF的提取體積為2 mL。

2.2 DLLME萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 萃取劑的選擇

萃取劑需滿足:a)對目標物有較強的萃取能力;b)不易溶于水;c)易溶于分散劑[23]。本研究分別選取甲苯、1,1,2-三氯乙烷、CH2Cl2、三氯甲烷作為萃取劑。研究表明(圖2-a),CH2Cl2對有機磷農(nóng)藥的萃取效果最好,主要原因是CH2Cl2的極性較大,對極性相對較大的有機磷農(nóng)藥的選擇性強,因此選擇CH2Cl2為萃取劑。

a-萃取劑種類;b-萃取劑體積圖2 DLLME中萃取劑對回收率的影響Fig.2 Effects of extraction solvent in the DLLME step

萃取劑體積直接決定了DLLME的萃取效率,研究了不同體積(60、100、140、180、220、260、280、300、320 μL)的CH2Cl2對有機磷農(nóng)藥的萃取效率。實驗結(jié)果如圖2-b所示,當CH2Cl2體積小于260 μL時,有機磷農(nóng)藥的回收率與CH2Cl2的體積成正相關(guān),但當CH2Cl2體積逐漸增大到320 μL時,各分析物的回收率與其成負相關(guān),因此CH2Cl2的體積選擇260 μL。

2.2.2 分散劑的選擇

由2.1.2節(jié)實驗結(jié)果可知,DMF在樣品提取步驟對目標物有較強的提取能力,在DLLME中又能使CH2Cl2在樣品溶液中很好的分散。因此,選擇DMF作為DLLME中的分散劑。

DMF體積決定了CH2Cl2在樣品水溶液中的分散及萃取效率,在0.7～1.1 mL DMF內(nèi)研究了DMF體積對萃取效率的影響。實驗結(jié)果如圖3所示,在0.7～0.9 mL時,萃取效率與DMF體積呈正相關(guān),反映出CH2Cl2在樣品水溶液中的分散性更好,更易形成均勻的小液滴,提取更充分;而在0.9～1.1 mL時,萃取效率與DMF體積呈負相關(guān),這是因為當DMF體積過大時,有機磷農(nóng)藥可能在分散劑中的溶解度會增大,進而導(dǎo)致CH2Cl2的萃取效率降低。因此選擇DMF體積為0.9 mL。

圖3 DLLME中DMF體積對回收率的影響Fig.3 Effect of the volume of DMF on the recovery of pesticides obtained from DLLME

2.2.3 鹽效應(yīng)的選擇

由于離子強度作用,在提取溶液中加入適量的無機鹽會有利于增大目標物在有機相中的溶解度。本研究考察了不同質(zhì)量分數(shù)(0%、5%、10%、15%、20%)的氯化鈉對有機磷農(nóng)藥萃取效率的影響。實驗現(xiàn)象發(fā)現(xiàn):隨著氯化鈉質(zhì)量分數(shù)的增加,最后取出的萃取劑體積會逐漸增大,而且分散劑、水、萃取劑三者形成的渾濁體系也逐漸變澄清。結(jié)果表明,鹽濃度的增大并不一定能增大目標物在有機相中的溶解度,有機磷農(nóng)藥的萃取效率與鹽濃度呈負相關(guān),原因可能是鹽效應(yīng)使目標物和萃取劑在水中的溶解度同時減小,使得萃取劑與水形成的小液滴減少,因此導(dǎo)致萃取效率降低[24]。另外,鹽效應(yīng)還有可能會增大水的黏度,不利于目標物在水中的傳質(zhì)[25]。綜合以上原因,氯化鈉對提高萃取效率無積極作用,因此選擇不添加氯化鈉。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限

由表1中基質(zhì)效應(yīng)的結(jié)果可知,植物油基質(zhì)會對實驗的萃取回收率產(chǎn)生一定影響。為降低植物油基質(zhì)對分析結(jié)果的干擾,用空白基質(zhì)溶液將標準儲備液稀釋成系列標準工作溶液(質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL),按1.3.4節(jié)色譜分析條件進行測定。采用空白基質(zhì)加標的方法,分別以信噪比為3和10得到方法的檢出限(limits of detection,LOD)和定量限(limits of quantification,LOQ)[22]。結(jié)果如表1所示,在0.01～1.00 μg/mL內(nèi),所有目標物線性關(guān)系均良好,相關(guān)系數(shù)為0.999 1～0.999 7,表明所建立方法適合分析植物油中的11種有機磷農(nóng)藥殘留。

表1 11種農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)Table 1 Linear ranges, correlation coefficients, limits of detection, limits of quantification, and matrix effects for 11 pesticides

2.3.2 方法準確度和精密度

在空白玉米油樣品中添加目標物進行回收率實驗,分別添加0.01、0.10、0.50 mg/kg 3個濃度水平,每個水平重復(fù)測定6次。結(jié)果如表2所示。11種有機磷農(nóng)藥的回收率為75.6%～116.2%,相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為1.6%～8.7%。

表2 方法的回收率和精密度 (n=6)Table 2 Recoveries and RSDs for the developed method (n=6)

2.4 實際樣品測定和方法驗證

采用本實驗建立的方法對17批植物油(玉米油、花生油、大豆油)實際樣品進行分析測定,在所有樣品中均未檢出有機磷農(nóng)藥?；ㄉ秃痛蠖褂椭?.01 mg/kg和0.10 mg/kg濃度的回收率和RSD結(jié)果如表3 所示,回收率為78.2%～112.3%,相對標準偏差為1.8%～6.8%。結(jié)果表明,該方法對實際樣品中有機磷農(nóng)藥的測定具有適用性和有效性,花生油空白基質(zhì)和其加標的色譜圖如圖4。

表3 十一種有機磷農(nóng)藥在花生油和大豆油中的回收率和相對標準偏差(n=3)Table 3 Recoveries and RSDs of peanut oil and soybean oil spiked with 11 organophosphorus pesticides at different concentrations (n=3)

1-敵敵畏;2-乙拌磷;3-甲基對硫磷;4-毒死蜱;5-嘧啶磷;6-滅蚜磷;7-丙蟲磷;8-丙菌磷;9-抑草磷;10-三唑磷;11-硫丙磷a-質(zhì)量濃度為0.02 μg/mL的混合標準溶液;b-加標水平為0.01 mg/kg空白花生油樣品;c-空白花生油樣品圖4 混合標準溶液、空白花生油樣品及空白花生油樣品的GC-FPD色譜圖Fig.4 Chromatograms of GC/FPD from mix standards, blank peanut oil spiked with mix standards and blank peanut oil

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)考察了前處理過程中樣品提取條件和DLLME條件對回收率的影響,建立了分散液液微萃取技術(shù)與氣相色譜-火焰光度檢測器相結(jié)合測定植物油中11種有機磷農(nóng)藥殘留的分析方法。該方法檢測靈敏度和準確度較高,并且簡單快捷、有機試劑用量低以及對環(huán)境綠色環(huán)保,有利于在基層實驗室展開工作,為市場監(jiān)管部門對植物油中有機磷等農(nóng)藥的快速監(jiān)測分析提供技術(shù)支持。