小柴胡湯抑制NF-κB信號通路對氨誘導大鼠星形膠質(zhì)細胞水腫的保護作用研究*

李晉，馮勤興，賈為壹，劉正蕓，劉佳佳，徐尚福

（1.遵義醫(yī)科大學貴州省普通高等學校傳染病與生物安全特色重點實驗室 遵義 563006；2.遵義醫(yī)科大學生命科學研究院 遵義 563006；3.遵義醫(yī)科大學基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室遵義 563006）

肝性腦病（Hepatic encephalopathy，HE）是由各種嚴重肝病所致，以代謝紊亂為基礎(chǔ)的神經(jīng)精神異常綜合征，其經(jīng)典病理生理學概念是基于肝細胞功能障礙和/或門脈系統(tǒng)分流（Portal system shunt，PSS），導致血液和大腦高氨水平。氨濃度升高干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）的內(nèi)穩(wěn)態(tài)和導致認知缺陷。其中，A型為急性肝功能衰竭（Acute liver failure，ALF）相關(guān)的HE（ALF associated hepatic encephalophathy，AHE），常發(fā)生在病毒性肝炎、對乙酰氨基酚毒性或暴露于其他肝毒素（特別是酒精）引起的大面積肝壞死之后，是一種高死亡率（55%-70%）的疾病，AHE常伴有腦水腫，進而產(chǎn)生顱內(nèi)壓升高和腦疝，最終導致死亡[1-2]。目前，除了肝移植外，還沒有令人滿意的治療AHE的方法[3-4]。

AHE的主要發(fā)病因素是腦水腫的發(fā)展，以及隨后顱內(nèi)壓的增加和腦疝。星形膠質(zhì)細胞（Astrocyte，AS）的腫脹（細胞毒性水腫）是AHE水腫的主要組成部分。盡管AHE水腫的分子基礎(chǔ)仍然難以捉摸，但氨在其發(fā)病機制中有很強的關(guān)聯(lián)[5]。正常情況下，體內(nèi)氨的主要來源是從膳食蛋白中獲得的氨基酸代謝產(chǎn)生，肝臟起著重要的解氨毒作用。因此，當肝臟衰竭時，血氨水平升高，病變肝臟對其清除能力受損，導致大腦谷氨酰胺（Glutamine，Gln）累積，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂[6]。因此高氨血癥是AHE發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。氨處理星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物是一種常用的HE體外模型，因為這些培養(yǎng)物重現(xiàn)了HE實驗動物和病人身上觀察到的許多特征，包括形態(tài)學改變、細胞腫脹等[7-8]。

除氨外，有研究表明炎癥在AHE發(fā)病機制中的潛在作用。AHE患者血液中白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）明顯升高[9]。核因子κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）調(diào)控多個能夠損害星形膠質(zhì)細胞的神經(jīng)炎性細胞因子和趨化因子[10]。眾所周知，NF-κB可以激活許多炎癥因子基因，包括誘導型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS），過多的iNOS導致一氧化氮（Nitric oxide，NO）過量，已有研究證實NO的供體S-nitroso-N-acethylpenicillamine（SNAP）和morsidonine（SIN-1）引起星形膠質(zhì)細胞腫脹，而非特異性iNOS抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）顯著減少氨誘導的星形膠質(zhì)細胞腫脹[11]。這些研究表明，NF-κB可能代表AHE中星形膠質(zhì)細胞腫脹機制的重要組分，因此，抑制星形膠質(zhì)細胞的NF-κB信號通路可能是預防神經(jīng)炎性損傷和減輕星形膠質(zhì)細胞腫脹的一種有前途的治療策略。

中藥復方小柴胡湯出自東漢張仲景的《傷寒雜病論》，是中醫(yī)十大名方之一，在中醫(yī)領(lǐng)域常用來治療外感發(fā)熱，尤其是有往來寒熱等少陽證。課題組前期研究證實小柴胡湯具有治療硫代乙酰胺（Thioacetamide，TAA）誘導大鼠AHE模型的潛在作用，改善AHE大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞的結(jié)構(gòu)，減輕腦組織水腫[12]。本研究擬在此基礎(chǔ)上，通過觀察氨對體外培養(yǎng)大鼠原代星形膠質(zhì)細胞的影響，以NF-κB信號通路為靶點，探討小柴胡湯對星形膠質(zhì)細胞腫脹的干預作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級Sprague-Dawley大鼠30只，雄性，體質(zhì)量在（200±20）g，由第三軍醫(yī)大實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（渝）2012-0005。

1.2 藥品、試劑和主要儀器

小柴胡顆粒（廣州白云山光華制藥股份有限公司）；氯化銨（優(yōu)寧維生物）；DMEM/F-12培養(yǎng)基（中國利維寧公司）；牛血清白蛋白和BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；RNAiso Plus、PCR引物和PrimeScriptTMRT reagent Kit（大連寶生物工程有限公司）；iQTM SYBR Green SuperMix（美國BIO-RAD公司）；β-actin、NF-κB p-P65、TNF-α、GFAP、AQP4抗體和ECL增強型化學發(fā)光試劑（北京博奧森生物公司）；NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Gel 1.0 mm×10 well預制膠（美國Thermo Fisher公司）；ND2000超微量分光光度計（美國Thermo Fisher公司）；CFX connect實時熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司）；Allegra X-30 臺式高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）；全波長酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；ChemiDoc XRS化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）。

1.3 含藥血清制備

將Sprague-Dawley大鼠隨機分為2組，即空白對照組（Vehicle組）和小柴胡湯組（XCHT組），每組15只。按照成人體質(zhì)量60 kg，人與大鼠每公斤體質(zhì)量折算的等效劑量，XCHT組大鼠灌服5 g·kg-1的小柴顆粒，空白對照組灌服等量蒸餾水，每天1次，共6天。大鼠末次給藥前12 h禁食不禁水，給藥1-2 h后在腹腔內(nèi)注射7%水合氯醛（0.5 mL·100 g-1）麻醉動物，腹主動脈取血，室溫靜置2 h，離心（3500 r·min-1，15 min），吸出血清，相同組血清混合，水浴滅活，于超凈臺中用微孔濾膜過濾除菌后，分裝至離心管中，存放于-80℃冰箱備用。

1.4 細胞分離、純化與培養(yǎng)

將新生1-2天的Sprague-Dawley大鼠在無菌條件下斷頭，取出大腦皮層組織并除凈腦膜，將腦皮質(zhì)剪碎，胰酶消化15 min后用完全培養(yǎng)基終止消化并反復吹打至分散成單個細胞。用細胞篩過濾組織勻漿后1000 r·min-1，4℃，離心10 min。收集沉淀并用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F-12培養(yǎng)基混勻，24 h后更換培養(yǎng)瓶中液體，置于培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）。免疫熒光法對星形膠質(zhì)細胞表面膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glialfibrillary acidic protein，GFAP）染色進行細胞純度檢測，當細胞含量大于95%時可傳代并用于以下檢測。

1.5 細胞分組與細胞免疫熒光

細胞按照每孔5×104個細胞接種6孔板，分為Vehicle組、Model組、XCHT組，每組3孔。按分組分別加入不含胎牛血清的DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋的各種血清（均為10%），Model組和XCHT組同時加入5 mmol·L-1氯化銨[13-14]。培養(yǎng)箱放置24 h后取出細胞，PBS清洗，多聚甲醛固定，0.5% Triton-X100通透細胞膜，用山羊血清封閉，一抗（1∶100）4℃孵育過夜。次日，用PBST清洗，吸干廢液，滴入二抗（1∶200）37℃孵育（此操作及以下操作避光），1 h后PBST清洗，吸干廢液，每孔加入500 μL DAPI，避光孵育5 min，倒置熒光顯微鏡下觀察并檢測熒光強度。

1.6 RT-PCR檢測

細胞分組處理同上，每組3瓶。24 h后取出細胞，胰酶消化，終止消化后，同組相混，離心，棄上清。每組加入500 μL RNAiso Plus裂解。總RNA提取按照試劑盒說明書操作，總RNA濃度用ND-2000超微量分光光度計檢測，OD260/280＞1.8 RNA純度符合要求。采用高容量轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用Power SYBR Green Master Mix進行RT-PCR定量。PCR引物退火溫度為60℃，其他條件按照說明書設(shè)置，引物信息見表1。

表1 PCR引物序列

1.7 Western blot檢測

細胞分組處理同上，每組3瓶。收集給藥24 h后的細胞，每瓶加入50 μL裂解液（RIPA:PMSF:堿性磷酸酶抑制劑=100∶1∶1）冰上裂解30 min，蛋白定量采用BCA法。加入蛋白上樣緩沖液放入多功能梯度PCR儀中變性15 min。80 V跑完上層膠，當Marker出現(xiàn)后，將電壓加壓到120 V，跑完為止。半干轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)膜30 min（25 V，1.0 A）。取出電轉(zhuǎn)后的PVDF膜，TBST洗3次，每次10 min。將PVDF膜置于5%的脫脂奶粉溶液封閉1 h，取出后用TBST洗3次，每次10 min。一抗孵育（1:1000），4℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。二抗孵育（1∶2000），室溫搖床振搖1 h。TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化學發(fā)光劑曝光，并分析實驗結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計方法

實驗所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均值±標準差（±s）表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 原代星形膠質(zhì)細胞純度鑒定

當星形膠質(zhì)細胞傳至第3代，采用免疫熒光法對GFAP染色鑒定細胞的純度，星形膠質(zhì)細胞（陽性細胞）呈紅色（圖1）。熒光顯微鏡下隨機選取5個不同視野進行觀察和計數(shù)，當星形膠質(zhì)細胞比例達95%以上時，可用于以下實驗。

圖1 原代星形膠質(zhì)細胞的純度鑒定

2.2 免疫熒光檢測AQP4的表達

利用免疫熒光法對星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的水通道蛋白4（Aquaporin4，AQP4）進行染色，并對平均熒光強度值進行分析。結(jié)果 顯示：與Vehicle組相比，Model組AQP4呈高表達（P＜0.01），而小柴胡湯干預后AQP4的表達明顯降低（P＜0.01）（見圖2）。

圖2 細胞免疫熒光法檢測AQP4蛋白的表達（±s）

2.3 小柴胡湯對星形膠質(zhì)細胞AQP4、GFAP、TNF-α mRNA表達的影響

RT-PCR法檢測結(jié)果顯示：與Vehicle組比較，Model組AQP4、TNF-α mRNA的表達量明顯升高，與Model組相比，XCHT組AQP4、TNF-α mRNA的表達量顯著降低（P＜0.05）；Model組GFAP mRNA的表達量相對于Vehicle組降低，小柴胡湯給藥后，GFAP mRNA的表達量明顯升高（P＜0.05）（見圖3）。

圖3 RT-PCR技術(shù)檢測AQP4、GFAP、TNF-α mRNA表達水平（±s）

2.4 小柴胡湯對星形膠質(zhì)細胞AQP4、GFAP、NF-κB p-P65、TNF-α蛋白表達的影響

Western blot法檢測結(jié)果顯示：Model組較Vehicle組AQP4、NF-κB p-P65、TNF-α的蛋白表達量明顯升高，與Model組比較，XCHT組AQP4、NF-κB p-P65、TNF-α的蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；而模型組GFAP蛋白表達量相對于空白對照組有降低的趨勢，小柴胡湯組給藥后GFAP 蛋白表達量明顯升高（P＜0.05）（見圖4）。

圖4 Western blot法檢測星形膠質(zhì)細胞AQP4、GFAP、NF-κB p-P65、TNF-α蛋白的表達（±s）

3 討論

腦水腫是肝性腦病的共同特征，被定義為大腦細胞內(nèi)和細胞外間隙水分過多積聚。血管源性水腫通過緊密連接蛋白的丟失導致血腦屏障的破壞，使顱內(nèi)壓升高；胞質(zhì)性水腫通過星形膠質(zhì)細胞的細胞內(nèi)腫脹增加血腦屏障的通透性，也使腦容量增加；而細胞毒性水腫通過改變水轉(zhuǎn)運膜蛋白（如水通道蛋白）的表達，觸發(fā)細胞膜的水滲透性增加。腦水腫是AHE重要的病理變化，主要表現(xiàn)以星形膠質(zhì)細胞腫脹為特征的細胞毒性水腫[15]。高氨血癥被認為是大腦和神經(jīng)改變的一個重要因素。高氨血癥通過改變神經(jīng)遞質(zhì)代謝和誘導神經(jīng)元毒性，在肝性腦病（Hepatic encephalopathy，HE）和急性肝衰竭（Acute liver failure，ALF）發(fā)病中發(fā)揮重要作用[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，當腦組織內(nèi)的氨濃度達到3-5 mmol·L-1水平時就能夠引起星形膠質(zhì)細胞水腫和肝性腦病。許多建立AHE體外模型的研究均采用3-5 mmol·L-1氨刺激星形膠質(zhì)細胞水腫[13-14]。因此，本實驗通過氯化銨誘導大鼠原代星形膠質(zhì)細胞水腫，模擬AHE腦水腫體外模型。中藥復方小柴胡湯由七味中藥組成（柴胡、黃芩、人參、半夏、甘草、生姜、大棗），是治療傷寒少陽證的基礎(chǔ)常用古方，也是和解少陽法的代表方，主治往來寒熱、胸脅苦滿、默默不欲飲食等傷寒少陽證?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，小柴胡湯除具有顯著的抗炎保肝、解熱鎮(zhèn)痛等作用，對神經(jīng)系統(tǒng)亦具有很好的保護作用。研究發(fā)現(xiàn)小柴胡湯通過調(diào)節(jié)下丘腦和紋狀體的5-羥色胺能和多巴胺能系統(tǒng)，并提高海馬神經(jīng)發(fā)生，對抑郁癥小鼠模型具有明顯治療作用，同時利用UPLC-MS/MS方法測定小柴胡湯給藥后小鼠的血漿成分，結(jié)果顯示，血漿中存在小柴胡湯的有效成分如黃芩苷、甘草苷、人參皂苷Rg1和Re、漢黃芩苷、甘草酸、漢黃芩素等[18-19]。一項臨床研究報道，小柴胡湯加減治療病毒性腦膜炎、腦炎21例，治愈18例，好轉(zhuǎn)2例，無效1例，服藥無不良反應(yīng)[20]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)小柴胡湯具有治療實驗性大鼠AHE的潛在作用[12]，因此，本實驗通過體外實驗進一步觀察小柴胡湯含藥血清對氯化銨誘導大鼠原代星形膠質(zhì)細胞水腫（模擬AHE腦水腫體外模型）的改善情況，結(jié)果證實：①小柴胡湯能夠改善氯化銨誘導的星形膠質(zhì)細胞水腫；②小柴胡湯可能通過抑制NF-κB信號通路調(diào)控TNF-α介導的炎癥反應(yīng)，減輕星形膠質(zhì)細胞水腫。

血管周圍星形膠質(zhì)細胞端足通過離子和水交換維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）家族中AQP4特異性表達于星形膠質(zhì)細胞的細胞膜，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的水通道蛋白，在血管周圍區(qū)域和星形膠質(zhì)細胞端足中都有大量發(fā)現(xiàn)，是對水運動影響最大的水通道蛋白。在對AQP4敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，AQP4廣泛參與腦水平衡、神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕、神經(jīng)興奮、神經(jīng)炎癥，甚至神經(jīng)退行性和神經(jīng)精神障礙[21]。在腦水腫（尤其細胞毒性水腫）形成過程中起重要的作用，AQP4表達水平的高低與星形膠質(zhì)細胞水腫的嚴重程度直接相關(guān)[22-23]。在本實驗中，Model組細胞的AQP4呈現(xiàn)高表達，經(jīng)小柴胡湯干預后AQP4的表達明顯下降。GFAP是細胞骨架蛋白的一種，可作為星形膠質(zhì)細胞的特異性標志物，幾乎參與細胞內(nèi)所有重要的生命活動。研究發(fā)現(xiàn)GFAP特異地存在于星形膠質(zhì)細胞中并與星形膠質(zhì)細胞的活性成正比[24]。課題組前期成功分離培養(yǎng)出新生Sprague-Dawley大鼠腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞，通過對星形膠質(zhì)細胞標志性蛋白GFAP進行染色，成功得到高純度的原代星形膠質(zhì)細胞。本實驗利用免疫熒光法對星形膠質(zhì)細胞表面GFAP進行檢測，當細胞純度大于95%時用于實驗。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示Model組GFAP的表達量相對于Vehicle組降低，小柴胡湯給藥后，GFAP的表達量明顯升高。以上結(jié)果提示小柴胡湯可以改善氯化銨誘導的星形膠質(zhì)細胞水腫，增強星形膠質(zhì)細胞的活性。

近年來發(fā)現(xiàn)在AHE的發(fā)病機制中炎癥反應(yīng)與高氨血癥的協(xié)同作用起至關(guān)重要的作用。高氨血癥使星形膠質(zhì)細胞內(nèi)谷氨酰胺濃度升高，因谷氨酰胺的膠體滲透性，能夠?qū)⑺肿游M入細胞內(nèi)進而引起星形膠質(zhì)細胞腫脹、腦水腫和顱內(nèi)高壓，并誘發(fā)炎癥反應(yīng)，使血腦屏障的完整性遭到破壞，星形膠質(zhì)細胞對水的通透性增加，星形膠質(zhì)細胞進一步腫脹。而炎癥反應(yīng)又反過來促使腦內(nèi)氨濃度升高，增加氨對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性。體外研究證實炎癥因子（如TNF-α）能夠促進血氨彌散入星形膠質(zhì)細胞中，加重星形膠質(zhì)細胞腫脹[25-26]。在炎癥過程中， NF-κB通路一直起著重要作用。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族由5個成員組成：p65（RelA）、RelB、c-Rel、NF-κB 1（p105/p50）和NF-κB 2（p100/p52），它們可以結(jié)合靶基因啟動子中的特定增強子元件，調(diào)節(jié)炎癥和免疫系統(tǒng)，是炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵性的核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，如星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞等，可誘導多種細胞炎性因子表達，造成腦組織損傷[27]。其中，NF-κB P65亞基與炎癥密切相關(guān)。靜息狀態(tài)下，NF-κB以p50/p65異二聚體形式與其抑制性蛋白IκB結(jié)合，表現(xiàn)為非活化狀態(tài)。當受到病理因素（LPS或TNF-α等）刺激時，IκB被IκB激酶IKK復合物磷酸化，導致IκB通過泛素化降解。NF-κB P65蛋白游離并進入細胞核，啟動TNF-α、NO、iNOS、IL-6等多種炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，使星形膠質(zhì)細胞活化，促進炎癥反應(yīng)發(fā)生[28]。其中TNF-α在ALF中起著重要的作用。在ALF患者和動物模型中，HE的嚴重程度與循環(huán)中TNF-α的水平密切相關(guān)。將TNF-α注入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，能以劑量依賴的方式引起血腦屏障通透性增加，而采用TNF-α抗體即阻止了血腦屏障的開放，表明TNF-α是調(diào)控血腦屏障開放的重要因素之一。血腦屏障通透性增加后，使得原本在正常情況下不能通過血腦屏障的神經(jīng)毒物比如γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）等進入腦組織，進而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能，同時血腦屏障對氨的通透性也增加，使腦內(nèi)氨的濃度升高。在細胞水平上，TNF-α增加人腦血管內(nèi)皮細胞對氨的攝取，并引起氨致敏培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞水腫。同時大量釋放的TNF-α可與星形膠質(zhì)細胞表面受體結(jié)合或通過星形膠質(zhì)細胞間縫隙連接作用于遠處的星形膠質(zhì)細胞，誘導TNF-α、谷氨酸、K+等物質(zhì)的釋放，TNF-α又能進一步活化NF-κB蛋白，加重炎癥反應(yīng)[29-32]。本實驗結(jié)果顯示Model組較Vehicle組NF-κB p-P65、TNF-α蛋白表達量明顯升高，與Model組比較，XCHT組NF-κB p-P65、TNF-α蛋白表達量顯著降低，提示小柴胡湯能夠抑制NF-κB活性，可能通過抑制NF-κB信號通路調(diào)控TNF-α介導的炎癥反應(yīng)，減輕星形膠質(zhì)細胞水腫。

AHE發(fā)生在急性肝功能衰竭基礎(chǔ)上，常在起病數(shù)日內(nèi)（2周內(nèi)）由輕度意識錯亂迅速陷入深昏迷，甚至死亡，目前還沒有令人滿意的治療方法。中醫(yī)藥是我國醫(yī)學科學的特色，也是中華民族優(yōu)秀文化的重要組成部分，中醫(yī)藥獨特優(yōu)勢（多靶點、多途徑、整體協(xié)調(diào)的特點）和作用，體現(xiàn)在療效確切的經(jīng)典配方上。但中醫(yī)藥寶庫不是拿來就能用的，必須與現(xiàn)代科技相結(jié)合。結(jié)合現(xiàn)代藥理學和課題組前期研究發(fā)現(xiàn)中藥復方小柴胡湯具有改善肝功能，提高AHE大鼠生存率和腦功能的作用，因此本研究在此基礎(chǔ)上進一步深入探討其治療機制。綜上所述，本研究表明小柴胡湯明顯改善氨誘導大鼠原代星形膠質(zhì)細胞的水腫，其作用機制可能與抑制NF-κB信號通路，減少炎癥介質(zhì)（尤其TNF-α）的產(chǎn)生和釋放有關(guān)。