心痛泰含藥血清干預(yù)PI3K/Akt/HIF-1α通路抑制兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制*

易瓊，彭清華，郭志華，彭筱平，魏佳明

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南省直中醫(yī)醫(yī)院 株洲 412008）

我國(guó)持續(xù)上升的心血管病發(fā)病率造成了沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?！吨袊?guó)心血管健康與疾病報(bào)告2021》[1]研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)的心血管病患者超過(guò)3億，患有冠心病的人數(shù)約1139萬(wàn)，每年發(fā)生心源性猝死的病患約54.4萬(wàn)例。動(dòng)脈粥樣硬化是易損斑塊形成的病理基礎(chǔ)，冠心病患者發(fā)生心源性猝死的主要原因是易損斑塊中纖維帽破裂導(dǎo)致出血，因此，纖維帽的穩(wěn)定性至關(guān)重要。平滑肌細(xì)胞（Aortic vascular smooth muscle cell，VSMC）是斑塊纖維帽的重要成分之一，參與合成細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)穩(wěn)定斑塊，在氧化應(yīng)激、缺血缺氧、ox-LDL等刺激下，VSMC可發(fā)生凋亡、壞死[2]。易損斑塊中存在大量VSMC凋亡和纖維帽中VSMC數(shù)量減少[3]。因此，對(duì)調(diào)控某些關(guān)鍵通路來(lái)減輕VSMC凋亡，是穩(wěn)定易損斑塊的重要治療方向。

心痛泰在“心受氣于脾”的理論基礎(chǔ)上組方，全方具有化痰祛瘀通絡(luò)之功，適用于痰瘀互結(jié)型冠心病的患者。飲食不節(jié)、肝郁氣滯等因素導(dǎo)致脾氣虛弱，脾虛生痰，痰凝脈道，久而成瘀，痰瘀互結(jié)則形成病理產(chǎn)物——“斑塊”。課題組的前期研究顯示，心痛泰可減輕炎癥反應(yīng)、改善血管重構(gòu)、減少斑塊纖維帽中的膠原分解，從而穩(wěn)定動(dòng)脈斑塊，初步闡釋了心痛泰干預(yù)斑塊VSMC的潛在作用[4-7]。VSMC是斑塊纖維帽的主要成分，因此，在前期基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索心痛泰對(duì)斑塊纖維帽中VSMC的具體作用機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析來(lái)解釋藥物、靶標(biāo)、信號(hào)通路、疾病之間的關(guān)聯(lián)性的一種方法，為中藥復(fù)方的有效成分、藥理機(jī)制、作用靶點(diǎn)提供精準(zhǔn)的研究思路[8]。課題組通過(guò)生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)心痛泰作用靶點(diǎn)PI3K/Akt/HIF-1α信號(hào)通路，構(gòu)建信息網(wǎng)絡(luò)分析靶蛋白及其功能，采用TCMSP、TCMID、TCMIP等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)報(bào)道，分析了心痛泰對(duì)動(dòng)脈斑塊中平滑肌細(xì)胞凋亡的潛在作用機(jī)制，再通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證心痛泰含藥血清對(duì)兔VSMC凋亡的效果，人兔基因同源，本研究采用ox-LDL誘導(dǎo)兔VSMC凋亡，模擬動(dòng)脈硬化斑塊中的平滑肌細(xì)胞模型[9]。文獻(xiàn)報(bào)道，PI3K/Akt/HIF-1α通路的上調(diào)參與了脂質(zhì)核心的增大、斑塊膠原的缺失、炎癥因子的釋放等過(guò)程，直接影響斑塊的穩(wěn)定性[10-11]。PI3K抑制劑可以減輕動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[12]。本研究通過(guò)CCK8法篩選出干預(yù)實(shí)驗(yàn)兔主動(dòng)脈VSMC的最適心痛泰含藥血清濃度；構(gòu)建ox-LDL導(dǎo)致VSMC凋亡的細(xì)胞模型，探討心痛泰含藥血清干預(yù)VSMC后，PI3K/Akt/HIF-1α通路以及凋亡相關(guān)因子的變化，采用TUNEL法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VSMC凋亡程度和凋亡率，細(xì)胞熒光染色檢測(cè)VSMC中α-SMA的熒光強(qiáng)度，從而探索心痛泰抑制VSMC凋亡的具體分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

雄性日本大耳白兔，10-12周齡，體質(zhì)量（2.19±0.135）kg。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（湘）2009-0012，許可證號(hào)：湘醫(yī)動(dòng)字D20-006號(hào)。實(shí)驗(yàn)已通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查（倫理批號(hào)：ZYFY20160515）。實(shí)驗(yàn)兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞購(gòu)自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司（批號(hào)：RAB-iCell-c004）。

1.2 藥物

心痛泰具體藥物組成及來(lái)源：丹參（批號(hào)HH23032102）、川芎（批號(hào)2212120112）、三七（批號(hào)20220620）、郁金（批號(hào)2022030201）、山楂（批號(hào)2212028）、枳殼（批號(hào)HY23032302）、葛根（批號(hào)GW23032702）、木香（批號(hào)220201），購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門(mén)診中藥方。按丹參∶川芎∶三七∶郁金∶山楂∶枳殼∶葛根∶木香=1.5∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶0.5的比例組成，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)流程制成藥粉，每克藥粉相當(dāng)于15 g生藥。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科制備，嚴(yán)格控制每一批次的藥品質(zhì)量濃度，符合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度的方可用于后續(xù)研究。由于本實(shí)驗(yàn)探討心痛泰含藥血清對(duì)PI3K通路的抑制作用，因此選擇PI3K通路抑制劑LY294002（Cell Signaling Technology，批號(hào)9901S）作為通路對(duì)照。

1.3 儀器與試劑

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，BCJ160S）；熒光倒置顯微鏡（Nikon，DS-Ri2）；高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher，Multifuge X1R）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司，F(xiàn)ACSCanto11）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DHG-9123A）；CCK-8檢測(cè)試劑（日本北仁，批號(hào)CK04）；T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Coming，430639）；24孔板專用細(xì)胞爬片（Solarbio，YA0350）；平滑肌細(xì)胞完全培養(yǎng)基（賽百慷上海生物技術(shù)股份有限公司，PriMed-iCell-004）；人源ox-LDL（上海懋康生物科技有限公司，MP6009-2MG）；FITC Annexin V apoptosis detection kit I凋亡試劑盒（美國(guó)BD公司，556547）；四甲基羅丹明-dUTP（Tetramethyl-Rhodamine-5-UTP，TMR）紅色熒光染料（武漢賽維爾生物科技有限公司，G1502-50T）；即用型4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液（凱基生物，KGA215-50）；0.25%胰蛋白酶（Gbico，1734858）；山羊血清（Solarbio，S9070）；α-SMA（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，Bsm-33188M）；Fluoromount-G熒光封片劑（SourthernBiotech，0100-01）；PI3K抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bsm-52218R）；Akt抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bs-3346R）；HIF-1α抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bs-0737R）；caspase-3抗體（abcam公司，批號(hào)：32351）；caspase-9抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bsm-52566R）；內(nèi)參β-actin（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bsm-33036m）；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：A0208）；羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：A0216）。

1.4 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCSMP（http://tcmspw.com/tcmsp.php），中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/），中醫(yī)藥整合藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算研究平臺(tái)TCMIP（http://www.tcmip.cn/），三維結(jié)構(gòu)顯示軟件，藥物信息綜合數(shù)據(jù)庫(kù)PubChem（PC）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），人類基因綜合分析數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCards（GC）（https://www.genecards.org/），生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Bioinformatics Gent（BG）中的Van de Peer Lab在線工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），小分子藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)在線分析平臺(tái)SwissTargetPrediction（STP）（http://www.swisstargetprediction.ch/），蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)STRING在線分析平臺(tái)（https://string-db.org/），Cytoscape軟件，WebGestalt（WG）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.webgestalt.org/#），F(xiàn)untional Database（FD）數(shù)據(jù)庫(kù)（WG的子數(shù)據(jù)庫(kù)），生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（ProreinData Bank，PDB）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代及鑒定

復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)兔主動(dòng)脈VSMC，2000 r·min-1離心5 min，去掉上清液，加入胎牛血清和培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按時(shí)更換培養(yǎng)基，細(xì)胞融合80%-90%行傳代培養(yǎng)，0.05%胰蛋白酶消化傳代到3-4代，取3-4代生長(zhǎng)良好、純度90%以上的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.6 心痛泰含藥血清的制備及最佳濃度篩選

12只實(shí)驗(yàn)兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、心痛泰低、中、高劑量組，每組3只。按照實(shí)驗(yàn)兔與成人的體表面積折算公式進(jìn)行換算給藥劑量。根據(jù)人臨床等效劑量換算，換算成兔的心痛泰中劑量給藥劑量為4.6 g·kg-1·d-1，減半為心痛泰低劑量2.3 g·kg-1·d-1給藥組，加倍為心痛泰高劑量9.2 g·kg-1·d-1給藥組。正常對(duì)照組生理鹽水灌胃。每日灌胃2次，連續(xù)灌胃1周。各組于末次給藥3 h后，2%戊巴比妥腹腔麻醉并左側(cè)股動(dòng)脈采血，于4℃靜置4 h，3500 r·min-1離心10 min取血清，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm無(wú)菌微孔過(guò)濾除菌，分裝入小瓶，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMC，胰蛋白酶消化，制作6×104個(gè)·mL-1的單細(xì)胞懸液，加入96孔板，細(xì)胞分為空白血清、心痛泰各劑量含藥血清組分別設(shè)置5%、10%、20%、30%四個(gè)濃度，培養(yǎng)基中按比例加入含藥血清，每組3個(gè)復(fù)孔，分別于24 h、48 h、72 h后終止培養(yǎng)，培養(yǎng)至所需時(shí)間后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)中孵育2 h，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)每孔的吸光值（OD），GraphPad軟件計(jì)算細(xì)胞增殖率。選擇對(duì)VSMC增殖率高的干預(yù)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 細(xì)胞分組

VSMC細(xì)胞分為5組：空白血清組、模型組（50 mg·L-1ox-LDL）、心痛泰含藥血清組（50 mg·L-1ox-LDL+心痛泰含藥血清）、LY294002組（50 mg·L-1ox-LDL+10 μmol·L-1LY294002）、心痛泰含藥血清+LY294002組（50 mg·L-1ox-LDL+心痛泰含藥血清+10 μmol·L-1LY294002）。

1.8 成分及靶點(diǎn)篩選

1.8.1 中藥活性化合物收集及篩選

利用TCMSP、TCMID、TCMIP數(shù)據(jù)庫(kù)，收集心痛泰中中藥飲片的主要化學(xué)成分。根據(jù)人體藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)[13-14]，以口服生物利用度≥30%，化合物類藥性≥0.18為篩選條件，初步篩選出心痛泰有效高活性化合物。

1.8.2 心痛泰作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與“中藥-疾病-表型”共同靶點(diǎn)篩選

TCMSP收集心痛泰有效高活性化合物成分后，將相關(guān)的活性化合物成分導(dǎo)入STP數(shù)據(jù)庫(kù)，剔除無(wú)關(guān)成分，預(yù)測(cè)心痛泰與動(dòng)脈粥樣硬化和細(xì)胞凋亡相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。將“動(dòng)脈粥樣硬化”、“細(xì)胞凋亡”的檢索詞納入GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，收集“動(dòng)脈粥樣硬化”、“細(xì)胞凋亡”的作用靶點(diǎn)。通過(guò)BG數(shù)據(jù)庫(kù)中Van de Peer Lab在線工具取交集獲得“心痛泰”、“動(dòng)脈粥樣硬化”和“細(xì)胞凋亡”三者密切相關(guān)的潛在共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.8.3 共同靶點(diǎn)關(guān)鍵基因篩選及蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇Multiple Protenin，限定物種為Homo sapiens，設(shè)定最低要求互動(dòng)分?jǐn)?shù)為最高可信度0.900[15]，得到PPI相關(guān)數(shù)據(jù)并導(dǎo)出數(shù)值，再將相關(guān)數(shù)值導(dǎo)入Cytoscape軟件，得到可視化的PPI圖，軟件計(jì)算Degree值。使用Cytoscape軟件中CytoHubba中的算法分別對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行亞網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，篩出拓?fù)浞治鲋星?0位基因取并集，整合出關(guān)鍵基因。

1.8.4 共同靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析

在WG數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)定物種為“Homo sapiens”，采用ORA算法分析，選用FD子數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行GO富集分析。進(jìn)階參數(shù)設(shè)定中，設(shè)定P＜0.05，余為默認(rèn)設(shè)置。收集BP、CC、MF富集分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行“加權(quán)集合覆蓋”分析，并繪制火山圖。同時(shí)對(duì)利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共同靶點(diǎn)關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG富集分析，繪制柱狀圖，并對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行亞網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，繪制“靶點(diǎn)-通路”弦圖。

1.9 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.9.1 TUNEL法檢測(cè)VSMC凋亡率

將VSMC細(xì)胞接種于24孔板，每孔密度1×105，石蠟切片、脫水，緩沖液及3%過(guò)氧化氫溶液中孵育20 min，PBS洗滌3次，按照TUNEL試劑盒說(shuō)明在樣品中加入檢測(cè)液，避光孵育1 h，PBS洗滌，DAPI孵育5 min復(fù)染細(xì)胞核，PBS清洗后使用防淬滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察。采用MIAS圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性（凋亡）細(xì)胞數(shù)和陰性（正常）細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算凋亡細(xì)胞占總體細(xì)胞中的百分比，隨機(jī)在5個(gè)不重復(fù)視野計(jì)算，取平均值。

1.9.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VSMC凋亡率

將各組兔主動(dòng)脈VSMC調(diào)整為1×106個(gè)·mL-1，與10 μL Annexin V-FITC及PI避光孵育（15 min）后流式儀檢測(cè)ASMCs細(xì)胞凋亡率。

1.9.3 PCR法測(cè)定PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的mRNA表達(dá)

按TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，VSMC以1×10個(gè)·mL-1接種于6孔板中，每孔加入1 mL TRIzol，冰上放置5 min，槍頭吹打，將細(xì)胞收集到離心管，室溫放置5-10 min使細(xì)胞充分裂解后，加入4℃的氯仿，震蕩15 s，冰盒上靜置5 min，75360 r·min-14℃低溫高速離心15 min，分層后取水相層（主要含有RNA），加入4℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻。將上步所得溶液全部加入到吸附柱（Spin Colums RM）中，在4℃，75360 r·min-1條件下離心30 s，保留流出液。在留出液中加入2/3體積無(wú)水乙醇（4℃預(yù)冷），混勻，棄流出液，離心2 min，將吸附柱裝入RNase-Free離心管中，加入38 μL RNase Free H2O（4℃預(yù)冷），冰盒上靜置3-5 min，充分溶解miRNA，重復(fù)上述步驟，得到的miRNA液保存在-80℃冰箱或液氮中，防止降解。使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提取的RNA溶液在260 nm、280 nm、320 nm處的吸光值，計(jì)算濃度及純度。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9、β-actin的引物序列。按說(shuō)明書(shū)將RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，配制熒光定量PCR，采用熒光定量PCR法測(cè)定VSMC中PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的mRNA表達(dá)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法計(jì)算分析基因表達(dá)水平。委托上海生工生物股份有限公司設(shè)計(jì)與合成，各基因的mRNA引物見(jiàn)表1。

表1 PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的mRNA引物

1.9.4 Western blot法測(cè)定p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白表達(dá)

棄掉培養(yǎng)液，每孔加入200 μL的RIPA裂解液，細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，離心機(jī)（4℃ 75360 r·min-1）離心15 min取上清，稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品，配置BCA工作液。測(cè)定BSA標(biāo)準(zhǔn)品及每個(gè)樣品的吸光值，同時(shí)做好記錄。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白濃度，根據(jù)每次上樣蛋白量為20 μg計(jì)算出每次上樣體積。按照配方配好分離膠，無(wú)水乙醇?jí)耗z，加入一定體積的蛋白樣品和Marker上樣。配制1×電泳液，用1×電泳液浸沒(méi)膠板，開(kāi)始電泳（60 V壓縮蛋白，80 V分離蛋白），300 mA恒流轉(zhuǎn)膜30 min。根據(jù)說(shuō)明書(shū)（p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9均為1∶1000）封閉膜，孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，按照1∶1000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，與膜37℃孵育1 h，最后行ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)顯影，曝光，掃描蛋白條帶。Gel Image ststem ver4.0軟件分析。其中，PI3K、Akt的蛋白表達(dá)，分別p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值進(jìn)行分析。

1.9.5 免疫熒光染色檢測(cè)各組VSMC中α-SMA的熒光定量

在培養(yǎng)板中將已爬好VSMC細(xì)胞的培養(yǎng)皿用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min。在玻片上滴加5% BSA，37℃封閉30 min。吸干封閉液，培養(yǎng)皿滴加足夠量的稀釋好的一抗：α-SMA（1∶100），4℃冰箱一抗孵育過(guò)夜，滴加稀釋好的熒光二抗488（1∶200），37℃孵育30 min，PBS充分淋洗。滴加DAPI避光孵育3 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，用PBS沖洗多余的DAPI，用50%甘油封閉培養(yǎng)皿。洗滌后滴加抗熒光淬滅劑，隨后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。采用Image J軟件對(duì)所有樣本進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度的半定量分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

生信數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及作圖使用GraphPad Prism 8.0.1（244）軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，所有結(jié)果均符合正態(tài)分布，多組之間的比較采用單因素方差分析（ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較，所有結(jié)果方差齊，因此采用LSD法。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 心痛泰含藥血清最佳質(zhì)量濃度（對(duì)VSMC增殖的影響）的篩選結(jié)果

在5%、10%藥物濃度下，與空白組比較，心痛泰低劑量組、心痛泰中劑量組、心痛泰高劑量組含藥血清的OD值均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；心痛泰高劑量組在5%和10%濃度下的OD值較空白組升高（P＜0.05或P＜0.01），但在20%和30%濃度下的OD值較空白組下降。心痛泰低劑量組在5%、10%、20%、30%濃度下的增殖率分別是134.25%、153.47%、168.16%、136.32%；心痛泰中劑量組在5%、10%、20%、30%濃度下的增殖率分別是147.85%、163.52%、179.35%、135.83%；心痛泰高劑量組在5%、10%、20%、30%濃度下的增殖率分別是157.35%、124.28%、93.65%、82.41%；提示20%心痛泰中劑量組對(duì)VSMC的增殖作用最強(qiáng)，故選取其用于體外實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

圖1 心痛泰不同劑量和濃度的含藥血清對(duì)VSMC增殖的影響

2.2 心痛泰活性化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與“中藥-疾病-表型”共同靶點(diǎn)篩選的結(jié)果

通過(guò)TCMSP、TCMID、TCMIP等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共收集心痛泰中化合物905個(gè)：其中丹參202個(gè)、木香106個(gè)、郁金222個(gè)、枳殼17個(gè)、三七119個(gè)、山楂32個(gè)、川芎189個(gè)、葛根18個(gè)；初步篩選后得出心痛泰有效高活性化合物：丹參65個(gè)、木香6個(gè)、郁金15個(gè)、枳殼5個(gè)、三七8個(gè)、山楂6個(gè)、川芎7個(gè)、葛根4個(gè)。通過(guò)STP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)心痛泰中活性化合物的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩出心痛泰中丹參、木香、郁金、枳殼、三七、山楂、川芎、葛根共741個(gè)靶點(diǎn)。通過(guò)GC數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，收集得到動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)共4063個(gè)。通過(guò)GC數(shù)據(jù)庫(kù)，收集得到“細(xì)胞凋亡”的12493個(gè)表型靶點(diǎn)。使用BG數(shù)據(jù)庫(kù)提取“中藥（心痛泰活性化合物）-疾?。▌?dòng)脈粥樣硬化）-表型（細(xì)胞凋亡）”相交集的共同靶點(diǎn)，共460個(gè)。

2.3 共同靶點(diǎn)關(guān)鍵基因篩選及蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的結(jié)果

共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，使用String數(shù)據(jù)庫(kù)及Cytoscape軟件，對(duì)心痛泰、動(dòng)脈粥樣硬化和細(xì)胞凋亡共同靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，得出PPI網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)采用PPI網(wǎng)絡(luò)圖亞網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，整合Degree、Betweenness、Closeness三種算法得到的基因，取三者并集，計(jì)算得出16個(gè)關(guān)鍵基因，排名前10的基因如下：AKT、TNF、VEGF、SRC、IL1β、EGFR、STAT3、JUN、HSP90AA1、Caspase-3。

2.4 共同靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析

KEGG富集于171條信號(hào)通路，主要富集于PI3K/Akt信號(hào)通路、HIF-1α信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、腫瘤相關(guān)通路、Ras信號(hào)通路等，結(jié)果繪制成火山圖，見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)與心痛泰化合成分與細(xì)胞凋亡（圖中apoptosis）和動(dòng)脈粥樣硬化（兔中fluid stress and atherosclerosis）密切相關(guān)。

圖2 KEGG富集分析結(jié)果

對(duì)KEGG富集分析的主要3條通路構(gòu)建“靶點(diǎn)-KEGG”弦圖，如圖3?？梢?jiàn)與心痛泰化合成分以及細(xì)胞凋亡相關(guān)的通路主要集中在PI3K/Akt（圖中紅色部分）和HIF-1α（圖中綠色部分）。

圖3 “靶點(diǎn)-KEGG”弦圖

2.5 心痛泰含藥血清對(duì)各組VSMC凋亡情況的比較

分別采用TUNEL法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組VSMC凋亡。在TUNEL檢測(cè)中，各組細(xì)胞分別采用DAPI、TMR染色，正常VSMC細(xì)胞核DAPI染色呈藍(lán)染，凋亡VSMC的細(xì)胞核TMR染色呈紅染。空白血清組DAPI藍(lán)染的細(xì)胞較多，TMR紅染的細(xì)胞很少，提示常規(guī)培養(yǎng)模式下，空白血清組僅有極少量的VSMC凋亡；模型組DAPI藍(lán)染的細(xì)胞減少，TMR紅染的細(xì)胞顯著增加，提示模型組的VSMC凋亡明顯增多；與模型組比較，20%心痛泰中劑量含藥血清組（以下簡(jiǎn)稱心痛泰含藥血清組）、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組的DAPI藍(lán)染的細(xì)胞顯著較多，TMR紅染的細(xì)胞明顯減少，提示心痛泰含藥血清和LY294002干預(yù)后，VSMC的凋亡明顯減輕；與空白組比，模型組VSMC凋亡陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯升高；與模型組比，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組的VSMC凋亡陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與心痛泰含藥血清組比，心痛泰含藥血清+LY294002組的VSMC凋亡陽(yáng)性細(xì)胞百分比無(wú)顯著差異（P＞0.05），如圖4、圖5。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示，與空白血清組比較，模型組VSMC的早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組VSMC的早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與心痛泰含藥血清組比，心痛泰含藥血清+LY294002組的VSMC早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。如圖6、圖7。

圖4 TUNEL法檢測(cè)心痛泰含藥血清對(duì)VSMC凋亡的影響（X200）

圖5 TUNEL法檢測(cè)心痛泰含藥血清對(duì)VSMC凋亡率的影響

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心痛泰含藥血清對(duì)VSMC凋亡率的影響

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心痛泰含藥血清對(duì)VSMC凋亡率的影響

2.6 心痛泰含藥血清對(duì)各組VSMC中PI3K、Akt、HIF-1α、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)的影響

與空白血清組比較，模型組PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與心痛泰含藥血清組比，心痛泰含藥血清+LY294002組的PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。歸一化處理的數(shù)據(jù)做成柱狀圖，見(jiàn)圖8。

圖8 心痛泰含藥血清對(duì)各組VSMC中PI3K/Akt/HIF-1α通路mRNA表達(dá)的影響

2.7 心痛泰含藥血清對(duì)各組VSMC中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白定量的影響

與空白血清組比較，模型組VSMC中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組VSMC中的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白表達(dá)減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。與心痛泰含藥血清組比，心痛泰含藥血清+LY294002組的PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖9、圖10。

圖9 心痛泰含藥血清對(duì)VSMC中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表達(dá)的影響

圖10 心痛泰含藥血清對(duì)VSMC中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表達(dá)的影響

2.8 心痛泰含藥血清對(duì)各組VSMC中α-SMA熒光含量的影響

免疫熒光染色顯示，與空白血清組比較，模型組VSMC中α-SMA熒光含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組VSMC中α-SMA熒光含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與心痛泰含藥血清組比，心痛泰含藥血清+LY294002組VSMC中α-SMA熒光含量無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖11、圖12。

圖11 心痛泰含藥血清對(duì)各組VSMC中α-SMA熒光含量的影響（×400）

圖12 心痛泰含藥血清對(duì)VSMC中α-SMA平均熒光強(qiáng)度的影響

3 討論

冠心病急性冠脈綜合征患者的動(dòng)脈內(nèi)存在較多的易損斑塊（Vulnerable plaque，VP），VP致病的機(jī)制是纖維帽變薄導(dǎo)致斑塊破裂出血、阻塞管腔，引起急性心肌梗塞[16]。纖維帽由增殖的VSMC和細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）構(gòu)成，VSMC凋亡可導(dǎo)致纖維帽變薄，顯著推動(dòng)了易損斑塊的進(jìn)展，主要表現(xiàn)為晚期斑塊的破裂[17]。VSMC一方面是纖維帽的骨架細(xì)胞，參與纖維帽的構(gòu)成，另一方面VSMC在炎癥介質(zhì)的刺激下，可合成Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維、促進(jìn)彈力蛋白的分泌，膠原纖維和彈力蛋白可起到穩(wěn)定纖維帽的作用[18]。晚期斑塊中的VSMC凋亡增多可導(dǎo)致VSMC減少，膠原纖維和彈力蛋白和合成減少，致使纖維帽變薄，其肩部極易破裂[19]。Clarke等[20]的研究發(fā)現(xiàn)：ApoE-/-小鼠模型中，VSMC凋亡可導(dǎo)致斑塊的纖維帽變薄、膠原和基質(zhì)丟失、細(xì)胞碎片堆積和內(nèi)膜炎癥等現(xiàn)象。斑塊破裂后，在凝血因子Ⅴ和Ⅶ的影響下，凋亡的VSMC可通過(guò)暴露在其表面的磷脂酰絲氨酸（產(chǎn)生凝血酶的底物）直接生成血栓[21]，臨床上表現(xiàn)為急性冠狀動(dòng)脈綜合征。急性冠脈綜合征患者的動(dòng)脈斑塊中VSMC凋亡率較高，凋亡的VSMC在血管壁內(nèi)聚集，釋放大量的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)和繼發(fā)性壞死，致使易損斑塊的壞死核心不斷擴(kuò)大[22-23]。機(jī)制圖見(jiàn)圖13。

圖13 VSMC凋亡導(dǎo)致易損斑塊纖維帽破裂的機(jī)制

動(dòng)脈硬化易損斑塊常見(jiàn)于冠心病、急性心肌梗塞、腦梗塞，因此中醫(yī)學(xué)中，易損斑塊屬于“胸痹”、“真心痛”、“缺血性中風(fēng)”、“脈痹”等范疇。病機(jī)以肝、脾、腎虧虛為本，痰濁、血瘀為標(biāo)，其中，脾虛生痰是痰瘀互結(jié)病機(jī)的根源，脾虛失運(yùn)，氣血生化無(wú)源則新生血管無(wú)以穩(wěn)固[24]。中醫(yī)認(rèn)為過(guò)食肥甘厚味，損傷脾胃，脾失健運(yùn)、脾虛生痰，痰濁凝聚，沉積于動(dòng)脈內(nèi)膜則發(fā)為粥樣斑塊[25]。文獻(xiàn)回顧表明，中醫(yī)藥對(duì)于易損斑塊中的VSMC凋亡具有抑制作用[26]。本研究的中藥復(fù)方為心痛泰，心痛泰由丹參、川芎、三七、郁金、山楂、枳殼、葛根、木香等中藥組成。其中，丹參、川芎共為君藥，具有活血化瘀之功效；枳殼、木香、葛根，升清降濁，可助脾運(yùn)氣、助心行血；三七、郁金，行氣活血祛瘀；山楂消積化滯。全方有理氣化痰、活血祛瘀之效。課題組的心痛泰前期基礎(chǔ)扎實(shí)，且前期研究已證實(shí)，心痛泰可下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1，減輕斑塊中VSMC周圍膠原纖維的分解，增加纖維帽的穩(wěn)定性，從而穩(wěn)定易損斑塊[7]。

磷酯酰肌醇激酶（PI3K）家族是細(xì)胞調(diào)節(jié)具第二信使特征脂類衍生物生成的重要催化酶，直接影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，具有增加VSMC凋亡、促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的作用[27]。PI3K/Akt/HIF-1α信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，PI3K激活催化產(chǎn)生PIP3，PIP3可以與下游的信號(hào)分子Akt結(jié)合，Akt可被PDK1和PDK2磷酸化而激活，磷酸化的Akt可調(diào)控多種病理生理過(guò)程，例如促進(jìn)蛋白合成和抑制細(xì)胞凋亡[28]。抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可減輕動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡[29]。HIF-1α是缺氧誘導(dǎo)因子，在缺氧的條件下可調(diào)控多種基因的表達(dá)。臨床研究表明，血清HIF-1α水平的升高與急性心肌梗塞的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后有密切的關(guān)系[30]。凋亡是一種細(xì)胞程序化死亡的形式，可通過(guò)內(nèi)源性或外源性兩種途徑實(shí)現(xiàn)。同型半胱氨酸蛋白酶家族（Caspase）和Bcl-2家族是凋亡的主要調(diào)控因子，不論內(nèi)源性或是外源性凋亡途徑的激活均可由Caspase家族介導(dǎo)，且Caspase-3為大多數(shù)凋亡途徑的執(zhí)行蛋白，Caspase-3的激活可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)研究表明，模型大鼠血管中層VSMC凋亡時(shí)，Caspase-3的蛋白表達(dá)明顯增多[31]。

本研究以VSMC為研究對(duì)象，采用生物信息學(xué)方法初步篩查出與心痛泰、動(dòng)脈硬化和VSMC凋亡的相關(guān)基因和通路，再采用體外研究的方法，探索心痛泰含藥血清抑制PI3K/Akt/HIF-1α信號(hào)通路及凋亡相關(guān)因子的表達(dá)情況，從分子生物學(xué)水平證實(shí)心痛泰對(duì)易損斑塊中VSMC凋亡的具體作用機(jī)制。本研究結(jié)果提示，ox-LDL可模擬易損斑塊中VSMC凋亡的細(xì)胞模型，模型細(xì)胞的VSMC凋亡數(shù)量和凋亡率顯著增加。CCK8法篩選出心痛泰作用于實(shí)驗(yàn)兔VSMC的最佳含藥血清為20%中濃度含藥血清。與模型組相比，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組的斑塊內(nèi)PI3K/Akt/HIF-1α通路的基因與蛋白表達(dá)降低，其下游的凋亡相關(guān)因子caspase-3、caspase-9的表達(dá)明顯下降。TUNEL染色顯示，與模型組相比，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組的VSMC凋亡陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯減少。流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果表明，與模型組相比，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組的早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均下降；與心痛泰含藥血清組相比，心痛泰含藥血清+LY294002組改善VSMC凋亡的效果無(wú)明顯差異，本次研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)心痛泰含藥血清與LY294002疊加使用能產(chǎn)生協(xié)同抗凋亡效果，分析原因可能是在本研究中，心痛泰含藥血清和LY294002均已達(dá)最大抗VSMC凋亡作用，疊加使用并不優(yōu)于單一含藥血清和單一LY294002的抗凋亡的效果，說(shuō)明心痛泰含藥血清可能具有LY294002的類似作用，通過(guò)抑制PI3K/Akt/HIF-1α通路來(lái)減輕兔VSMC凋亡。

綜上，心痛泰含藥血清可通過(guò)抑制PI3K/Akt/HIF-1α通路及caspase-3、caspase-9從而減輕ox-LDL誘導(dǎo)的VSMC的凋亡，有助于維持VSMC結(jié)構(gòu)和功能，這可能是心痛泰穩(wěn)定斑塊纖維帽的潛在機(jī)制之一，為心痛泰穩(wěn)定易損斑塊提供了體外研究依據(jù)。然而，本研究尚有不足之處，例如需進(jìn)一步完善心痛泰含藥血清的質(zhì)譜分析，研究心痛泰對(duì)人體斑塊中的作用機(jī)制是否與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的作用機(jī)制相吻合等。