決明子水提物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用研究

閆志芳，任可樂，孟祥龍，李秀英

（山西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥與食品工程學(xué)院，中藥炮制山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 晉中 030619）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是肝臟相關(guān)疾病和肝病死亡的主要原因之一[1]。ALD早期表現(xiàn)為急性酒精性損傷，主要原因是短時(shí)間內(nèi)飲用的大量酒精。肝細(xì)胞在人體消化吸收代謝酒精時(shí)，產(chǎn)生大量的氧自由基和多種炎性介質(zhì)，這些物質(zhì)使肝臟的氧化還原反應(yīng)無法進(jìn)行，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，損害細(xì)胞膜，細(xì)胞器的功能受到限制，肝臟受到損傷[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療ALD需長期服用的保肝藥物會(huì)產(chǎn)生一定的耐藥性、藥源性疾病等不良反應(yīng)。

決明子為豆科植物鈍葉決明Cassia btusifoliaL.或決明（小決明）Cassia toraL.的干燥成熟種子，具有清熱明目，潤腸通便的作用。研究發(fā)現(xiàn)，決明子富含多種化學(xué)活性物質(zhì)，主要包括蒽醌類、脂肪酸類、黃酮類、多糖類、苷類等[3]，具有保肝[4]、降血壓[5]、降脂[6]、降糖[7]、抗氧化[8]等藥理作用。其中，水溶性物質(zhì)蒽醌類等被證實(shí)通過改善轉(zhuǎn)氨酶水平、抗炎、調(diào)節(jié)Nrf2介導(dǎo)的ERK/MAPK/JNK等信號(hào)通路等，緩解酒精引起的急性肝損傷[9-13]。

為研究決明子緩解酒精所致肝損傷，本文通過灌胃白酒建立小鼠急性酒精性肝損傷模型[14]，經(jīng)決明子水提物給藥后檢測(cè)小鼠血清及肝臟組織中生化指標(biāo)與血清炎性因子的變化，觀察肝臟病理組織病變程度，以明確決明子水提物對(duì)于肝臟的保護(hù)作用，并探討初步的作用機(jī)制，旨在為決明子進(jìn)一步開發(fā)與利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

決明子（北京同仁堂，產(chǎn)地安徽，批號(hào)：220216004），經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)張朔生教授鑒定為豆科植物鈍葉決明Cassia obtusifoliaL.或決明（小決明）Cassia toraL.的干燥成熟種子。白酒（42°，北京紅星）；水飛薊素（批號(hào)：C10742879，麥克林）；通用型組織固定液（批號(hào)：G1101，Servicebio）；油紅染液、蘇木素染液、分化液、返藍(lán)液、甘油明膠封片劑（Servicebio）；異丙醇（批號(hào)：80109218，國藥集團(tuán)）。

甘油三酯（TG，批號(hào)：20210819）、總膽固醇（TC，批號(hào)：20210530）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，批號(hào)：20200815）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST，批號(hào)：20210726）、丙二醛（MDA，批號(hào)：20200921）、谷胱甘肽（GSH，批號(hào)：20209717）（南京建成生物工程研究所）；腫瘤壞死因子（TNF-α，批號(hào)：202109），白介素1β（IL-1β，批號(hào)：202107）、白介素6（IL-6，批號(hào)：202106）（上海酶免生物）；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-20B高速冷凍離心機(jī)（中國上海安亭科學(xué)儀器廠）；AX224ZH/E十萬分之一電子天平（奧豪斯上海）；KZ-III-FP高速低溫組織研磨儀（武漢賽維爾）；SynergyHTX多功能酶標(biāo)儀（美國伯騰）；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；CRYOSTAR NX50冰凍切片機(jī)（Thermo）；LEICA 819切片刀（ 上海徠卡）；黏附載玻片（冰凍切片，白漆色帶，G6012-2，Servicebio）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠，雄性，體重15～25 g，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0011，合格證號(hào)：110324210102969025[斯貝福（北京）]。倫理批準(zhǔn)號(hào)：AWE202209002（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)）。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度25 ℃，濕度40 %～70 %的清潔級(jí)動(dòng)物房。

1.4 方法

1.4.1 決明子水提物的制備 稱取決明子200 g，加8倍量的水，浸泡1 h，再加熱回流提取2次，每次30 min，將提取液混合濃縮至200 ml（相當(dāng)于生藥1 g/ml），備用。

1.4.2 動(dòng)物分組、造模及給藥 參照文獻(xiàn)方法[15]，將60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，按體質(zhì)量高低，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性組、決明子水提物低、中、高劑量組（2.25，4.5，9 g/kg）（依據(jù)2020年版《中國藥典》，通過人臨床劑量換算成小鼠等效劑量，按照折合后劑量的3，9，18倍換算而得），每組10只。空白組與模型組灌胃等體積蒸餾水，陽性組灌胃水飛薊素（0.2 g/kg），其余各給藥組按照相應(yīng)劑量灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d。末次給藥9 h后，除空白組外其余各組均按照體質(zhì)量12 ml/kg一次性灌胃白酒（10 ml/kg），建立急性酒精性肝損傷模型。

1.4.3 血液和組織樣本采集 最后一次給藥結(jié)束后，乙醚麻醉，摘眼球取血，室溫靜置30 min，于3000 r/min離心15 min，得待測(cè)血清，放置于-80 ℃冰箱。分離取肝臟并稱重，部分肝臟固定于組織固定液中，其余肝臟置于-80 ℃冰箱。

1.4.4 體重變化及臟器指數(shù) 記錄60只小鼠體質(zhì)量每日的變化，計(jì)算小鼠日平均增重；解剖取新鮮肝臟，利用生理鹽水清洗干凈肝臟，置于濾紙上吸干水分后，稱重，計(jì)算肝臟的臟器指數(shù)。計(jì)算按式1、式2。

1.4.5 肝臟組織油紅O染色 取肝臟組織同一部位的組織做冰凍切片，經(jīng)生理鹽水清洗后，用4 %多聚甲醛溶液固定，冰凍切片，晾干，油紅染液浸染6～8 min。將切片停留3 s后依次浸入60 %異丙醇分化2次，各3 s和5 s，再依次浸入純水中浸洗2次，各10 s。取出切片，停留3 s后浸入蘇木素復(fù)染3～5 min，純水浸洗3次，各5，10，30 s。分化液（以 60 %酒精為溶劑）分化2～8 s，蒸餾水洗2次各10 s，返藍(lán)液返藍(lán)1 s，將切片輕輕浸入自來水中浸洗2次，各5 s和10 s，甘油明膠封片。在顯微鏡下觀察肝臟組織的形態(tài)學(xué)，并采集圖片[10]。

1.4.6 生化指標(biāo)檢測(cè) 參照試劑盒說明，檢測(cè)小鼠血清中TG、TC、ALT、AST、MDA含量以及肝臟組織中GSH的含量。

1.4.7 炎性因子水平的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

1.4.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用GraphPadPrism 8.0.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，以均數(shù)±方差（±s）表示為數(shù)據(jù)資料，組間比較以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

與空白組相比，模型組體質(zhì)量顯著降低，肝臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。體重降低表明酒精性肝損傷可能引起某些病理變化，引起小鼠食欲下降致體重增長減慢；肝臟指數(shù)顯著升高說明一次性大量飲酒使得肝臟受損，導(dǎo)致肝臟腫大。與模型組比較，陽性藥和決明子水提物高劑量組小鼠體質(zhì)量增長明顯，且能顯著降低肝臟指數(shù)（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果呈劑量依賴關(guān)系。表明決明子水提物可降低小鼠的肝臟指數(shù)，緩解酒精造成的肝臟腫脹問題（見圖1）。

圖1 決明子水提物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)、小鼠體質(zhì)量的影響（±s，n=10）

2.2 對(duì)急性酒精性肝損傷的小鼠肝臟病理影響

肝臟組織油紅O染色結(jié)果見圖2。由圖2可見，空白組小鼠肝組織未見脂肪顆粒堆積。模型組與空白組對(duì)比肝細(xì)胞體積增大，出現(xiàn)大量的不同程度的紅色脂滴聚集。與模型組相比，決明子水提物各組的脂滴聚集減少。結(jié)果表明，決明子水提物能減少急性酒精性肝損傷的小鼠體內(nèi)脂質(zhì)的累積。

圖2 決明子水提物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟的病理變化的影響（×200）

2.3 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清TG、TC含量的影響

與空白組相比，模型組小鼠TG、TC水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組相比，決明子水提物各劑量組TG、TC含量均有下降趨勢(shì)，陽性藥組與決明子水提物中、高劑量組TG、TC含量呈顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）（見圖3）。表明決明子水提物能有效降低急性酒精性肝損傷血清中的TC、TG水平，對(duì)急性酒精性肝損傷有一定的改善作用。

圖3 決明子水提物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠TG、TC含量的影響（±s，n=10）

2.4 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清氨基轉(zhuǎn)移酶水平ALT、AST含量的影響

與空白組相比，模型組小鼠ALT、AST兩種氨基轉(zhuǎn)移酶水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥組與決明子水提物各劑量組ALT含量均明顯下降（P＜0.01），且呈劑量依賴性；陽性藥組與決明子水提物中、高劑量組AST含量均明顯下降（P＜0.01）（見圖4）。結(jié)果表明，決明子水提物能顯著降低氨基酸轉(zhuǎn)移酶的水平。

圖4 決明子水提物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠AST、ALT含量的影響（±s，n=10）

2.5 對(duì)急性酒精肝損傷小鼠血清GSH含量的影響

與空白組相比，模型組小鼠GSH含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥組與決明子水提物中、高劑量組GSH含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）（見圖5）。結(jié)果表明，決明子水提物可提高機(jī)體抗氧化酶的活性，消除酒精代謝過程中產(chǎn)生過多自由基及其他損害物質(zhì)，從而減輕肝臟受損狀況。

圖5 決明子水提物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠GSH含量的影響（±s，n=10）

2.6 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟MDA含量的影響

與空白組相比，模型組小鼠MDA水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組相比，各劑量組均有不同程度的降低趨勢(shì)，陽性藥組與決明子水提物高劑量組MDA水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）（見圖6）。結(jié)果表明，決明子水提物可減緩代謝酒精過程中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對(duì)急性酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

圖6 決明子水提物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠MDA含量的影響（±s，n=10）

2.7 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響

與空白組相比，模型組顯著高于正常組（P＜0.01），表明酒精代謝過程中可導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞發(fā)生炎性損傷；與模型組相比，陽性藥組與決明子水提物高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）（見圖7）。結(jié)果表明，決明子水提物可抑制炎性因子水平，發(fā)揮其肝保護(hù)作用。

綜上，決明子水提物對(duì)酒精引起的酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與改善肝細(xì)胞代謝紊亂、降低脂質(zhì)代謝、提高機(jī)體抗氧化酶活性、抑制促炎細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)[16-26]。本研究為進(jìn)一步開發(fā)決明子水提物保肝等功能性產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)，下一步將探究決明子緩解急性酒精性肝損傷的通路和靶點(diǎn)。