余甘子對(duì)肥胖大鼠的安全性評(píng)價(jià)

木其爾，陳希民，張彧格，陳月曉*

1.北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所有限公司（北京 100069）；2.中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)營(yíng)養(yǎng)與保健食品分會(huì)（北京 100053）；3.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部（北京 100094）；4.北京市科學(xué)技術(shù)研究院生物技術(shù)與健康研究所（北京 100089）

余甘子（Phyllanthus emblica）也叫油甘子、滇橄欖、牛甘果及回甘子等，屬于大戟科葉下珠屬，是藥食兩用的傳統(tǒng)藥材[1]，作為一味重要的傳統(tǒng)民族藥被載入1974年版《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》，1978年版《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》和《中華人民共和國(guó)藥典》，被廣泛應(yīng)用于我國(guó)中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥及保健食品[2-3]。其主要用于治療感冒發(fā)熱、消化不良、慢性肝炎、高血壓、肥胖癥、熱性水腫和尿頻等[4]。余甘子含有豐富的多酚、沒(méi)食子酸、多糖等活性成分，作為抗氧化、護(hù)肝、降脂、降糖等功效物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用保健食品[5-12]。

酚類是余甘子關(guān)鍵生物活性成分，其結(jié)構(gòu)類型分為鞣質(zhì)類、酚酸類、黃酮類，具有心血管保護(hù)、抗腫瘤、抗炎、抑制氧化應(yīng)激等作用[13-15]?！侗静菥V目》中記載余甘子“久服輕身，延年生長(zhǎng)”，表明古人對(duì)余甘子的降脂減肥作用已有認(rèn)識(shí)。余甘子有效降低脂代謝紊亂模型大鼠和正常大鼠血中總膽固醇（TC）重增加指數(shù)，提高血中高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）占TC的比值[16]。陳曉蘭等[17]研究表明，余甘子能有效降低血中膽固醇和甘油三酯的含量，降低大鼠血中總膽固醇水平，提高高密度脂蛋白膽固醇水平，降低動(dòng)物體重增加指數(shù)，起到降脂減肥的作用，余甘子中的鞣質(zhì)[18-19]可顯著降低肥胖小鼠血脂及其肝臟脂肪病變程度，同時(shí)對(duì)脂肪合成酶FASN具有顯著的降低作用，表明余甘子對(duì)脂質(zhì)代謝具有一定的作用。裴河歡等[20]研究發(fā)現(xiàn)，余甘子果粉可有效降低高膽固醇飲食家兔血清中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）及TC含量，升高其血清中HDL-C含量，余甘子可有效調(diào)節(jié)家兔的脂代謝情況，降低其體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物含量，增強(qiáng)其機(jī)體的抗氧化功能，抑制其體內(nèi)ET-1基因的表達(dá)。補(bǔ)充余甘子提取物[21]可改善超重肥胖人群心血管危險(xiǎn)因素和血小板聚集。

余甘子作為藥食同源，與普通食品相比，一次攝入劑量有限，而中醫(yī)應(yīng)用或者保健食品應(yīng)用法規(guī)上并沒(méi)有相關(guān)規(guī)定限量要求。余甘子對(duì)肥胖的直接作用及其發(fā)揮有效作用的劑量缺乏系統(tǒng)研究數(shù)據(jù)[22]。因此通過(guò)肥胖動(dòng)物模型試驗(yàn)，探索余甘子提取物安全劑量的有效范圍，同時(shí)比較不同劑量余甘子提取物對(duì)肥胖動(dòng)物模型大鼠的干預(yù)作用，為余甘子食物或藥物應(yīng)用安全性提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

余甘子提取物（多酚17.33%、沒(méi)食子酸6.14%，西安三江生物工程有限公司）。

雄性SD大鼠[SPF級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)110324221103418647，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2020-0004，體重120±10 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司]；SD大鼠高脂飼料及普通維持飼料（北京華阜康生物科技股份有限公司）。

試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級(jí)屏障；光照12 h明暗交替；實(shí)驗(yàn)室溫度20.0～26.0 ℃；相對(duì)濕度范圍40%～70%；飲用純化水，群籠飼養(yǎng)（每籠5只），自由攝食攝水。

動(dòng)物倫理：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生所審理通過(guò)。

水合氯醛（南京金益柏生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及酶免指標(biāo)瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）；RNA提取液、Water Nuclease-Free、RT First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green qPCR Master Mix（None ROX）、引物（武漢塞維爾生物科技公司）；三氯甲烷、異丙醇、無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

METTLER TOLEDO電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；KZ-Ⅲ-FP低溫研磨儀（武漢塞維爾生物科技公司）；D3024R臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)（DragonLab公司）；CFX熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）；NanoDroP2000超微量分光光度計(jì)（Thermo公司）；ELx800光吸收酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰公司）；FBZ2001-uP-P標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型建立

動(dòng)物分組：60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組，即空白對(duì)照組（NC）10只、肥胖組（FC）50。

劑量設(shè)置：以3 g/d作為人體劑量，PE50、PE100、PE200組分別以人體劑量的50，100和200倍作為劑量，即余甘子大鼠劑量分別為2.5，5.0和10.0 g/kg。

空白對(duì)照組大鼠全程予以普通維持飼料喂養(yǎng)，肥胖組以高脂飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)2周后稱重，眼內(nèi)眥靜脈采血，分離血清，檢測(cè)血脂（TC、TG、HDL-C、LDL-C）水平，依據(jù)體重及血脂篩選水平一致40只大鼠，隨機(jī)分為4組，模型對(duì)照組（MC）、余甘子1組（PE50）、余甘子2組（PE100）、余甘子3組（PE200），每組10只。

大鼠各試驗(yàn)組按灌胃劑量20.0 mL/kg配制溶液，余甘子干預(yù)組分別給予余甘子提取物（2.5，5.0和10.0 g/kg）?？瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積純化水；PE200組每日2次，其余各組每日1次，連續(xù)給樣6周。給樣期間，每周稱重1次，并根據(jù)體重調(diào)整給樣量。

干預(yù)6周后，各組大鼠麻醉后取血，離心分離血清凍存，用于指標(biāo)檢測(cè)。解剖大鼠并取材，采集大鼠睪周脂肪、腎周脂肪，稱重記錄，而后置于-80 ℃條件下凍存，用于后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.2 樣本采集及指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 血清學(xué)指標(biāo)

末次干預(yù)后，大鼠水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血，按3 000 r/min離心10 min，分離血清，參考采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、瘦素、脂聯(lián)素和抵抗素水平。

1.3.2.2 脂肪系數(shù)

大鼠解剖，采集腎睪周脂肪、腎周脂肪，稱重。計(jì)算腎周脂肪系數(shù)、睪周脂肪系數(shù)分別為腎周脂肪質(zhì)量、睪周脂肪質(zhì)量與大鼠體重之比。

肝臟指標(biāo)檢測(cè)，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)肝臟TC、TG、HDL-C的水平。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素分析，組間兩兩比較是否齊性，方差齊用LSD分析，方差不齊用Dunnett’s T3分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義水平設(shè)定：P＜0.05表示顯著性差異，P＜0.01表示極顯著性差異，均可證明數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 余甘子提取物干預(yù)后動(dòng)物死亡情況

以人體劑量50，100和200倍余甘子提取物干預(yù)大鼠6周，余甘子3組（PE200）組大鼠死亡1只，對(duì)照組、模型組及其他干預(yù)組大鼠無(wú)死亡情況出現(xiàn)。PE200組大鼠死亡原因可能因?yàn)?00倍高劑量余甘子提取物對(duì)大鼠劑量超過(guò)大鼠可耐受劑量，或者余甘子提取物溶解度不足，PE200組每日需灌胃2次，頻繁操作對(duì)大鼠胃黏膜具有一定損傷作用，操作引起大鼠死亡。

2.2 余甘子提取物對(duì)體重和體脂的影響

造模后模型對(duì)照組（MC）、余甘子組的大鼠體重顯著高于正常對(duì)照組（NC）。干預(yù)第2周開(kāi)始，MC組大鼠體重顯著高于MC余甘子組（P＜0.05），表明50，100和200倍人體劑量余甘子干預(yù)對(duì)大鼠肥胖具有顯著的抑制作用，見(jiàn)表1。對(duì)PE50、PE100和PE200進(jìn)行組間比較發(fā)現(xiàn)，大鼠體重在各組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），肥胖大鼠抑制作用與不同水平的余甘子的劑量間無(wú)顯著相關(guān)。

高脂飼料喂養(yǎng)條件下，MC組睪周脂肪和腎周脂肪重量均顯著增加（P＜0.05），與其相比PE50、PE100和PE200干預(yù)組大鼠睪和腎周脂肪重量均顯著下降（P＜0.05），表明余甘子可有效抑制大鼠體內(nèi)脂肪的蓄積。對(duì)照組、PE50、PE100和PE200干預(yù)組大鼠腎周脂肪系數(shù)和睪周脂肪系數(shù)無(wú)顯著差異，主要因在高脂飼料喂養(yǎng)條件下，大鼠體內(nèi)脂肪重量增加的同時(shí)其體重也增加，從而未表現(xiàn)出脂肪系數(shù)差異。PE50、PE100和PE200組間比較結(jié)果顯示，100倍人體劑量余甘子干預(yù)后，大鼠睪和腎周脂肪質(zhì)量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，這與余甘子干預(yù)后大鼠體重較低相關(guān)，見(jiàn)表2。

表2 余甘子提取物對(duì)大鼠脂肪系數(shù)和肝臟系數(shù)的影響 單位：g

MC組肝臟重量顯著高于NC組；PE50、PE100和PE200干預(yù)組大鼠肝臟質(zhì)量和肝臟系數(shù)均顯著下降（P＜0.05），高劑量的余甘子可顯著減少脂肪在肝臟中的蓄積，見(jiàn)表2。

2.3 余甘子提取物對(duì)血清學(xué)指標(biāo)的影響

2.3.1 TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的影響

造模后，MC組大鼠血脂TC、HDL-C和LDL-C均顯著升高（P＜0.05）。余甘子干預(yù)后，TC和TG均顯著降低（P＜0.05），且隨著劑量增加呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢(shì)；余甘子對(duì)LDL-C具有降低作用，但未呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)圖1。

圖1 余甘子提取物對(duì)大鼠血清學(xué)指標(biāo)的影響

2.3.2 對(duì)血清瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素的影響

瘦素是脂肪組織分泌的激素[23]，在血清中的含量和動(dòng)物脂肪組織的大小呈正比。MC組瘦素顯著高于NC組（P＜0.05）；相比于MC組，高劑量的余甘子干預(yù)后，血清瘦素水平顯著降低（P＜0.05）。

脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的內(nèi)源性生物活性多肽，是胰島素增敏激素[24]。MC組脂聯(lián)素顯著高于NC組（P＜0.05），脂肪增加過(guò)程中脂聯(lián)素分泌水平增加，對(duì)脂肪代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。余甘子干預(yù)后，PE50組脂聯(lián)素顯著高于NC組，高脂飲食促進(jìn)脂聯(lián)素的分泌；余甘子組與MC組無(wú)顯著差異，表明余甘子對(duì)脂聯(lián)素的調(diào)節(jié)作用較為有限。

抵抗素由脂肪細(xì)胞分泌，降低其對(duì)胰島素的敏感性[25]。MC組血清抵抗素顯著高于NC組（P＜0.05），脂肪增加過(guò)程中抵抗素分泌水平增加，對(duì)脂肪代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。余甘子組抵抗素顯著高于NC組，但低于MC組（P＜0.05）。高脂飲食促進(jìn)抵抗素的分泌，但余甘子對(duì)抵抗素分泌具有一定抑制作用，見(jiàn)表3。

表3 余甘子提取物對(duì)大鼠血清學(xué)的影響（）單位：mmol/L

表3 余甘子提取物對(duì)大鼠血清學(xué)的影響（）單位：mmol/L

組別瘦素脂聯(lián)素抵抗素NC1.61±0.372.94±0.565.52±0.83 MC2.96±0.52a3.54±0.60a9.32±0.65a PE502.07±0.72b3.73±0.52a7.99±1.56ab PE1002.58±0.89a3.27±0.577.84±1.55ab PE2002.21±0.79b3.47±0.867.54±1.25abimages/BZ_339_1358_941_2138_980.png

表4 余甘子提取物對(duì)大鼠肝臟內(nèi)MDA、SOD、ALT、AST、AKP的影響

2.4 余甘子提取物對(duì)各組大鼠肝臟指標(biāo)的影響

2.4.1 對(duì)肝臟內(nèi)MDA、SOD、ALT、AST、AKP的影響

丙二醛MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，MC組肝臟MDA顯著高于NC組（P＜0.05），高脂飲食促進(jìn)肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。高劑量余甘子干預(yù)后，大鼠MDA顯著降低，SOD顯著增高（P＜0.05），余甘子通過(guò)促進(jìn)SOD合成作用，清除或抑制脂肪過(guò)氧化。組間比較發(fā)現(xiàn)，PE200組MDA水平最低，SOD水平最高。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT是急性肝細(xì)胞損傷的敏感標(biāo)志，谷草轉(zhuǎn)氨酶AST與堿性磷酸酶APE升高則提示肝臟實(shí)質(zhì)廣泛損傷[26]。結(jié)果表明，與MC組比較，余甘子干預(yù)后肝臟AST和APE水平均降低，尤其是ALT水平顯著降低（P＜0.05），余甘子提取物對(duì)脂肪蓄積或脂質(zhì)過(guò)氧化引起的肝臟損傷均有保護(hù)作用。

2.4.2 余甘子提取物對(duì)肝臟內(nèi)TC、TG、LDL-C水平的影響

肝臟脂質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果表明，MC組大鼠TC和TG顯著升高（P＜0.05），與MC組比較，余甘子組TC、TG及LDL-C均顯著降低（P＜0.05），余甘子具有降低肝臟脂質(zhì)的作用。組間比較結(jié)果顯示，PE50、PE100和PE200組大鼠肝臟脂質(zhì)無(wú)差異，見(jiàn)圖2。

圖2 余甘子提取物對(duì)肝臟TC、TG、LDL-C水平的影響

3 結(jié)論

通過(guò)肥胖動(dòng)物模型試驗(yàn)，探索余甘子對(duì)肥胖大鼠的安全性評(píng)價(jià)。對(duì)血清及肝臟指標(biāo)檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)其對(duì)機(jī)體的毒害作用，表明最高200倍人體劑量屬于動(dòng)物安全劑量。50，100和200倍人體劑量余甘子干預(yù)對(duì)大鼠肥胖具有顯著的抑制作用，不同干預(yù)劑量之間無(wú)顯著差異。余甘子干預(yù)后大鼠體重和血脂均呈現(xiàn)降低，血清及肝臟指標(biāo)均具有明顯改善，說(shuō)明余甘子具有減重作用，而且不同劑量減肥效果一致。