指紋圖譜在煙草行業(yè)中應(yīng)用

周沫希，呂祥敏，敬婧，易虹宇，張玲玲，唐游*

重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司（重慶 400060）

煙草作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，是生產(chǎn)香煙的主要原料。從煙草農(nóng)作物到成品香煙需要經(jīng)過(guò)育種、栽培、制絲、卷接和包裝等工序，而指紋圖譜技術(shù)作為一種現(xiàn)代化的鑒定分析手段，其應(yīng)用貫穿香煙生產(chǎn)的全部過(guò)程。如在煙草作物種質(zhì)資源鑒定領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的DNA指紋圖譜[1-2]，以及在煙草制品成分分析和質(zhì)量控制等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用色譜指紋圖譜[3]或光譜指紋圖譜[4]等。

指紋圖譜主要是指某些具有復(fù)雜成分的物質(zhì)、有機(jī)體的核酸或蛋白質(zhì)等經(jīng)過(guò)特殊處理之后，采用一定的分析手段，獲得能夠表征其化學(xué)特征的圖譜[5]；又因特定物質(zhì)所含成分往往固定，獲得圖譜通常具有獨(dú)特性，與指紋具有唯一性的特征類似，固稱之為指紋圖譜。指紋圖譜主要被應(yīng)用于中藥領(lǐng)域，作為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制的重要手段[6-7]，其應(yīng)用范圍也擴(kuò)展到煙草生產(chǎn)領(lǐng)域，且逐漸成為煙草行業(yè)的主流分析技術(shù)之一[8]。對(duì)指紋圖譜在煙草生產(chǎn)過(guò)程中的應(yīng)用進(jìn)行介紹，以期該技術(shù)能為煙草的現(xiàn)代化生產(chǎn)提供參考。

1 在煙草育種領(lǐng)域的應(yīng)用

煙草作物的品種直接影響其產(chǎn)品的質(zhì)量，因此，鑒定并培育優(yōu)良的煙草品種能直接改善產(chǎn)品的質(zhì)量。傳統(tǒng)的植物品種鑒定主要是通過(guò)觀察其形態(tài)，但該方法準(zhǔn)確性較差。已發(fā)展多種分子生物學(xué)檢測(cè)手段如核酸測(cè)序[9]、DNA指紋圖譜等，其鑒定結(jié)果高度的準(zhǔn)確性使這些技術(shù)逐漸成為主流的鑒定方法。其中，又以DNA指紋圖譜操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確率高而應(yīng)用廣泛[10]。

DNA指紋圖譜是指利用DNA探針雜交技術(shù)，或者以待鑒定物種基因組為模板進(jìn)行特定的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），通過(guò)電泳或者測(cè)序，獲得不同長(zhǎng)度DNA產(chǎn)物組成的條帶圖譜或者序列信息圖譜，這種圖譜極少會(huì)有2個(gè)個(gè)體完全相同，因此被稱為“DNA指紋”。該技術(shù)的個(gè)體特異性使其被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)[11]。親子鑒定[12]及家譜和醫(yī)學(xué)研究近些年也被應(yīng)用于動(dòng)物學(xué)、植物學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的動(dòng)物和植物種群研究[13-14]。根據(jù)檢測(cè)方式和引物設(shè)計(jì)的差異，主要分為片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）[15-16]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）[17]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）[18-19]、序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）[20]、重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增（simple sequence repeats，SSR）[21]、簡(jiǎn)單序列間重復(fù)（inter-simple sequence repeats，ISSR）[22-23]，以及基于測(cè)序技術(shù)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）指紋圖譜[24-25]等。DNA指紋圖譜的一般檢測(cè)流程如圖1（A）所示。Lin等[26]以皺葉煙草和長(zhǎng)花煙草的雜交二代為研究對(duì)象，檢測(cè)到69個(gè)RFLP位點(diǎn)和102個(gè)RAPD位點(diǎn)，由此構(gòu)建2種煙草的遺傳連鎖圖，揭示2種煙草在進(jìn)化過(guò)程種發(fā)生基因重組且該過(guò)程伴隨著特定類別的DNA序列的獲得或丟失。Ren等[27]通過(guò)AFLP的方法對(duì)46個(gè)栽培煙草品系和7個(gè)野生煙草物種進(jìn)行遺傳變異程度的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)栽培煙草品系之間存在的遺傳多態(tài)性有限，而野生煙草物種之間的遺傳多態(tài)性比栽培品系之間的更豐富。對(duì)野生和栽培煙草的AFLP圖譜進(jìn)行配對(duì)比較表明，栽培煙草中存在的多態(tài)性條帶至少可以在3個(gè)野生祖先物種中的一個(gè)中找到，這些結(jié)果加強(qiáng)對(duì)煙草起源的了解。胡重怡等[28]利用ISSR標(biāo)記的方法，對(duì)貴州的12個(gè)地方品種（系）及5個(gè)主要種植品種進(jìn)行區(qū)分，篩選出9條引物能擴(kuò)增獲得顯著的多肽性，可將17個(gè)品種（系）區(qū)分開(kāi)，顯示該方法在煙草品系鑒定上很強(qiáng)的實(shí)用性。He等[1]利用270對(duì)SSR候選引物對(duì)烤煙標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中91對(duì)出現(xiàn)清晰的擴(kuò)增條帶，并從中篩選出48對(duì)SSR引物構(gòu)建33個(gè)烤煙標(biāo)準(zhǔn)品種的遺傳指紋圖譜，建立基于SSR指紋圖譜的烤煙新品種鑒定技術(shù)。采用RAPD指紋圖譜對(duì)孟加拉邦的11份煙草種質(zhì)的親緣關(guān)系進(jìn)行評(píng)價(jià)[29]，利用該方法可將親緣關(guān)系較近的煙草種質(zhì)進(jìn)行有效區(qū)分。王琰琰等[30]利用SNP核心標(biāo)記對(duì)我國(guó)現(xiàn)有的220份雪茄煙資源進(jìn)行指紋圖譜繪制，為雪茄煙的育種提供寶貴的借鑒資源。

圖1 指紋圖譜檢測(cè)的一般流程

此外，DNA指紋圖譜在煙草病蟲(chóng)害防治領(lǐng)域也有一定應(yīng)用。郭生云等[31]利用RAPD指紋圖譜分析篩選出2種分別與煙草赤星病和煙草黑脛病抗性基因連鎖的標(biāo)記；劉國(guó)祥等[32]利用SSR指紋圖譜技術(shù)對(duì)30份野生煙種質(zhì)進(jìn)行抗病性基因鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種質(zhì)在抗黑脛病、青枯病、煙草花葉病、黃瓜花葉病和馬鈴薯Y病等常見(jiàn)病害的優(yōu)異基因。這些研究為煙草質(zhì)量性狀選擇提供有效借鑒。

2 在煙草產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)的應(yīng)用

煙草中所含化合物成分復(fù)雜，從煙葉中鑒定出的化學(xué)成分已超出6 000種，煙葉中化學(xué)成分的組成與含量決定其卷煙制品的品質(zhì)。此外，由煙草燃燒產(chǎn)生的煙氣除了含有煙草的某些化學(xué)組分，燃燒所發(fā)生化學(xué)反應(yīng)賦予煙氣更復(fù)雜的成分組成，直接決定香煙的香味與口感。針對(duì)煙葉與煙氣的分析，通常僅針對(duì)少部分主要的成分，以此進(jìn)行煙草質(zhì)量控制與品質(zhì)評(píng)價(jià)，主要成分能基本評(píng)判煙草的品質(zhì)，但對(duì)于同種煙草的不同批次區(qū)分，該方式往往力有未逮。因此，針對(duì)煙草成分特征進(jìn)行精細(xì)刻畫(huà)表征的技術(shù)亟待進(jìn)步，而以指紋圖譜為代表的精確表征方法在煙草分析領(lǐng)域正快速發(fā)展。

在成分分析檢測(cè)領(lǐng)域的指紋圖譜主要是指光譜或者色譜指紋圖譜，其中光譜指紋圖譜又根據(jù)光源區(qū)分為紫外光譜、紅外光譜、熒光光譜、核磁共振光譜以及拉曼光譜等。色譜指紋圖譜根據(jù)色譜類型又分為薄層色譜、液相色譜和氣象色譜等。其中，薄層色譜具有重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)單快速等特點(diǎn)，但由于其精度較差，需要結(jié)合其他儀器對(duì)薄層板上的斑點(diǎn)進(jìn)行再次檢測(cè)，因此在煙草行業(yè)應(yīng)用不多。光譜和色譜指紋圖譜的一般檢測(cè)流程如圖1（B）所示。

紫外光譜是指分子外層價(jià)電子吸收紫外光后發(fā)生躍遷所產(chǎn)生，主要是由化合物中共軛結(jié)構(gòu)決定的。利用紫外光譜可對(duì)物質(zhì)成分和含量進(jìn)行檢測(cè)，其可操作性強(qiáng)，成本低，在化學(xué)分析領(lǐng)域廣泛使用，其缺點(diǎn)是無(wú)法有效區(qū)分吸光度相近的物質(zhì)，因此會(huì)結(jié)合其他檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用，如紫外-可見(jiàn)光譜技術(shù)[33]。關(guān)麗芬[34]利用多種溶劑對(duì)煙葉樣品進(jìn)行萃取，獲得煙葉醇化前后的紫外光譜組指紋圖譜，以此判斷煙葉的醇化度。該方法有效避免單一紫外光譜需要進(jìn)行繁瑣的溶劑選擇，同時(shí)更全面描繪樣品特征，也可應(yīng)用于原料或產(chǎn)品倉(cāng)儲(chǔ)質(zhì)量評(píng)價(jià)領(lǐng)域。紅外光譜主要用于研究化合物中特定的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)[35]，其檢測(cè)過(guò)程快速，且重復(fù)性好，但無(wú)法進(jìn)行精確定量，多用于鑒別物質(zhì)的化學(xué)成分，如在食品或者中藥領(lǐng)域區(qū)分材料的真假[5]，在煙草領(lǐng)域也有所應(yīng)用。謝有超等[36]利用近紅外光譜繪制貴州中煙生產(chǎn)的10種卷煙煙絲的指紋圖譜，結(jié)合機(jī)器深度學(xué)習(xí)技術(shù)，構(gòu)建卷煙品牌的識(shí)別模型，該研究也可應(yīng)用于卷煙的真?zhèn)伪鎰e。

液相色譜具有分離性能良好、重現(xiàn)性好、靈敏度高等特點(diǎn)在指紋圖譜繪制方面應(yīng)用頗多[37-38]。張雙雙[39]利用高效液相色譜對(duì)15批不同產(chǎn)地的烤煙樣品進(jìn)行指紋圖譜繪制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15批樣品在主要化學(xué)成分類型上基本一致，但在含量上表現(xiàn)較大差異，可能是煙草生長(zhǎng)環(huán)境的差異造成的。唐徐紅等[40]利用高效液相色譜分析技術(shù)對(duì)云南典型烤煙進(jìn)行研究，建立基于液相色譜的指紋圖譜技術(shù)規(guī)程及指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)現(xiàn)在任意時(shí)段根據(jù)需求提取烤煙指紋圖譜的特征峰，并建立煙堿、總糖及糖堿比等煙草品質(zhì)指標(biāo)與指紋圖譜的回歸模型。氣相色譜在揮發(fā)性物質(zhì)鑒定方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)[41]，這也使該技術(shù)在煙草分析領(lǐng)域占據(jù)主導(dǎo)地位，該技術(shù)是煙草領(lǐng)域構(gòu)建指紋圖譜的主要方法之一[42]。余苓等[43]開(kāi)發(fā)利用硅烷化氣相色譜對(duì)卷煙煙絲樣品進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)獲得的指紋圖譜進(jìn)行降維處理分析，利用該方法可有效判斷不同生產(chǎn)工藝對(duì)卷煙制品質(zhì)量的影響，并能區(qū)分產(chǎn)品中的異常品。廖堃等[44]運(yùn)用固相微萃取及氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)建立卷煙制品中揮發(fā)性與半揮發(fā)性成分的指紋圖譜，并通過(guò)正品與假冒香煙之間圖譜的對(duì)比，揭示兩者之間的成分差異，利用該技術(shù)能有效辨別香煙樣品的真?zhèn)巍?/p>

3 在香精香料評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

卷煙的配料配方是煙草企業(yè)的核心，而香精香料作為卷煙生產(chǎn)的重要配料之一，其添加修飾卷煙的口味，決定卷煙的風(fēng)格特點(diǎn)。煙用香精香料來(lái)源于天然產(chǎn)物或者化學(xué)合成，經(jīng)過(guò)組合調(diào)配制成，因此煙用香精香料組成成分復(fù)雜。對(duì)其進(jìn)行有效的質(zhì)量控制也是該領(lǐng)域的重點(diǎn)與難點(diǎn)，對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)主要依賴于評(píng)香師的人工品析，該方法往往存在較強(qiáng)的主觀性；或采用常規(guī)的理化指標(biāo)進(jìn)行簡(jiǎn)單檢測(cè)分析，無(wú)法實(shí)現(xiàn)精確控制?；谏V的指紋圖譜作為一種能反映煙用香精香料組分含量整體分布特征的技術(shù)，在香精香料化學(xué)分析領(lǐng)域逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位。

王鈞等[45]就色譜指紋圖譜的概念做了詳細(xì)闡述，認(rèn)為色譜指紋圖譜反映的是香精香料的整體質(zhì)量信息，體現(xiàn)樣品的整體性和數(shù)學(xué)模糊性，說(shuō)明色譜指紋圖譜進(jìn)行香精香料質(zhì)量控制的一般步驟及該方法的有效性。楊蕊等[46]利用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)對(duì)調(diào)配后的香精進(jìn)行成分剖析，通過(guò)該方法可以準(zhǔn)確判斷候選香原料是否在該香精中添加，實(shí)現(xiàn)在混合物中對(duì)混合物進(jìn)行定量分析，利用該技術(shù)可以輔助調(diào)香師進(jìn)行香精調(diào)配與仿香。王平等[47]采取同時(shí)蒸餾萃取和氣相色譜法技術(shù)對(duì)12個(gè)來(lái)自于不同生產(chǎn)批次的香精香料進(jìn)行分析并繪制指紋圖譜，通過(guò)對(duì)指紋圖譜的相似性分析可以明顯區(qū)分香精香料與煙葉提取物的差異。除了利用色譜指紋圖譜進(jìn)行香精香料的評(píng)價(jià)，Xu等[48]以金納米薄膜為基材，利用表面增強(qiáng)拉曼光譜指紋圖譜對(duì)卷煙的香精質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，利用該方法結(jié)合主成分分析可以輕松區(qū)分卷煙調(diào)味中所使用的香精類型。

4 指紋圖譜的常用分析方法

在獲得多個(gè)樣品的指紋圖譜后，需要對(duì)樣品間的共性與差異進(jìn)行分析，通常采用的方法有化學(xué)模式識(shí)別及相似度評(píng)價(jià)等方法。這類分析方法多用于中藥材及食品領(lǐng)域的指紋圖譜分析，用于解析樣品中的化學(xué)成分。僅就常用于與煙草分析領(lǐng)域的相關(guān)的幾種方法做簡(jiǎn)要介紹，如主成分分析法、偏最小二乘法、聚類分析法及相似度評(píng)價(jià)等。

通常主成分分析法作為一種無(wú)監(jiān)督的化學(xué)模式識(shí)別方法，不需要預(yù)先了解樣本的先驗(yàn)信息，通常用于樣本的區(qū)分，這種指紋圖譜分析方法在煙草分析領(lǐng)域使用廣泛。其原理是利用正交變化將多個(gè)變量簡(jiǎn)化為少數(shù)綜合性變量，并利用綜合性變量代表樣本的突出信息。該方法在面對(duì)處理多個(gè)變量時(shí)可從眾多指標(biāo)中合理地選出保留樣本絕大部分信息的幾個(gè)指標(biāo)，減少指標(biāo)選擇的工作量。王平等[47]對(duì)獲得的煙草香精色譜指紋圖譜進(jìn)行主成分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前3項(xiàng)主成分能解釋矩陣方差的93%。王佳俊等[49]對(duì)分批收集的3種煙用香精進(jìn)行紅外指紋圖譜繪制，并對(duì)獲得的指紋圖譜進(jìn)行主成分分析及馬氏距離法分類建模，利用該模型可以實(shí)現(xiàn)香精配制過(guò)程種質(zhì)量的多元統(tǒng)計(jì)過(guò)程控制，實(shí)現(xiàn)對(duì)香精的整體監(jiān)控。偏最小二乘法是一種監(jiān)督模式的化學(xué)識(shí)別方法，該方法需要一些已知類型的樣本作為訓(xùn)練集來(lái)構(gòu)建鑒別模型，并利用該模型推測(cè)檢測(cè)樣本的歸屬性。Hou等[50]利用頂空固相微萃取及質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)構(gòu)建香精的質(zhì)譜指紋圖譜，并利用偏最小二乘法分析構(gòu)建能預(yù)測(cè)樣品屬性的離子標(biāo)記物模型，通過(guò)這一方法可以識(shí)別并監(jiān)控香精的質(zhì)量。

聚類分析法可將樣品分為幾組，組內(nèi)的樣品表現(xiàn)出較高的一致性，而組間的樣品差異性較大。湯曉東等[51]結(jié)合氣相色譜對(duì)煙絲裂解產(chǎn)物進(jìn)行分析，并利用聚類分析與主成分分析建立卷煙評(píng)價(jià)模型，通過(guò)聚類分組可以準(zhǔn)確識(shí)別區(qū)分4個(gè)不同品牌的香煙。相似度分析多用于評(píng)價(jià)個(gè)體間的差異大小，常用方法有夾角余弦法、歐式距離法和相關(guān)系數(shù)法等。夾角余弦法是將指紋圖譜看成多維空間內(nèi)的向量，通過(guò)比較樣品指紋圖譜特征向量與共有標(biāo)準(zhǔn)向量之間的夾角余弦值，以判別樣品的相似度。歐氏距離則是對(duì)圖譜中的每個(gè)特征向量與該向量的共有均值模式向量差值的平方進(jìn)行求和，求平方根得到的一個(gè)值，該值可以反映樣品間的相似程度。相關(guān)系數(shù)法也是將樣品的特征向量與共有模式均值向量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的相關(guān)系數(shù)計(jì)算來(lái)比較樣本與樣本之間的相似程度。王小龍等[52]對(duì)紅塔山品牌不同生產(chǎn)點(diǎn)卷煙煙絲樣品的揮發(fā)性與半揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定，并獲得其化學(xué)指紋圖譜，通過(guò)歐氏距離分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)生產(chǎn)點(diǎn)的樣品間存在明顯差異，利用該分析方法能有效區(qū)分樣品的生產(chǎn)批次。李希強(qiáng)等[53]通過(guò)夾角余弦與歐氏距離2種方法評(píng)價(jià)不同批次煙用香精的HPLC指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)歐氏距離相較于夾角余弦能更有效反映樣本中成分的含量變化，而2種方法結(jié)合使用可以更加快速便捷地判別香精的質(zhì)量穩(wěn)定性；對(duì)3種方法對(duì)煙用香精UPLC指紋圖譜的判別進(jìn)行評(píng)價(jià)[54]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者都能一定程度反映香精的質(zhì)量改變，夾角余弦和相關(guān)系數(shù)在表征上比較相似，但在濃度變化比較小時(shí)表現(xiàn)不夠明顯，而歐氏距離能更靈敏地反映香精種類和濃度的變化。

5 展望

指紋圖譜作為一種能反映樣本整體特征的表征手段，其所含信息的豐富性更加適應(yīng)現(xiàn)代化生產(chǎn)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量精確把控這一特點(diǎn)。指紋圖譜貫穿煙草生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，就指紋圖譜在煙草領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，對(duì)煙草生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化制訂及質(zhì)量控制提供一定參考。關(guān)于指紋圖譜在煙草領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展應(yīng)用可從幾個(gè)方面進(jìn)行深入探索。

一是針對(duì)樣品獲取指紋圖譜所采用前處理方式大相徑庭，因此不同的研究獲得的圖譜數(shù)據(jù)往往無(wú)法進(jìn)行共享或互相比較，缺乏有效的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范，這無(wú)疑會(huì)導(dǎo)致無(wú)意義的重復(fù)以及資源的浪費(fèi)，因此可以嘗試建立標(biāo)準(zhǔn)化的規(guī)程，規(guī)范數(shù)據(jù)獲取過(guò)程，從而使煙草生產(chǎn)體系更加健全完善。

二是現(xiàn)階段指紋圖譜數(shù)據(jù)的獲取往往會(huì)結(jié)合測(cè)序、色譜、質(zhì)譜或其他光譜儀，大多需要對(duì)樣品進(jìn)行繁瑣的前處理過(guò)程，這使圖譜數(shù)據(jù)獲得的成本增加，因此簡(jiǎn)化樣品前處理過(guò)程也非常有必要。

三是現(xiàn)代化的煙草生產(chǎn)過(guò)程往往規(guī)模龐大，而對(duì)單個(gè)樣品或少數(shù)樣品進(jìn)行指紋圖譜數(shù)據(jù)獲取顯然無(wú)法滿足生產(chǎn)需求，因此高通量的指紋圖譜獲取技術(shù)也亟待發(fā)展。

6 結(jié)語(yǔ)

近些年，指紋圖譜技術(shù)在煙草領(lǐng)域的應(yīng)用取得了良好的效果，包括DNA指紋圖譜、紫外光譜、紅外光譜、熒光光譜等，在種質(zhì)鑒定、質(zhì)量控制、產(chǎn)品評(píng)價(jià)等方面發(fā)揮了重要作用。但這些方法在具體應(yīng)用過(guò)程中也存在一定局限性，因此，應(yīng)結(jié)合具體情況，因情制宜地選擇合適的指紋圖譜技術(shù)，以獲得更可靠的分析結(jié)果。同時(shí)，其他領(lǐng)域的新興技術(shù)近些年也取得了巨大發(fā)展，緊跟這些技術(shù)并將其應(yīng)用于煙草領(lǐng)域?qū)煵菪袠I(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義，需要我們時(shí)刻關(guān)注。