花楸原花青素保存條件優(yōu)化及其抗氧化性研究

高思琦，吳越，沈雪，趙福陽，李嘉沂，藏小丹*

牡丹江醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院（牡丹江 157011）

黑果腺肋花楸，又名黑色石楠、不老莓、野櫻莓，是一種落葉叢狀灌木，屬于薔薇科澀石楠屬，原產(chǎn)于北美大湖區(qū)東北部到阿帕拉契山脈上部山地沼澤之間[1]。其果實富含多酚和花青素，是生產(chǎn)功能性食品的理想原料之一[2]。該植物因其促進健康的特性而備受歡迎，其果實提取物有助于治療多種疾病，如癌癥、糖尿病和心腦血管疾病等。因此提取自黑果腺肋花楸的物質(zhì)被廣泛應(yīng)用于歐美地區(qū)的醫(yī)藥和食品工業(yè)。1990年代起，我國開始引進黑果腺肋花楸，用于食品加工與有效成分的保健品研發(fā)，使其具有很高的藥用保健價值[2]。2018年，國家衛(wèi)生健康委員會公告將黑果腺肋花楸作為新食品原料。因花青素具有強大的抗氧化特性，可帶來各種健康益處，因此被列為許多慢性疾病的保護劑[3]。且與已有原料提取花青素的組成相比，黑果腺肋花楸花青素提取物種花色苷種類比較單一，均屬矢車菊家族花色苷，更有利于分離出單體[4]。然而，隨著時間、溫度等變化，黑果腺肋花楸原花青素保存率將會降低，因此，如何在不同環(huán)境下最大程度地保持黑果腺肋花楸原花青素的穩(wěn)定性和抗氧化性成為一個不可避免的問題。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸干（通化市譚小六商貿(mào)有限責(zé)任公司）；藍莓干（伊春市鑫旺山特產(chǎn)品開發(fā)有限公司）；抗壞血酸（天津市致遠化學(xué)試劑有限公司）；花青素標(biāo)準(zhǔn)品（合肥千盛生物科技有限公司）；香草醛（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（1, 1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）：上海麥克林生化科技有限公司；過氧化氫溶液（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；無水乙醇（哈爾濱市化工試劑廠）；三氯乙酸、三氯化鐵、氯化鈉（天津市登峰化學(xué)試劑廠）；水楊酸、甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸亞鐵（天津市恒興化學(xué)化學(xué)試劑制造有限公司）；鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉（天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200DE超聲清洗儀（昆山市超聲儀器公司）；SN-TDL-40D離心機（上海尚儀精密儀器有限公司）；LX-FA2004電子天平（上海力辰儀器科技有限公司）；723N分光光度計（上海精密儀器有限公司）；LC-WB-6恒溫水浴鍋（上海力辰儀器科技有限公司）；BCD-254冰箱（博西家用電器有限公司）。

2 方法

2.1 花青素的提取與測定

2.1.1 提取

參考Teng等[5]和Taghavi等[6]的方法并根據(jù)實際操作改進。在三角燒瓶中準(zhǔn)確稱取10 g的黑果腺肋花楸和藍莓干粉，加入1%的HCl酸化的70%乙醇，并在避光條件下恒溫于超聲微波協(xié)同萃取儀中按照超聲時間40 min、超聲功率300 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶30（g/mL）進行提取。待提取液按4 000 r/min離心15 min后，收集上清液，使用酸性乙醇將其定容至50 mL，即可得到提取液。

2.1.2 測定

采用張欣[7]的方法。精密稱取50 mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至50 mL棕色容量瓶中，超聲30 s，得到1 mg/mL的原花青素母液。使用移液槍分別準(zhǔn)確吸取0，1.2，2.4，3.6，4.8和6.0 mL的母液定容至10 mL棕色容量瓶中，稀釋10倍后得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。接著，分別移取10倍稀釋后的各濃度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液進行百倍稀釋。最后，將分別移取1 mL 100倍稀釋后的各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到10 mL棕色離心管中，加入2.5 mL 1%香草醛-甲醇溶液和2.5 mL 8%鹽酸-甲醇溶液，避光后在恒溫水浴器中加熱1 h，使用分光光度計在波長550 nm處測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 單因素試驗

2.2.1 花青素保存率的計算

參考吳春燕等[8]的方法并做調(diào)整。根據(jù)處理前后花青素溶液的吸光度差異計算不同條件下花青素保存率，按式（1）計算。

式中：Aλmax為最大吸光度；A0為初始吸光度。

2.2.2 pH對黑果腺肋花楸花青素穩(wěn)定性的影響

分別以0.2 mol/L HCl溶液和0.2 mol/L NaOH溶液將黑果腺肋花楸花青素溶液的pH調(diào)節(jié)至3，5，7，9和11，于4 ℃避光靜置。反應(yīng)1 h后，在550 nm波長處平行測定3次，取吸光度的平均值。

2.2.3 儲存溫度對黑果腺肋花楸花青素穩(wěn)定性的影響

為探究黑果腺肋花楸原花青素的最佳保存溫度，將溶液置于避光環(huán)境中，并在4，20，40，60和80 ℃的恒溫水浴中保存。反應(yīng)1 h后，在550 nm波長下進行3次平行測定，取其吸光度的平均值。

2.2.4 自然光照時間對黑果腺肋花楸花青素穩(wěn)定性的影響

將黑果腺肋花楸原花青素溶液置于室溫下，自然光照射1，2，3，24和48 h后取樣，在550 nm波長處平行測定3次，取其吸光度的平均值。

2.2.5 恒溫保存時間對黑果腺肋花楸花青素穩(wěn)定性的影響

將黑果腺肋花楸原花青素溶液置于水浴中恒溫于40 ℃避光保存反應(yīng)10，20，30，40，50和60 min后在550 nm波長處平行測定3次，取其吸光度的平均值。

2.2.6 空氣暴露時間對黑果腺肋花楸花青素穩(wěn)定性的影響

將花青素置于培養(yǎng)皿中，室溫避光保存10，30，60和120 min后取樣，在550 nm波長處平行測定3次，取其吸光度的平均值。

2.3 響應(yīng)面試驗

選用黑果腺肋花楸原花青素保存率為響應(yīng)值，溫度、恒溫保存時間、自然光照時間為響應(yīng)變量。應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化黑果腺肋花楸中原花青素的保存條件。試驗考察水平及因素見表1。

表1 響應(yīng)面考察因素與水平

2.4 抗氧化試驗

2.4.1 DPPH自由基清除能力

參考葉曉楠等[9]的方法并稍加改動。使用蒸餾水分別配制質(zhì)量濃度為0.25，0.5，0.75，1.0，2.0，3.0和4.0 mg/mL的黑果腺肋花楸和藍莓提取物樣品，以及VC溶液。從不同濃度樣品和VC溶液中各取1 mL，加入1 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，反應(yīng)完全后避光，在波長為517 nm處測定混合物的吸光度。DPPH清除率按式（2）計算。

式中：A0為空白對照；A1為樣品溶液吸收光度；A2為無水乙醇與樣品溶液吸收光度。

2.5 OH-清除能力

采用孫燕等[4]和趙彥巧等[10]的方法并稍加改動。用蒸餾水分別配制質(zhì)量濃度為0.25，0.5，0.75，1.0，2.0，3.0和4.0 mg/mL的黑果腺肋花楸、藍莓提取物樣品和VC溶液。在反應(yīng)體系中依次加入0.2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液和水楊酸-乙醇溶液，再加入0.4 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液、0.4 mL VC溶液和1.2 mL 6 mmol/L的雙氧水溶液，于37 ℃反應(yīng)1 h，反應(yīng)完全后在波長510 nm處測定混合物的吸光度。羥自由基清除率按式（3）計算。

式中：A0為空白對照的吸光度；A1為加樣品的吸光度；A2為無顯色劑H2O2的吸光度。

2.5.1 Fe3+還原力測定

參考張欣[7]的方法并做調(diào)整。制備質(zhì)量濃度為0.25，0.5，0.75，1.0，2.0，3.0和4.0 mg/mL的黑果腺肋花楸、藍莓提取物和VC溶液。從不同濃度的樣品溶液和VC溶液中各取0.8 mL，加入pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.0 mL，在50 ℃條件下反應(yīng)20 min，冷卻，加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后按3 000 r/min離心5 min，取0.1 mL上清液，加入9.0 mL蒸餾水和0.9 mL 0.3% FeCl3溶液，反應(yīng)完全后在波長700 nm處測定混合物的吸光度。吸光度越大，樣品的還原力越大，以VC作為陽性對照。

2.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均進行3次重復(fù)，使用SPSS Statistics 27進行單因素分析，使用Graphpad Prism 2022和Design-Expert 13軟件對數(shù)據(jù)進行作圖和分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 原花青素含量的測定

3.1.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=1.413 69X+0.005 88，R2=0.999 5，在0～0.01 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.2 黑果腺肋花楸，藍莓提取物中原花青素含量的測定

根據(jù)2.1.1、2.1.2小節(jié)所述的方法，超聲微波協(xié)同處理40 min，設(shè)定超聲功率300 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶30（g/mL）提取藍莓和花楸的原花青素。經(jīng)100倍稀釋的黑果腺肋花楸提取液的吸光度為0.051，經(jīng)20倍稀釋的藍莓提取液的吸光度為0.042，帶入標(biāo)準(zhǔn)方程可算得花楸粗提取液中原花青素含量62.242 mg/g、藍莓粗提取液中原花青素含量12.306 4 mg/g。綜上所述，花楸中原花青素的含量約為藍莓的5倍。

3.2 單因素試驗

3.2.1 pH對花楸花青素穩(wěn)定性的影響

由圖2可知，黑果腺肋花楸原花青素在pH 3時吸光度最大，隨著pH接近7，吸光度的降低速度開始變緩，pH＞9后降低速度又開始隨著pH的增大而增加。且當(dāng)pH＜3時，黑果腺肋花楸原花青素呈現(xiàn)明亮的紅色，pH 7時溶液為紫色近乎透明，pH 9時呈現(xiàn)為青色，當(dāng)pH 11時溶液呈現(xiàn)出墨綠色。Silva等[11]用氰化物-3-氨基葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行光譜研究，確定了顏色變化依賴于pH的平衡。β-環(huán)羥化狀態(tài)和pH已經(jīng)被證明介導(dǎo)花青素降解為其酚酸和醛成分[12]。單糖花青素在pH＜2時以2-苯基苯并吡喃陽離子（AH+）的形式存在，在pH 4～5時花青素以醌型假堿（B）或查而酮（C）形式存在，此時其是無色的，pH＞6時候以醇型A存在，所以原花青素在不同的pH下呈現(xiàn)出不同的顏色[13]。

圖2 不同pH對花楸花青素穩(wěn)定性的影響

3.2.2 儲存溫度對花楸花青素穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，隨著溫度的上升，黑果腺肋花楸的保存率降低，60 ℃以上時，保存率變化率較大。天然色素在低溫或干燥狀態(tài)時，性質(zhì)一般較穩(wěn)定，加熱或高溫可加快變色反應(yīng)，尤其在加熱至沸點時易氧化褪色[14]。研究表明。20 ℃和40 ℃時?；苌镱伾４嫦鄬Ψ€(wěn)定，褪色程度略有變化，但在60 ℃時，?；苌锿噬裂杆偕仙霈F(xiàn)衰落[15]。在熱處理過程中，花青素由于其高反應(yīng)性而被降解，并且在水的存在下，鍵會被水解[16]。

圖3 溫度對原花青素保存率的影響

3.2.3 光照時間對花楸花青素穩(wěn)定性的影響

如圖4所示，隨著光照時間的增加，黑果腺肋原花青素保存率下降，3 h時出現(xiàn)明顯拐點，后下降速率加快。朱新貴等[16]的研究表明不同顏色的光對花青素破壞力不同，且在相同的光照強度下，藍光對色素的破壞速度最快，紅光最慢，各單色光對色素的破壞速度由大到小排序為藍光、白光、綠光、紫光、黃光、橙光、紅光。

圖4 光照時間對原花青素保存率的影響

3.2.4 恒溫保存時間對花楸花青素穩(wěn)定性的影響

如圖5所示，在40℃時，隨著時間的增加，保存率總體呈下降趨勢，60 min時保存率下降近20%?，F(xiàn)有研究表明，花青素受熱后降解速率加快，半衰期變短且符合熱力學(xué)第一公式，隨著加熱溫度的升高，時間的增多，花青素的降解加快[13]。

圖5 恒溫保存時間對原花青素保存率的影響

3.2.5 空氣中暴露時間對花楸花青素穩(wěn)定性的影響

如圖6所示，暴露于空氣中的黑果腺肋花楸原花青素在10～120 min內(nèi)，隨著時間的增加保存率逐漸降低，但變化較小。120 min與10 min時相比，保存率降低2.062%。

圖6 空氣中暴露時間對花楸花青素穩(wěn)定性的影響

3.2.6 對黑果腺肋花楸原花青素的穩(wěn)定性的單因素分析

對5個單因素進行單因素分析，結(jié)果如表2所示。

表2 單因素試驗方差分析結(jié)果

由表2單因素試驗方差分析結(jié)果可知，pH，溫度，恒溫保存時間對黑果腺肋花楸原花青素的保存率影響顯著（P＜0.05），自然光照時間對黑果腺肋花楸原花青素的保存率影響極其顯著（P＜0.01），空氣中暴露時間對黑果腺肋花楸原花青素的保存率影響不顯著（P＞0.05），因此，選擇溫度、光照時間、恒溫保存時間這三個關(guān)鍵因素進行響應(yīng)面試驗[17]。

3.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

3.3.1 響應(yīng)面結(jié)果與分析

應(yīng)用Box-Behnken建立三因素三水平的響應(yīng)優(yōu)化試驗[18]，結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

3.3.2 二項回歸方程擬合與方差分析

根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果擬合回歸方程：保存率=96.73+0.120 0A+0.275 0B-1.68C-1.67AB-1.88AC-2.84BC-3.49A2-1.38B2-4.03C。

方差分析結(jié)果如表4所示。回歸方程模型F=9.72，P=0.011 0＜0.05，說明該方程具有顯著性；失擬項F=9.13，P=0.100 3＞0.05，差異不顯著，說明此模型準(zhǔn)確度良好，存在誤差較小，二次模型合理。在此情況下，根據(jù)方差中F值，分析各因素對保存率的影響程度并排序。3個單因素對保存率的影響程度C＞B＞A，即恒溫保存時間＞自然光照時間＞溫度。且一次項C對黑果腺肋原花青素的保存具有顯著影響，是模型的重要參數(shù)，A和B對模型不顯著：二次項A2和C2對模型均具有極具顯著影響。

表4 回歸方程各項的方差分析

3.3.3 因素間的交互分析

使用Design-Expert 13軟件根據(jù)二次回歸方程繪制響應(yīng)圖，結(jié)果見圖7。響應(yīng)面坡峰的陡峭程度，表明交互因素對結(jié)果的影響程度。另外，等高線的形狀也顯示交互項對黑果腺肋花楸原花青素穩(wěn)定性的作用[19]。坡度越陡說明此項因素對響應(yīng)面的影響越大，表明兩兩交互作用對黑果腺肋花楸原花青素的穩(wěn)定性的影響越大[20]。

圖7 因素間的交互效應(yīng)分析

由圖7可知，兩變量交互作用對黑果腺肋花楸原花青素穩(wěn)定性均有顯著影響，且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，其中自然光照時間和恒溫保存時間的交互對原花青素穩(wěn)定性有顯著影響，與方差分析結(jié)果一致。

3.3.4 最佳穩(wěn)定性驗證

采用Design-Expert 13軟件分析預(yù)測，得出黑果腺肋花楸原花青素最佳保存條件：溫度4 ℃、自然光照時間149.56 min和恒溫保存時間16.18 min，在此條件下預(yù)測保存率為97.16%。在最佳參數(shù)和實際情況進行適當(dāng)調(diào)整后，保存溫度定為4 ℃，自然光照時間定為150 min，恒溫保存時間定為16 min。按照這一條件進行3次平行試驗，黑果腺肋花楸原花青素的保存率分別為96.63%，96.92%和97.61%，平均值為97.05%。與預(yù)測值相比，相對誤差為0.113%，t檢驗差異不顯著（P＜0.05）。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑果腺肋花楸原花青素保存穩(wěn)定性條件是可行的。

3.4 抗氧化性試驗

3.4.1 清除DPPH自由基試驗

如圖8所示，在質(zhì)量濃度0.25～4.00 mg/mL范圍內(nèi)，黑果腺肋花楸原花青素與VC清除DPPH自由基的能力存在顯著性差異（P＜0.05），藍莓原花青素與VC清除DPPH自由基能力存在顯著差異（P＜0.05），黑果腺肋花楸原花青素與藍莓原花青素清除DPPH自由基的能力存在顯著性差異（P＜0.05），且清除DPPH能力黑果腺肋花楸原花青素＞藍莓原花青素＞VC，均隨濃度的上升而上升。

圖8 DPPH自由基清除能力

3.4.2 OH-清除試驗

如圖9所示，在質(zhì)量濃度0.25～4.00 mg/mL范圍內(nèi)，黑果腺肋花楸原花青素、藍莓原花青素與VC清除DPPH自由基能力存在顯著性差異（P＞0.05），且均隨濃度的上升而上升，質(zhì)量濃度為1 mg/mL時達到拐點，后隨濃度上升，清除率幾乎不再變化，三者對羥自由基的清除效果相同。

圖9 OH-除能力

3.4.3 Fe3+還原能力

如圖10所示，在質(zhì)量濃度0.25～4.00 mg/mL范圍內(nèi)，黑果腺肋花楸原花青素、藍莓原花青素與VC的Fe3+還原能力均不存在顯著性差異（P＞0.05）。三者吸光度隨濃度上升而上升，1 mg/mL后增長幅度減少并逐漸趨于穩(wěn)定，且黑果腺肋花楸原花青素的Fe3+還原能力大于藍莓原花青素和VC。

圖10 Fe3+還原能力

4 結(jié)論

研究以黑果腺肋花楸果干為原材料，采用超聲波輔助萃取技術(shù)提取其中的原花青素成分。通過響應(yīng)面法優(yōu)化保存條件，檢測其中的抗氧化能力。結(jié)果表明：最佳保存條件為溫度4 ℃、自然光照時間15 min、恒溫保存時間16.18 min，保存率可達到97.16%（相對誤差僅有0.113%）。同時，研究以VC和藍莓做對照，對比了黑果腺肋原花青素的DPPH自由基、羥自由基清除能力和總還原力抗氧化指標(biāo)。結(jié)果顯示，黑果腺肋花楸原花青素在相同濃度和檢測條件下，其抗氧化能力總體高于VC和藍莓原花青素。這可以證明黑果腺肋花楸原花青素是一種優(yōu)秀的抗氧化和抗衰老物質(zhì)。

綜合來看，此次研究為黑果腺肋花楸原花青素未來在保健品、藥品、化妝品等領(lǐng)域的運用提供了重要的參考。