水解單寧酸脫除綠茶提取液中咖啡因的研究

范玉文，聶珂楠，李婷，王玉麗，吳正奇*

湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院（武漢 430068）

茶葉是世界性飲品，中國是世界茶葉生產(chǎn)和消費(fèi)的第一大國[1]。據(jù)中國茶葉流通協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)[2]，2022年我國茶園總面積320萬 hm2。根據(jù)加工方法的不同，茶葉可分為綠茶、紅茶、白茶、烏龍茶和普洱茶[3]，其中綠茶是主要的茶種[4]。根據(jù)研究顯示，綠茶中茶多酚15%～30%[5]，咖啡因（caffeine，CAF）2%～5%[6]，以茶氨酸為代表的氨基酸1%～2%[7]，茶多糖1%～5%[8]，水溶性果膠0.5%～1%[9]，可溶性灰分3%～4%[10]。在茶多酚中，以表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechingallate，EGCG）為代表的兒茶素（catechin）占比60%～80%，而EGCG占兒茶素的55%～70%[11]。綠茶為非年份茶，保存期的延長，其品質(zhì)、風(fēng)味和顏色會(huì)發(fā)生較快的劣變[12]。隨著飲茶人口持續(xù)減少，綠茶出現(xiàn)較嚴(yán)重的積壓[13]，因此，對(duì)綠茶的精深加工研究，擁有重要的意義。

中國和日本規(guī)定綠茶茶粉中咖啡因含量低于1%[14]。因?yàn)檫^量咖啡因?qū)θ梭w健康具有多方面的不利作用[15-16]，所以脫咖啡因技術(shù)尤為重要，方法主要包括超臨界流體脫除法[17-18]、熱水脫除法[19]、乳酸乙酯脫除法[20-21]和各種吸附法[22-24]。單寧酸包括水解單寧酸（也稱水解型單寧酸）和縮合單寧酸（也稱縮合型單寧酸）2種類型，其中縮合型單寧酸對(duì)人體有毒[25]，不能用于食品中。此次試驗(yàn)將利用咖啡因與水解單寧酸生成沉淀性的咖啡因-水解單寧酸復(fù)合物的性質(zhì)，脫除綠茶提取液中咖啡因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠茶（市售）。

色譜級(jí)乙酸（上海麥克林生化科技有限公司）；色譜級(jí)甲醇、色譜級(jí)乙腈、分析純乙醇、分析純氫氧化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；咖啡因（CAF）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（EC）和沒食子酸（GA）：上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104E/02型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；RJ-TGL-16G離心機(jī)（武漢遞熱愛生物科技有限公司）；84-1A型磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；200～1 000 μL大龍移液槍（大龍新創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；1 000～5 000 μL大龍移液槍（大龍新創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；Uitimate 3000型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 分析方法

1.3.1 CAF和EGCG等主要兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

測定方法參照侯丹[26]的方法。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：準(zhǔn)確稱量一定量CAF和EGCG標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制質(zhì)量濃度為2 000 μg/mL的CAF和EGCG水溶液，作為母液；分別吸取0.5，1，2.5和5 mL母液，加水定容至10 mL，得到100，200，500，1 000和2 000 μg/mL的CAF和EGCG溶液，混勻離心，過0.22 μm濾膜，待測。

測定方法：C18柱（5 μm，4.6 nm×250 mm），流動(dòng)相：A相為2%乙酸、B相為乙腈、C相為甲醇、D相為10%甲醇；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；在280 nm處檢測；柱溫為40 ℃；洗脫方式：B相由6.5%變化15%（0～16 min），再從15%變化25%（16～25 min），最后25%變化6.5%（25～30 min）。以標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積（mAU·min）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（500 μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 綠茶提取液中CAF和EGCG等主要兒茶素含量的測定

綠茶與水按1∶15質(zhì)量比混合，在80 ℃水浴中攪拌浸提0.5 h后，經(jīng)3層紗布過濾得粗濾的綠茶提取液，離心10 min（8 500 r/min），棄沉淀得上清液，按1.3.1的方法測定上清液中CAF和EGCG等主要兒茶素含量。

1.3.3 CAF脫除率、EGCG損失率和相對(duì)分離度的計(jì)算

根據(jù)式（1）～（3）計(jì)算CAF脫除率、EGCG損失率及相對(duì)分離度。

式中：X為原始綠茶提取液中咖啡因含量，μg；X0為水解單寧酸脫咖啡因處理后綠茶提取液中咖啡因含量，μg；Y為綠茶提取液中EGCG含量，μg；Y0為水解單寧酸脫咖啡因處理后綠茶提取液中EGCG含量，μg。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 水解單寧酸脫咖啡因的水解單寧酸溶液最佳添加比例的確定

取5份濃縮比1/3的綠茶濃縮液，水解單寧酸溶液（質(zhì)量濃度5%）添加比例（體積比）分別控制為綠茶濃縮液體積的5%，10%，15%，20%和25%，在pH 5.5（綠茶濃縮液的固有pH 5.5）和溫度25 ℃的條件下各攪拌10 min后，分別離心，取上清液，稀釋到原來的濃縮倍數(shù)，經(jīng)0.22 μm膜過濾，按照1.3.1～1.3.3的方法分別測定濾液中CAF、EGCG和其他兒茶素單品含量，計(jì)算CAF脫除率、兒茶素?fù)p失率和相對(duì)分離度。根據(jù)相對(duì)分離度，確定水解單寧酸脫咖啡因的水解單寧酸溶液最佳添加比例。

1.4.2 水解單寧酸脫咖啡因的最佳攪拌時(shí)間的確定

取5份濃縮比1/3的綠茶濃縮液，各加入1.4.1確定的最佳比例的水解單寧酸溶液，在pH 5.5和溫度25 ℃條件下，分別攪拌10，20，30，40和50 min后，分別離心，取上清液，稀釋到原來的倍數(shù)，經(jīng)0.22 μm膜過濾，按照1.3.1～1.3.3的方法分別測定濾液中CAF、EGCG和其他兒茶素單品含量，計(jì)算CAF脫除率、兒茶素?fù)p失率和相對(duì)分離度。根據(jù)相對(duì)分離度，確定水解單寧酸脫咖啡因的最佳攪拌時(shí)間。

1.4.3 水解單寧酸脫咖啡因的最佳溫度的確定

取5份濃縮比1/3的綠茶濃縮液，各加入1.4.1確定的最佳比例的水解單寧酸溶液，控制pH 5.5，分別在25，35，45，55和65下攪拌1.4.2確定的最佳攪拌時(shí)間后，分別離心，取上清液，稀釋到原來的倍數(shù)，經(jīng)0.22 μm膜過濾，按照1.3.1～1.3.3的方法分別測定濾液中CAF、EGCG和其他兒茶素單品的含量，計(jì)算CAF脫除率、兒茶素?fù)p失率和相對(duì)分離度。根據(jù)相對(duì)分離度，確定水解單寧酸脫咖啡因的最佳溫度。

1.4.4 水解單寧酸脫咖啡因的最佳pH的確定

取5份濃縮比1/3的綠茶濃縮液，各加入1.4.1確定的最佳比例的水解單寧酸溶液，pH分別控制為3.5，4.5，6.5和7.5，在1.4.3確定的最佳溫度下分別攪拌1.4.2確定的最佳攪拌時(shí)間后，分別離心，取上清液，稀釋到原來的倍數(shù)，經(jīng)0.22 μm膜過濾，按照1.3.1～1.3.3的方法分別測定濾液中CAF、EGCG和其他兒茶素單品的含量，計(jì)算CAF脫除率、兒茶素?fù)p失率和相對(duì)分離度。根據(jù)相對(duì)分離度，確定水解單寧酸脫咖啡因的最佳pH。

1.4.5 水解單寧酸脫咖啡因的綠茶提取液的最佳濃縮比的確定

取濃縮比分別為1/2，1/4，1/5和1/6的綠茶濃縮液，各1份，分別加入1.4.1確定的最佳比例的水解單寧酸溶液（按濃縮比作相應(yīng)的換算，即濃縮比1/2，1/4，1/5和1/6時(shí)，水解單寧酸溶液的添加比例分別為10%，20%，25%和30%），控制在1.4.4確定的最佳pH、1.4.3確定的最佳溫度下分別按1.4.2確定的最佳攪拌時(shí)間攪拌后，分別離心，取上清液，稀釋到原來倍數(shù)，經(jīng)0.22 μm膜過濾，按照1.3.1～1.3.3的方法分別測定濾液中CAF和EGCG含量，計(jì)算CAF脫除率、EGCG損失率和相對(duì)分離度。根據(jù)相對(duì)分離度，確定水解單寧酸脫咖啡因的綠茶提取液的最佳濃縮比。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠茶提取液中咖啡因和兒茶素含量的結(jié)果分析

綠茶提取液中兒茶素類物質(zhì)（GA、ECG、EGCG、EC和EGC）和CAF的含量見表1。結(jié)果表明，綠茶提取液兒茶素類物質(zhì)中，以EGCG含量最高，達(dá)5.012 mg/mL，占總兒茶素含量比例達(dá)52.3%，是綠茶提取液中主要的兒茶素，也是抗氧化活性最強(qiáng)的兒茶素。綠茶提取液中CAF含量較高，達(dá)1.503 mg/mL，相當(dāng)于EGCG含量的30.0%，占兒茶素總量的15.7%，所以有必要脫除咖啡因，以減少咖啡因的含量。在脫除綠茶提取液中CAF的同時(shí)，應(yīng)盡可能保留EGCG，提高相對(duì)分離度，減少EGCG損失。

表1 綠茶中咖啡因和兒茶素含量 單位：mg/mL

2.2 水解單寧酸溶液添加比例對(duì)CAF脫除率、EGCG損失率和相對(duì)分離度影響的結(jié)果分析

水解單寧酸溶液添加比例對(duì)CAF脫除率、EGCG損失率和相對(duì)分離度影響見圖1。結(jié)果表明，水解單寧酸添加比例的不同對(duì)CAF的脫除效果也不同，同時(shí)對(duì)EGCG的損失也有一定影響。CAF脫除率隨著水解單寧酸添加比例的增大呈現(xiàn)先上升后下降趨勢；EGCG損失率呈現(xiàn)先持續(xù)上升趨勢。水解單寧酸與綠茶提取液中咖啡因反應(yīng)時(shí)，水解單寧酸添加比例過小，只能與綠茶提取液中部分咖啡因形成沉淀性的單寧酸-咖啡因復(fù)合物，導(dǎo)致咖啡因的沉淀不充分和脫除率較低；隨著水解單寧酸添加比例的增大，咖啡因的脫除率也隨之增大，這是因?yàn)樵诜磻?yīng)過程中生成較多的沉淀性的單寧酸-咖啡因復(fù)合物，咖啡因的沉淀比較充分和脫除率較大。但是，水解單寧酸添加比例過大，由于水解單寧酸含有較多的酚羥基和羧基，呈現(xiàn)較強(qiáng)的酸性，過量水解單寧酸會(huì)與已形成沉淀的水解單寧酸-咖啡因復(fù)合物以氫鍵、配位鍵和離子鍵結(jié)合，生成可溶性的水解單寧酸-咖啡因-水解單寧酸復(fù)合物，使原本沉淀后的單寧酸-咖啡因復(fù)合物重新溶解，導(dǎo)致咖啡因的脫除率下降。同時(shí)，在反應(yīng)過程中過量的水解單寧酸也會(huì)與以EGCG為代表的兒茶素以氫鍵的方式聚合形成不溶性的水解單寧酸-兒茶素復(fù)合物，從而使EGCG的損失率增大，導(dǎo)致在咖啡因脫除率降低的同時(shí)，增大EGCG損失率。水解單寧酸溶液添加比例15%時(shí)，CAF脫除率為75%，EGCG損失率是21%，相對(duì)分離度達(dá)到最大，為3.2。因此，水解單寧酸脫咖啡因的水解單寧酸溶液最佳添加比例為15%。

2.3 攪拌時(shí)間對(duì)CAF脫除率、EGCG損失率和相對(duì)分離度影響的結(jié)果分析

攪拌時(shí)間對(duì)CAF脫除率、EGCG損失率和相對(duì)分離度影響見圖2。結(jié)果表明，隨著攪拌時(shí)間的增長，CAF脫除率呈現(xiàn)上升趨勢，EGCG損失率也隨著攪拌時(shí)間的增長呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢。攪拌時(shí)間的不同對(duì)CAF的脫除效果也不同，但CAF脫除率都在70%以上，同時(shí)對(duì)EGCG的損失也有一定影響。攪拌時(shí)間對(duì)咖啡因脫除率和EGCG損失率有一定影響，原因可能是攪拌時(shí)間的增加，會(huì)增多空氣中氧氣的溶入，加速以EGCG為代表的兒茶素的氧化和聚合，生成不溶性的沉淀，從而導(dǎo)致EGCG損失率增高。攪拌時(shí)間10～20 min時(shí)，EGCG損失率影響很小，但隨著時(shí)間的增長，EGCG損失率逐漸增大。常溫下增加攪拌時(shí)間也會(huì)使茶葉提取液中其他物質(zhì)與茶多酚形成沉淀[27]，也造成EGCG損失，導(dǎo)致EGCG損失率升高。攪拌時(shí)間20 min時(shí)，CAF脫除率87%，EGCG損失率32%，相對(duì)分離度達(dá)到最大，為5.2。因此，水解單寧酸脫咖啡因的最佳攪拌時(shí)間為20 min。

圖2 攪拌時(shí)間對(duì)咖啡因脫除率、兒茶素?fù)p失率和相對(duì)分離度的影響

2.4 溫度對(duì)CAF脫除率、EGCG損失率和相對(duì)分離度影響的結(jié)果分析

溫度對(duì)CAF脫除率、EGCG損失率和相對(duì)分離度影響見圖3。結(jié)果表明，CAF脫除率隨著溫度的增高呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，EGCG損失率隨著溫度的增高呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢。溫度的不同對(duì)CAF脫除效果影響較小，CAF脫除率都在80%以上，但對(duì)EGCG損失的影響較大。溫度對(duì)CAF脫除率影響不大，這是因?yàn)樗鈫螌幩?咖啡因復(fù)合物的溶解度不太隨溫度的升高而增大，同時(shí)溫度升高，有利于破壞咖啡因與EGCG通過配位鍵形成的“冷后渾”[28]，使咖啡因處于游離狀態(tài)。溫度25～35 ℃時(shí)，EGCG損失率不大，但是溫度35 ℃以上，EGCG損失率大幅增加，可能是由于溫度升高會(huì)加劇EGCG的氧化聚合生成不溶性的聚合物，此外，隨著溫度的升高，也加劇綠茶提取液中兒茶素與其他大分子物質(zhì)之間的聚合，形成不溶性的聚合物，進(jìn)一步促進(jìn)EGCG損失率的增加。溫度越高，兒茶素類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)在高溫下容易被破壞[29]，同時(shí)茶多酚越容易氧化。溫度35 ℃時(shí)，CAF脫除率87%，EGCG損失率34%，相對(duì)分離度達(dá)到最大，為5.1。因此，水解單寧酸脫咖啡因的最佳溫度為35 ℃。

2.5 pH對(duì)CAF脫除率、EGCG損失率和相對(duì)分離度影響的結(jié)果分析

pH對(duì)CAF脫除率、EGCG損失率和相對(duì)分離度影響見圖4。結(jié)果表明，pH的不同對(duì)CAF脫除率和EGCG損失率有一定影響。CAF脫除率隨著pH的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；EGCG損失率隨著pH的增大呈現(xiàn)上升趨勢。水解單寧酸與咖啡因形成復(fù)合物時(shí)存在適宜的pH，由于咖啡因是堿性物質(zhì)，pH太低時(shí)，少量的咖啡因會(huì)與低pH下過多的H+反應(yīng)，以易溶于水的咖啡因鹽酸鹽形式存在，不能夠與單寧酸形成不溶性的復(fù)合物。相反的，pH太高時(shí)，水解單寧酸的羧基或酚羥基被中和成陰離子，因此水解單寧酸無法提供足量的H+與咖啡因結(jié)合生成復(fù)合物沉淀，同時(shí)在堿性條件下EGCG上的酚羥基容易被堿氧化形成相應(yīng)的醌類的有色物質(zhì)，多酚物質(zhì)在堿性條件下容易氧化。pH 3.5～5.5時(shí)，CAF脫除率持續(xù)上升，但隨著pH的升高，CAF脫除率開始明顯的下降。pH 5.5時(shí)，CAF脫除率最高，為87%，EGCG損失率為30%，相對(duì)分離度達(dá)到最大，為5.4，說明在微酸性條件EGCG損失率低[30]。因此，水解單寧酸脫咖啡因的最佳pH為5.5。

圖4 pH對(duì)咖啡因脫除率、兒茶素?fù)p失率和相對(duì)分離度的影響

2.6 濃縮比對(duì)CAF脫除率、EGCG損失率和相對(duì)分離度影響的結(jié)果分析

濃縮比對(duì)CAF脫除率、EGCG損失率和相對(duì)分離度影響見圖5。結(jié)果表明，濃縮比對(duì)CAF脫除率、EGCG損失率和相對(duì)分離度具有不同的影響。濃縮比（濃縮倍數(shù)）1/2～1/4時(shí)，咖啡因脫除率和相對(duì)分離度隨濃縮比的增大而上升，而EGCG損失率呈現(xiàn)相對(duì)不變或波動(dòng)；濃縮比1/4～1/6時(shí)，咖啡因脫除率隨濃縮比的增大而下降，盡管EGCG損失率隨濃縮比的增大呈現(xiàn)出減小趨勢，但相對(duì)分離度隨濃縮比的增大表現(xiàn)較快降低的趨勢，也就是濃縮比太大，不利于EGCG的保留。這可能是由于隨著綠茶提取液濃縮比的增加，綠茶提取液濃度增大，濃縮液中茶多糖和果膠含量的增大導(dǎo)致綠茶提取液中黏度增大，濃度和黏度的增大，不利于水解單寧酸與咖啡因形成復(fù)合物，導(dǎo)致相對(duì)分離度的下降。同時(shí)由于濃縮液中含有金屬離子，隨著濃縮倍數(shù)的增大和濃度的增加，金屬離子和茶多糖也會(huì)與茶多酚形成沉淀，從而導(dǎo)致以EGCG為代表的兒茶素的損失率增大。濃縮比1/4時(shí)，CAF脫除率88%、EGCG損失率25%，相對(duì)分離度達(dá)到最大，為6.3。因此，水解單寧酸脫咖啡因的最佳濃縮比為1/4。

3 結(jié)論

根據(jù)水解單寧酸能專一性地與綠茶提取液中咖啡因生成沉淀性的咖啡因-水解單寧酸復(fù)合物的性質(zhì)，選擇性地脫除咖啡因和保留以EGCG為代表的兒茶素，以期達(dá)到制備無咖啡因或者低咖啡因含量的綠茶茶粉的目的。通過單因素試驗(yàn)，優(yōu)化水解單寧酸溶液脫除綠茶提取液中咖啡因和保留以EGCG為代表的兒茶素的適宜工藝參數(shù)，在水解單寧酸溶液添加比例為濃縮液體積的20%、攪拌時(shí)間20 min、溫度35 ℃、pH 5.5和濃縮比1/4條件下，咖啡因脫除率為88%，EGCG損失率為25%，相對(duì)分離度為6.3。由于水解單寧酸為天然的無毒物質(zhì)，而且具有抗寄生蟲、抗氧化、抗菌等多種生物活性，因此，試驗(yàn)結(jié)果具有一定應(yīng)用價(jià)值。今后可對(duì)水解單寧酸與咖啡因生成沉淀性的咖啡因-水解單寧酸復(fù)合物的機(jī)理、水解單寧酸與以EGCG為代表的兒茶素相互作用的機(jī)制和水解單寧酸脫除咖啡因工藝參數(shù)的多因素正交優(yōu)化等方面展開進(jìn)一步研究，以提高咖啡因脫除率，減小EGCG損失率，提高咖啡因與EGCG相對(duì)分離度。