超聲波輔助H2O2-VC降解人參多糖對其結(jié)構(gòu)特征與生物活性的影響

王 堯，李福蕊，羅 源，高佳坤，王麗巖，劉學(xué)軍

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130000）

多糖是分子質(zhì)量在數(shù)萬甚至數(shù)百萬道爾頓的高分子聚合物，普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物中[1]。由于多糖來源廣泛、副作用小，且具有抗腫瘤[2]、抗炎[3]、抗菌[4]、抗疲勞[5]、抗高血壓[6]、降血糖[7]和免疫調(diào)節(jié)[8]等活性功能，越來越受到人們的關(guān)注。多糖的生物活性與其分子質(zhì)量緊密相關(guān)，低分子質(zhì)量的多糖具有更好的生物活性，因此其在開發(fā)功能性食品和醫(yī)學(xué)應(yīng)用時(shí)備受關(guān)注。

人參（Panax ginsengC.A.Mey.）又稱黃精、地精、神草等，五加科人參屬多年生草本植物，是一種藥食同源的名貴藥材[9]。人參中含有多種有益健康的活性成分，包括人參皂苷、肽聚糖、多糖、含氮化合物、脂肪酸和酚類化合物等[10]。近年來，從人參中提取的多糖已被證明具有降血糖活性，Liu Wei等[11]從黨參殘?jiān)刑崛〖兓鲆环N中性多糖CERP1，對2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）小鼠有明顯的降血糖作用。然而，天然多糖的生物活性會(huì)受到其分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)特征和溶解度的影響[12]。比如，多糖較高的相對分子質(zhì)量和較差的溶解度會(huì)限制其在生物體內(nèi)發(fā)揮功能活性[13]。所以，有必要采用一種高效簡便的降解方法來提高人參多糖（ginseng polysaccharides，GPS）的生物活性功能。

多糖的降解方法包括物理法、化學(xué)法和生物法。物理方法（如超聲波、微波、輻射等）對設(shè)備要求較高，而且降解產(chǎn)物得率低?；瘜W(xué)方法（如酸、堿水解等）因其水解條件苛刻可能導(dǎo)致糖苷鍵裂解不足。生物方法（如酶水解、微生物發(fā)酵等）因其特異性，需要多種酶或者微生物組合來降解多糖，導(dǎo)致降解成本相對較高，無法在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用[14]。近年來，H2O2因其可產(chǎn)生大量的氧自由基（如·OH）、對原料無污染、反應(yīng)條件溫和的特性引起了人們的注意[15]。同時(shí)，低濃度的抗壞血酸（VC）可以產(chǎn)生羥自由基[16]，超聲波可以通過空化作用使氣泡大量形成和破裂，加速H2O2的分解，從而降解多糖[17]。目前關(guān)于超聲波輔助H2O2-VC降解方法制備人參降解多糖的研究還鮮見報(bào)道。因此，本研究對GPS進(jìn)行分離純化，并利用超聲波輔助H2O2-VC方法降解分離純化獲得的多糖組分GPS-1A，得到具有更高降血糖和抗氧化活性的低分子質(zhì)量多糖DGPS-1A，進(jìn)一步對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為GPS的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參購買于吉林長春長白山地區(qū)，經(jīng)鑒定為人工栽培長白山人參。人參經(jīng)過清洗干燥后進(jìn)行超微粉碎，過80 目篩，在95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇溶液中浸泡48 h后得到人參脫脂粉，烘干后于陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

苯酚、硫酸、葡萄糖、氯化鈉、氯仿、正丁醇、VC、硫酸亞鐵、H2O2、三氯乙酸 大連美侖生物技術(shù)有限公司；DEAE-纖維素-52、葡聚糖凝膠Sephadex G-100 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；半乳糖醛酸、牛血清白蛋白 北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍(lán) 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；溴化鉀、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、水楊酸 上海麥克林生化科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RHP-600高速多功能粉碎機(jī) 浙江榮浩工貿(mào)有限公司；HW.SY21-K電熱恒溫水浴鍋 北京市長風(fēng)儀器儀表公司；JY99-IIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；1100高效液相色譜儀、IC-5000離子色譜儀 美國Agilent公司；層析柱（32 mm×30 cm；16 mm×60 cm）大連美侖生物技術(shù)有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司；FD-80真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Mira4掃描電子顯微鏡 泰思肯（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人參粗多糖的提取

參考李先華[18]的方法提取人參粗多糖。準(zhǔn)確稱取100 g除脂人參粉末，用蒸餾水在料液比1∶30、提取時(shí)長3 h的條件下重復(fù)提取兩次，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將多糖提取液濃縮至原體積的1/10，加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液過夜，5 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀用蒸餾水復(fù)溶后加入Sevag試劑（V（正丁醇）∶V（氯仿）＝1∶4）進(jìn)行脫蛋白處理，重復(fù)多次，直至無明顯蛋白殘留。將溶液在4 ℃下透析48 h，冷凍干燥，得到人參粗多糖，命名為GPS，多糖得率按公式（1）計(jì)算。

1.3.2 GPS的分離純化

將GPS復(fù)溶后緩慢加入DEAE-纖維素-52層析柱（32 mm×30 cm），依次用0、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為2 mL/min，每10 mL收集一管。將GPS-1（GPS的主要組分）合并、透析、濃縮和凍干。將GPS-1加入葡聚糖凝膠Sephadex G-100（16 mm×60 cm）柱，用蒸餾水以0.2 mL/min的流速洗脫，收集洗脫液，每5 mL一管，根據(jù)峰值合并得到分離組分，命名為GPS-1A，將其冷凍干燥后于4 ℃保存。

1.3.3 人參降解多糖的制備

采用超聲波輔助H2O2-VC法對分離純化得到的多糖GPS-1A進(jìn)行降解，參考Xu Kaiqian等[19]的方法并稍作修改。根據(jù)本課題組前期得到的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行降解，配制4.2 mg/mL多糖溶液200 mL，加入10.3 mmol/L H2O2和10.3 mmol/L VC，在1 006 W超聲功率下降解2 h。降解后調(diào)節(jié)溶液pH值至中性，去離子水透析48 h（1 000 Da透析袋），減壓蒸餾濃縮后凍干得降解多糖，命名為DGPS-1A。

1.3.4 GPS的化學(xué)成分測定

通過苯酚-硫酸法[20]在490 nm波長處測定溶液中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以無水葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品。蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)通過考馬斯亮藍(lán)法[21]測定，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用咔唑-硫酸法[22]測定，以D-半乳糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.5 GPS的結(jié)構(gòu)表征

1.3.5.1 相對分子質(zhì)量的測定

采用高效凝膠滲透色譜測定多糖的相對分子質(zhì)量。將4.0 mg/mL樣品溶解在蒸餾水中并使用0.45 μm濾膜過濾。每次運(yùn)行注入10 μL樣品溶液。流動(dòng)相為0.05 mol/L Na2SO4溶液，流速為0.6 mL/min。使用不同分子質(zhì)量的葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.5.2 單糖組成測定

通過1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1,2-dihydro-5-methyl-2-phenyl-3H-pyrazol-3-one，PMP）衍生化和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定GPS和DGPS-1A的單糖組成。將5 mg樣品在105 ℃用4 mL三氟乙酸（2 mol/L）水解6 h。將殘留物重新溶解在4 mL甲醇中，反復(fù)干燥。將最終殘留物溶解在50 mL超純水中，使用0.22 μm濾膜過濾，并用離子色譜儀進(jìn)行分析。

1.3.5.3 傅里葉變換紅外光譜測定

將2 mg干燥樣品與200 mg溴化鉀粉末混合并壓制成片，在4 000～500 cm-1的范圍內(nèi)進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描。

1.3.5.4 核磁共振氫譜測定

將25.0 mg多糖樣品溶于0.5 mL D2O，并轉(zhuǎn)移到核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）管中。用光譜儀在室溫下獲得1D（1H和13C）NMR圖譜。主要參數(shù)設(shè)置如下：脈沖序列zgpg30（1H和13C）；延遲時(shí)間2 s，掃描頻率4 000～30 000 Hz；掃描次數(shù)60～100 000 次；采集時(shí)間0.5～1.5 s；測試溫度298 K。

1.3.5.5 掃描電子顯微鏡觀察

將干燥后的多糖置于鍍有金粉（100 nm厚）的鋁板上。用掃描電子顯微鏡觀察多糖的形態(tài)。

1.3.5.6 剛果紅和I2-KI實(shí)驗(yàn)

將2.0 mL剛果紅溶液（80 μmol/L）與2.0 mL多糖溶液（2 mg/mL）混合，加入一定量的氫氧化鈉，使氫氧化鈉的最終濃度在0～0.5 mol/L范圍內(nèi)，在室溫下反應(yīng)5 min，用紫外-可見分光光度計(jì)測定最大吸收波長（λmax）。

將8.0 mL I2-KI溶液（0.2%）與2.0 mL多糖溶液（2.0 mg/mL）混合，稀釋10 倍體積后用紫外-可見分光光度計(jì)在190～400 nm波長范圍內(nèi)測定混合物的吸光度。

1.3.6 GPS體外降血糖活性的測定

1.3.6.1α-葡萄糖苷酶抑制率測定

將40 μLα-葡萄糖苷酶溶液（0.2 U/mL，pH 6.8）加入到不同質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/mL）40 μL多糖溶液中，在37 ℃下孵育5 min后加入20 μL對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（4-nitrophenylβ-D-glucopyranoside，PNPG）（0.5 mmol/L，pH 6.8），37 ℃恒溫孵育30 min，加入150 μL碳酸鈉溶液（0.2 mol/L）終止反應(yīng)。在405 nm波長處測定吸光度，并用阿卡波糖作陽性對照。α-葡萄糖苷酶抑制率按公式（2）計(jì)算。

式中：A1為樣品溶液＋α-葡萄糖苷酶的吸光度；A0為樣品溶液＋0.1 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）的吸光度；A2為α-葡萄糖苷酶＋0.1 mol/L pH 6.8 PBS的吸光度。

1.3.6.2α-淀粉酶抑制率測定

在1 mL多糖溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/mL）中加入1.0 mLα-淀粉酶溶液（0.5 mg/mL，pH 6.6），然后加入1.0 mL淀粉溶液（0.01 g/mL），在37 ℃下反應(yīng)20 min，加入5 mL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑終止反應(yīng)，沸水浴10 min。在540 nm波長處測定吸光度，以阿卡波糖為陽性對照。α-淀粉酶抑制率按公式（3）計(jì)算。

式中：A1為樣品溶液＋α-淀粉酶的吸光度；A0為樣品溶液＋0.1 mol/L pH 6.8 PBS的吸光度；A2為α-淀粉酶＋0.1 mol/L pH 6.8 PBS的吸光度。

1.3.7 GPS體外抗氧化活性的測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力測定

將2 mL多糖溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/mL）與1 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L）混合，振蕩均勻后在室溫條件下黑暗中反應(yīng)30 min。以VC作為陽性對照，在517 nm波長處測定溶液的吸光度。根據(jù)公式（4）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A1為樣品溶液＋DPPH溶液的吸光度；A0為樣品溶液＋無水乙醇的吸光度；A2為蒸餾水＋DPPH溶液的吸光度。

1.3.7.2 羥自由基清除能力測定

將1 mL不同質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/mL）的多糖溶液分別與1 mL FeSO4溶液（9 mmol/L）和1 mL水楊酸溶液（9 mmol/L）振蕩均勻，然后迅速加入1 mL H2O2（8.8 mmol/L），在37 ℃下水浴30 min。以VC為陽性對照，在510 nm波長處測定溶液的吸光度。羥自由基清除率按公式（5）計(jì)算。

式中：A1為樣品溶液＋H2O2溶液的吸光度；A0為樣品溶液＋0.1 mol/L pH 6.8 PBS的吸光度；A2為蒸餾水＋H2O2的吸光度。

1.3.7.3 還原能力測定

將1 mL不同質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/mL）的多糖溶液分別與0.2 mol/L PBS（pH 6.6，2.5 mL）和2.5 mL鐵氰化鉀（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%）混合，在50 ℃下反應(yīng)20 min，冷卻至室溫后加入2.5 mL三氯乙酸（0.1 g/mL）終止反應(yīng)。將2.5 mL反應(yīng)溶液與2.5 mL去離子水以及0.5 mL三氯化鐵（0.001 g/mL）混合，在室溫下反應(yīng)10 min，以VC為陽性對照，在700 nm波長處測定溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，使用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析（以P＜0.05表示差異顯著），采用GraphPad Prism 8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GPS的分離純化及降解結(jié)果

采用水提醇沉法提取人參粗多糖GPS，其得率為12.46%（基于原料干質(zhì)量計(jì)算）。利用陰離子交換柱層析法對GPS進(jìn)行分離純化，其梯度洗脫如圖1A所示。GPS經(jīng)過分離純化得到2 個(gè)多糖組分，分別為去離子水洗脫獲得的中性多糖組分GPS-1和0.5 mol/L NaCl洗脫獲得的酸性多糖組分GPS-2。收集樣品，濃縮、透析、凍干后分別得到白色（GPS-1）和黃色（GPS-2）粉末。GPS-1和GPS-2的得率分別為52.14%和11.67%（基于GPS質(zhì)量計(jì)算）。對初步純化組分進(jìn)行體外降血糖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示兩種多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為45.56%和43.78%，無顯著差異（P＞0.05）。采用葡聚糖凝膠層析法對GPS-1進(jìn)一步純化，結(jié)果如圖1B所示。GPS-1經(jīng)Sephadex G-100分離得到一個(gè)相對均一的洗脫峰，經(jīng)濃縮、透析、凍干后得到白色粉末，洗脫得率為72.63%（基于GPS-1質(zhì)量計(jì)算），命名為GPS-1A。對GPS-1A進(jìn)行降解，得到α-葡萄糖苷酶抑制率為91.58%的低分子質(zhì)量多糖，降解得率為64.35%（基于GPS-1A質(zhì)量計(jì)算），命名為DGPS-1A。

圖1 GPS在DEAE-纖維素-52（A）和在Sephadex G-100（B）上的洗脫曲線Fig.1 Elution curves of GPS on DEAE-52 (A) and Sephadex G-100 column (B)

2.2 GPS的基本理化性質(zhì)

由表1可知，GPS-1A和DGPS-1A的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近，分別為94.84%和95.36%。然而，超聲波輔助H2O2-VC處理后DGPS-1A中的糖醛酸的含量較GPS-1A顯著提高了122.97%（P＜0.05），這可能是H2O2-VC體系產(chǎn)生的羥自由基以及超聲波的空化作用攻擊糖苷鍵引起多糖暴露出更多的糖醛酸導(dǎo)致的。

表1 GPS、GPS-1A及DGPS-1A的得率及多糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Yields and polysaccharide,uronic acid and protein contents of GPS,GPS-1A and DGPS-1A

2.3 GPS-1A和DGPS-1A的相對分子質(zhì)量

研究發(fā)現(xiàn)，相對分子質(zhì)量會(huì)影響多糖的生物活性和實(shí)際應(yīng)用[23]。如圖2所示，GPS-1A及其降解產(chǎn)物DGPS-1A的高效凝膠滲色譜圖中均有一個(gè)對稱峰，表明GPS-1A和DGPS-1A是均一的多糖組分。與GPS-1A相比，降解多糖DGPS-1A的色譜峰明顯右移，相對分子質(zhì)量分別為135（GPS-1A）和77.8（DGPS-1A）。結(jié)果表明，超聲波輔助H2O2-VC反應(yīng)可以降解GPS，并且降低其相對分子質(zhì)量。超聲波輔助H2O2-VC降解后，GPS相應(yīng)的多分散度（重均分子質(zhì)量（mw）/數(shù)均分子質(zhì)量（mn））從3.19降低到2.00，這說明降解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布逐漸變窄，變得更加均勻。

圖2 GPS-1A和DGPS-1A的高效凝膠滲透色譜圖Fig.2 High performance gel permeation chromatograms of GPS-1A and DGPS-1A

2.4 GPS-1A和DGPS-1A的單糖組成

研究表明，單糖作為多糖的天然基本單位，很大程度上影響著天然多糖的結(jié)構(gòu)和功能活性[24]。如圖3及表2所示，GPS-1A及其降解產(chǎn)物DGPS-1A的單糖組成相似，但物質(zhì)的量比略有不同。GPS中單糖主要包括甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）、巖藻糖（Fuc）、葡萄糖醛酸（GlcUA）和半乳糖醛酸（GalUA），其在GPS-1A及DGPS-1A中物質(zhì)的量占比分別為0.15∶98.80∶0.36∶0.14∶0.09∶0.05∶0.41和1.35∶95.85∶0.54∶0.13∶0.73∶0.15∶1.17。單糖組成中葡萄糖的占比最高，證明GPS-1A和DGPS-1A是葡聚類中性多糖。降解前后單糖種類沒有發(fā)生改變，表明超聲波輔助H2O2-VC降解相對溫和，幾乎不破壞天然多糖的基本結(jié)構(gòu)。降解后單糖物質(zhì)的量占比發(fā)生了改變，DGPS-1A中葡萄糖占比下降，甘露糖、巖藻糖和半乳糖占比升高。這可能是因?yàn)榱u自由基只攻擊葡萄糖區(qū)附近的糖苷鍵，而其他中性多糖附近的糖苷鍵相對穩(wěn)定，并未因羥自由基的存在而發(fā)生改變[13]。降解后葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸占比升高，說明H2O2-VC產(chǎn)生的羥自由基作用于多糖主鏈葡萄糖區(qū)的糖苷鍵，釋放出更多的糖醛酸，這與表1中糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的結(jié)果相印證。徐雅琴等[25]采用超聲波輔助Fe2＋-VC-H2O2降解黑加侖多糖，降解后多糖的單糖種類也未發(fā)生改變。

表2 GPS-1A和DGPS-1A的單糖組成Table 2 Monosaccharide compositions of GPS-1A and DGPS-1A

圖3 GPS-1A和DGPS-1A單糖組成的高效液相色譜圖Fig.3 High-performance liquid chromatographic profiles of monosaccharide compositions of GPS-1A and DGPS-1A

2.5 GPS-1A和DGPS-1A的傅里葉變換紅外光譜分析

如圖4所示，在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)GPS-1A和D GPS-1 A 都呈現(xiàn)典型的多糖特征吸收峰[26]。在3 435.06 cm-1處有寬而強(qiáng)的吸收峰，為多糖O—H的伸縮振動(dòng)峰；2 933.59 cm-1和1 591.2 cm-1處的吸收峰分別由C—H伸縮振動(dòng)和C—O伸縮振動(dòng)導(dǎo)致[27]；1 350.11cm-1處的吸收峰為C—H的變角振動(dòng)峰。GPS-1A在1 632.4 cm-1處的吸收峰相對較弱，說明其糖醛酸含量相對較少，與表1結(jié)果相印證。DGPS-1A在1 209.31 cm-1附近的吸收峰為雙鍵＝SO的對稱伸縮振動(dòng)，表明其可能存在硫酸基團(tuán)[28]。在1 200～1 000 cm-1處的特征峰是由于C—O—C糖苷鍵和C—O—H側(cè)基的伸縮振動(dòng)導(dǎo)致的，表明GPS-1A和DGPS-1A為吡喃型多糖[29]。933.5 cm-1和829.3 cm-1處的特征吸收峰表明GPS-1A和DGPS-1A同時(shí)存在α-構(gòu)型和β-構(gòu)型的糖苷鍵[30]。綜上，GPS-1A和DGPS-1A具有相似的特征峰，超聲波輔助H2O2-VC處理不會(huì)影響GPS-1A的一級結(jié)構(gòu)。

圖4 GPS-1A和DGPS-1A的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.4 Fourier transform infrared spectra of GPS-1A and DGPS-1A

2.6 GPS-1A和DGPS-1A的紫外光譜分析

如圖5所示，純化多糖GPS-1A和降解多糖DGPS-1A溶液在260、280 nm波長處未出現(xiàn)紫外吸收峰，說明多糖中不含核酸和蛋白質(zhì)，這與2.2節(jié)GPS-1A和DGPS-1A中未檢測出蛋白質(zhì)的結(jié)果相印證。

圖5 GPS-1A和DGPS-1A的紫外吸收光譜Fig.5 Ultraviolet absorption spectra of GPS-1A and DGPS-1A

2.7 GPS-1A和DGPS-1A的NMR氫譜分析

如圖6所示，GPS-1A和DGPS-1A在δH3.5～5.3（圖A、B）和δC60～110（圖C、D）處的信號與多糖NMR信號的典型分布一致。通常情況下，化學(xué)位移δ大于5.0時(shí)表示多糖分子的異頭氫為α-構(gòu)型，而化學(xué)位移δ小于5.0則表示多糖分子的異頭氫為β-構(gòu)型[31]。由圖6A、B可知，GPS-1A和DGPS-1A的1H-NMR圖譜異頭氫區(qū)域中存在4 個(gè)較為明顯的信號峰，化學(xué)位移δ分別為3.59、3.77、3.90和5.33，說明GPS-1A和DGPS-1A中的糖苷鍵類型同時(shí)存在α-構(gòu)型和β-構(gòu)型，這與傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果相印證。圖6C、D結(jié)果表明GPS-1A由不同單糖組成，并且DGPS-1A檢測出和GPS-1A相似的異頭碳信號，結(jié)合1H-NMR圖譜，得出DGPS-1A的異頭氫所對應(yīng)異頭碳信號的化學(xué)位移主要為66.69、71.65、72.78和99.71，具體為δ99.71/5.33、δ72.78/3.59、δ71.65/3.77和δ66.69/3.90。根據(jù)先前的研究將其分別歸屬于α-D-GlcpA-(1→、→3,6)-β-D-Manp-(1→、→6)-α-D-Glcp-(1→和→3,5)-α-LAraf-(1→[32]。單糖組成中沒有檢出其他單糖類型，可能是由于其含量太低導(dǎo)致的。綜上，超聲波輔助H2O2-VC處理沒有破壞GPS-1A的主要化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.8 GPS-1A和DGPS-1A的表面形態(tài)

掃描電子顯微鏡可以定性分析多糖的表面形態(tài)。如圖7所示，GPS-1A和DGPS-1A的表面形態(tài)非常相似，均具有光滑表面的片狀和剛性棒狀結(jié)構(gòu)。但是，與GPS-1A（圖7A～C）相比，DGPS-1A（圖7D～F）中的碎片表面積明顯增加，這可能是降解處理攻擊多糖連接的糖苷鍵所導(dǎo)致的。以上結(jié)果表明，超聲波輔助H2O2-VC降解改變了多糖的微觀結(jié)構(gòu)。

圖7 GPS-1A（A～C）和DGPS-1A（D～F）的掃描電子顯微鏡圖像Fig.7 Scanning electron microscopic images of GPS-1A (A-C) and DGPS-1A (D-F)

2.9 GPS-1A和DGPS-1A的剛果紅和I2-KI分析

研究表明，多糖在溶液中可以表現(xiàn)出多種不同的構(gòu)象，如單螺旋、雙螺旋、三螺旋和聚集體等，其構(gòu)象與多糖的生物活性有關(guān)[33]。通常，當(dāng)三螺旋構(gòu)象的多糖與剛果紅結(jié)合時(shí)，稀堿溶液中的λmax紅移，而濃堿溶液中的λmax顯著降低。如圖8A所示，GPS-1A＋剛果紅和DGPS-1A＋剛果紅的λmax均隨著氫氧化鈉濃度的升高而先升高再降低，最后趨于穩(wěn)定，表明兩種多糖中都存在三螺旋構(gòu)象。且DGPS-1A的λmax低于GPS-1A，說明超聲波輔助H2O2-VC處理后GPS-1A的三螺旋構(gòu)象發(fā)生了一定的解體[34]。

圖8 GPS-1A和DGPS-1A的結(jié)構(gòu)表征Fig.8 Structure characterization of GPS-1A and DGPS-1A

I2-KI實(shí)驗(yàn)可以檢測多糖中是否存在相對較長和多分支的結(jié)構(gòu)。當(dāng)分支更少、側(cè)鏈更短的多糖與I2結(jié)合時(shí)，I2在350 nm波長處的吸收峰會(huì)移至565 nm波長處。如圖8B所示，GPS-1A和DGPS-1A溶液在565 nm波長附近沒有吸收峰，這表明兩種多糖都具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，降解沒有破壞GPS-1A的主要結(jié)構(gòu)，兩者主鏈上均有較多的分支和較長的側(cè)鏈，而且沒有淀粉。

2.10 GPS-1A和DGPS-1A的體外降血糖活性分析

糖尿病是一種慢性疾病，其特征是與飲食代謝異常相關(guān)的高血糖，并會(huì)導(dǎo)致慢性并發(fā)癥的發(fā)生[35]。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑會(huì)抑制小腸中碳水化合物水解酶的活性，從而減少淀粉中碳水化合物的釋放，并延緩碳水化合物的吸收[36]。因此，天然的α-淀粉酶和α-糖苷酶抑制劑引起了人們的極大關(guān)注。

如圖9所示，所有樣品對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均表現(xiàn)出劑量依賴的抑制作用，且DGPS-1A對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性顯著高于GPS-1A（P＜0.05）。當(dāng)質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL時(shí)，GPS-1A、DGPS-1A和阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制率分別為（54.04±1.97）%、（78.03±2.29）%和（90.27±1.94）%，半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為4.34、1.98、0.04 mg/mL。在最高質(zhì)量濃度（6 mg/mL）下，GPS-1A、DGPS-1A和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，分別為（65.16±2.53）%、（90.83±3.04）%和（97.26±1.21）%，相應(yīng)的IC50值分別為1.44、0.51、0.07 mg/mL。

圖9 GPS-1A、DGPS-1A對α-葡萄糖苷酶（A）和α-淀粉酶（B）活性的抑制作用Fig.9 Inhibitory effects of GPS-1A and DGPS-1A on the activities of α-glucosidase (A) and α-amylase (B)

多糖可以與α-淀粉酶或α-葡萄糖苷酶結(jié)合改變其酶結(jié)構(gòu)，也可以與底物和酶結(jié)合形成三元絡(luò)合物，導(dǎo)致酶催化能力下降[37]。降解后的多糖相對分子質(zhì)量減小、表面積增大，可以結(jié)合更多的酶分子，阻礙其和底物接觸反應(yīng)，從而提高酶的抑制率。毛美林等[35]采用H2O2-VC法制備江蘺降解多糖，發(fā)現(xiàn)中等分子質(zhì)量的降解多糖GLP1具有最強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制作用。以上結(jié)果說明，多糖的降血糖活性不僅與分子質(zhì)量有密切關(guān)系，還與不同來源多糖特定的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.11 GPS-1A和DGPS-1A的體外抗氧化活性分析

前人研究發(fā)現(xiàn)GPS具有一定的抗氧化能力[38]。因此，本研究并比較了超聲波輔助H2O2-VC處理對GPS-1A抗氧化活性的影響。如圖10所示，GPS-1A和DGPS-1A的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力均呈劑量依賴關(guān)系，并且降解后的DGPS-1A抗氧化活性更好，這說明超聲波輔助H2O2-VC處理明顯提高了多糖的抗氧化能力，與文獻(xiàn)[17]的結(jié)果相似。

圖10 GPS-1A和DGPS-1A的體外抗氧化活性分析Fig.10 In vitro antioxidant activity of GPS-1A and DGPS-1A

DPPH自由基作為一種穩(wěn)定的自由基，被廣泛用于測定各種抗氧化劑清除自由基的能力[39]。如圖10A所示，GPS-1A、DGPS-1A和陽性對照（VC）對DPPH自由基表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到6.0 mg/mL時(shí)三者的DPPH自由基清除率分別為（31.77±2.42）%、（89.56±1.17）%和（99.50±0.66）%，其IC50值分別為12.45、2.32、0.03 mg/mL。Xu Yaqin等[40]對黑加侖多糖的研究也表明，相對分子質(zhì)量較低的黑加侖多糖DBCP-2具有更強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，本研究結(jié)果與之一致。

在活性氧化物中，羥自由基具有最高的氧化活性，它可以非特異性地攻擊鄰近的生物分子，并對細(xì)胞造成氧化損傷[41]。如圖10B所示，在0.2～6.0 mg/mL的質(zhì)量濃度下，所有樣品均對羥自由基有不同程度的清除能力，其清除能力排序依次為GPS-1A＜DGPS-1A＜VC，其IC50值分別為15.84、1.69、0.05 mg/mL。在質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL時(shí)，GPS-1A、DGPS-1A和VC的羥自由基清除率分別為（30.85±2.29）%、（76.85±1.63）%和（99.36±0.90）%。在多糖的官能團(tuán)中，還原羥基可能通過提供電子將自由基還原為更穩(wěn)定的形式，或通過直接與自由基反應(yīng)以終止自由基鏈反應(yīng)來參與抗氧化作用[42]。本研究結(jié)果表明，降解后的多糖DGPS-1A具有更多的還原羥基和更大的比表面積，所以具有更強(qiáng)的羥自由基清除能力。

化合物的還原能力可作為抗氧化活性的重要指標(biāo)[41]。反應(yīng)液的吸光度越高，表明反應(yīng)化合物的還原能力越強(qiáng)。如圖10C所示，當(dāng)質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL時(shí)，DGPS-1A的還原能力比GPS-1A提高了1.03 倍，說明相對分子質(zhì)量降低可使還原能力增強(qiáng)。多糖鏈通常有一個(gè)還原末端和一個(gè)非還原末端，低分子質(zhì)量的多糖由于具有更多的還原和非還原末端而顯示出更強(qiáng)的還原能力[43]。

3 結(jié)論

本研究以人參為原料得到粗多糖GPS，通過分離純化得到了中性組分GPS-1A，并采用超聲波輔助H2O2-VC法在特定降解條件下降解得到DGPS-1A。GPS-1A和DGPS-1A的相對分子質(zhì)量分別為135和77.8。兩種多糖的單糖種類一致，但物質(zhì)的量比略有不同。結(jié)構(gòu)分析表明降解體系中生成的羥基雖然沒有改變多糖的主要官能團(tuán)結(jié)構(gòu)，但攻擊了主鏈糖苷鍵，使多糖的相對分子質(zhì)量減小、表面積增大，從而提高了DGPS-1A的體外降血糖和抗氧化活性（與GPS-1A相比）。綜上，DGPS-1A具有開發(fā)為新型抗氧化劑和抗糖尿病劑的潛在價(jià)值。