超聲功率對小麥醇溶蛋白-膳食多酚共價復(fù)合物結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)的影響

曹佳興，朱海蘭，王君榮，張健豪，張國治,4,*

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.鄭州科技學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；3.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 201100；4.河南省面制主食工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450001）

為了維持動物蛋白與植物蛋白的消費(fèi)平衡，提高食品生產(chǎn)的可持續(xù)性，近年來植物蛋白的研究備受關(guān)注，開發(fā)具有優(yōu)良加工特性的植物蛋白成為現(xiàn)階段的一大研究熱點[1]。麩質(zhì)蛋白是存在于小麥、黑麥、大麥、黑小麥以及燕麥等谷物中的貯藏蛋白，它對谷物類食品的品質(zhì)有較大影響[2]。小麥中含有豐富的蛋白質(zhì)資源，麩質(zhì)蛋白質(zhì)量占小麥籽粒干質(zhì)量的10%～15%，其中醇溶蛋白（gliadin，GL）相對含量為50%～60%[3]。小麥GL是一種三維單肽鏈蛋白，分子質(zhì)量集中在25～100 kDa，分子內(nèi)通過氫鍵、疏水相互作用以及靜電相互作用連接[4]。GL具有兩親性和表面活性，可作為活性分子的載體或穩(wěn)定乳液[5]；由于GL溶解度較低，消化性和抗氧化性較差，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。此外，GL中含有大量的谷氨酰胺和脯氨酸，其結(jié)構(gòu)序列中包含大量抗原表位，這增加了接觸/攝入而引發(fā)小麥不耐受癥狀的風(fēng)險[6]。因此，GL的改性對于拓展麩質(zhì)蛋白的應(yīng)用具有重要意義。

在食品工業(yè)中，通常使用烘焙、濕蒸、高壓和超聲等加工方法來改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，但這些方法都存在一定的局限性，甚至可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的加工性質(zhì)劣變[7]。膳食多酚是存在于植物中的一種天然活性分子，具有良好的抗氧化性能和藥理作用，常用于蛋白質(zhì)功能特性的修飾。表沒食子兒茶素沒食子酸脂（(-)-epigallocatechin 3-gallate，EGCG）是綠茶中含量最高、活性最強(qiáng)的兒茶素單體，由3 個苯環(huán)、1 個吡喃環(huán)和8 個酚羥基組成；這種獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)使EGCG具有比其他多酚更為優(yōu)越的功能特性[8]。在堿性、自由基和酶促氧化環(huán)境中，EGCG可與蛋白質(zhì)中的氨基、巰基、酪氨酸、脯氨酸等活性位點形成共價鍵。

EGCG的共價修飾能有效改善蛋白質(zhì)的理化特性，但傳統(tǒng)共價反應(yīng)（包括堿法、自由基法和酶促反應(yīng)）效率較低、條件苛刻，使蛋白-多酚共價修飾在生產(chǎn)應(yīng)用中存在較大的局限性。有研究發(fā)現(xiàn)，超聲波（ultrasound，US）能使水分子解離產(chǎn)生OH-，從而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)與多酚共價反應(yīng)[9-10]。此外，US能促進(jìn)GL空間結(jié)構(gòu)的展開[11]，這為共價反應(yīng)提供了有利的條件。然而，US所提供的自由基氧化是瞬時的，并且受環(huán)境因素影響。此外，US處理功率與蛋白質(zhì)空間構(gòu)象以及分子間交聯(lián)程度密切相關(guān)。因此，研究不同功率的US對共價反應(yīng)產(chǎn)生的強(qiáng)化效果具有重要意義。

本研究以H2O2/抗壞血酸作為誘發(fā)體系，誘導(dǎo)GL與EGCG共價反應(yīng)，比較不同功率的超聲環(huán)境中EGCG對GL的修飾強(qiáng)度；通過多光譜聯(lián)用分析GL的結(jié)構(gòu)變化，并對其功能特性進(jìn)行表征，旨在尋找更高效的蛋白-多酚共價修飾方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

EGCG、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical，DPPH）上海麥克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白 上海源葉生物科技有限公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）試劑盒、上樣緩沖液 上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國Sigma公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

凱氏定氮儀 山東還能科技儀器有限公司；F-4500熒光光譜儀 日本日立株式會社；圓二色光譜（circular dichroism，CD）儀 美國Thermo Fisher公司；高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）儀美國Agilent公司；UV-2600紫外-可見分光光度計 日本島津公司；蛋白垂直電泳儀、GS-900凝膠電泳成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 GL的分離與制備

將小麥粉和乙醚按照1∶ 3（m/V）的比例混合，室溫下磁力攪拌4 h以去除脂肪，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，重復(fù)上述操作3 次。將脫脂小麥粉和65%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇溶液按照1∶10（m/V）的比例混勻，在室溫下機(jī)械攪拌提取24 h以上，然后10 000 r/min離心15 min取上清液。對收集的上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理，在-20 ℃冰箱靜置后凍干。利用全自動凱氏定氮儀測定GL含量。

1.3.2 共價復(fù)合物制備

參照Xu Haoxie等[12]的方法，將抗壞血酸和H2O2溶于由6 5%乙醇溶液溶解的G L 溶液，室溫下攪拌（600 r/min、30 min）。然后將45.3 mg EGCG加入混合物中進(jìn)行自由基反應(yīng)，同時對反應(yīng)體系進(jìn)行超聲處理（25 ℃、2 h），US功率分別為0 W及240、360、480、600 W，分別記作GE及GE-US（GE240、GE360、GE480、GE600）；對照組（GL）不進(jìn)行超聲以及共價反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后使用截留分子質(zhì)量為8 000 Da的透析袋透析72 h除去未反應(yīng)的EGCG。所有樣品30 ℃減壓濃縮后凍干處理，將制備的共價復(fù)合物于-40 ℃冰箱中保存。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-PAGE分析

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-PAGE參照Liu Xiangju等[13]的方法稍作修改。濃縮膠和分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.5%和5%，凝膠厚度為1.5 cm。使用超純水溶解蛋白質(zhì)樣品，取適量樣品溶液與4×還原上樣緩沖液/5×非還原上樣緩沖液混合，煮沸8 min使蛋白質(zhì)變性，10 000 r/min離心5 min后收集上清液上樣。上樣量為每孔15 μL，調(diào)整電壓80 V，待溴酚藍(lán)指示劑移至分離膠，調(diào)整電壓為120 V至電泳結(jié)束。電泳結(jié)束后使用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色，脫色后使用GS-900凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.3.4 HPLC分析

根據(jù)Ma Ling等[14]的方法進(jìn)行HPLC分析。樣品使用SDS溶液溶解后過0.45 μm濾膜，過濾后注入2 mL樣品瓶中。使用含0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）的乙腈溶液（體積分?jǐn)?shù)為20%）洗脫，流速為0.5 mL/min，檢測波長設(shè)定為280 nm。

1.3.5 多酚結(jié)合率測定

參照金花等[15]的方法測定樣品的多酚結(jié)合率，取0.5 mL樣品溶液與2.5 mL Folin-Ciocalteu試劑混合，避光反應(yīng)5 min。加入2 mL 75 mg/mL Na2CO3溶液繼續(xù)避光反應(yīng)2 h，測定760 nm波長處的吸光度。以不同質(zhì)量濃度的EGCG溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照公式（1）計算多酚結(jié)合率。

1.3.6 游離巰基/酪氨酸含量測定

使用Tris-Gly緩沖液溶解樣品，得到5 mg/mL溶液。取3 mL樣品溶液與0.03 mL ELLMA試劑（8 mg 5,5-二硫代-雙-(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）溶解于2 mL Tris緩沖液中）迅速混勻，避光反應(yīng)30 min，測定412 nm波長處的吸光度。按照公式（2）計算游離巰基含量。

式中：D為稀釋系數(shù)；ρ為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

酪氨酸含量的測定參照Liu Fuguo等[16]的方法。將1 mL樣品溶液（1 mg/mL）與1 mL硝酸混合，50 ℃水浴加熱15 min。冷卻后加入4 mL無水乙醇和4 mL NaOH溶液（5 mol/L）混勻，分別測定360 nm和430 nm波長處吸光度。按照公式（3）計算酪氨酸含量。

1.3.7 CD分析

使用磷酸鹽緩沖液（pH 7）溶解樣品，使樣品質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL。取適量樣品溶液置于光程為0.5 mm的比色皿中，于190～260 nm波長范圍內(nèi)在25 ℃、通氮?dú)獾臈l件下掃描CD圖譜。設(shè)置條件為：步長1 nm，單次掃描時間2 s，平行測定3 次。

1.3.8 紫外光譜分析

參考呂思瑤等[17]的方法，使用UV-2600紫外-可見分光光度計對樣品進(jìn)行紫外光譜采集。樣品質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL。設(shè)置波長檢測范圍為255～285 nm。以65%乙醇溶液作為參比溶液，平行采集3 次。

1.3.9 溶解度測定

準(zhǔn)確稱量100 mg樣品，與5 mL超純水混合，通過渦旋攪拌使樣品分散均勻。在恒溫水浴搖床中振蕩30 min后，10 000×g離心收集上清液。取0.1 mL上清液加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，充分振蕩混合，避光反應(yīng)10 min后測定595 nm波長處的吸光度。以牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算可溶性蛋白質(zhì)量濃度，按式（4）計算水溶性。

1.3.10 表面疏水性測定

參考王啟明[18]的方法，使用溴酚藍(lán)結(jié)合法測定樣品的表面疏水性，溴酚藍(lán)結(jié)合量越高，樣品的表面疏水性越好。用超純水溶解樣品，取1 mL樣品溶液（2.5 mg/mL）與1 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7）和200 μL溴酚藍(lán)溶液充分混合均勻，離心取上清液，測定595 nm波長處的吸光度。按照公式（5）計算溴酚藍(lán)結(jié)合量。

式中：A0和A分別為磷酸鹽緩沖液和樣品的吸光度。

1.3.11 抗氧化性測定

1.3.11.1 ABTS陽離子自由基清除能力

將5 mL ABTS溶液（7.44 mmol/L）與88 μL過硫酸鉀溶液（2.6 mmol/L）混合均勻，靜置18 h，作為ABTS陽離子自由基儲備液。將儲備液根據(jù)需要稀釋，取2 mL樣品溶液（2 mg/mL）與4 mL稀釋后的ABTS陽離子自由基溶液避光反應(yīng)10 min，測定734 nm波長處吸光度。以樣品與過硫酸鉀混合液作為空白對照，ABTS陽離子自由基清除率按照公式（6）計算。

式中：A0為ABTS工作液的吸光度；A為反應(yīng)液的吸光度；Aw為空白對照的吸光度。

1.3.11.2 DPPH自由基清除能力

使用95%乙醇溶液配制DPPH工作液（1 mmol/L），然后將3 mL樣品溶液（2 mg/mL）與3 mL DPPH工作液溶液混合，避光反應(yīng)30 min后測定517 nm波長處的吸光度。以95%乙醇與樣品的混合溶液（1∶1，V/V）作為空白對照，DPPH自由基清除率按照公式（7）計算。

式中：A0為DPPH工作液的吸光度；A為反應(yīng)液的吸光度；Aw為空白對照的吸光度。

1.3.11.3 鐵離子還原能力

將醋酸鈉溶液（0.3 mol/L、pH 3.6）、10 mmol/L三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）、FeCl3（20 mmol/L）按照10∶1∶1的體積比混勻，37 ℃避光水浴2 h，作為鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）工作液。將10 μL樣品溶液（2 mg/mL）與300 μL FRAP工作液混勻，37 ℃水浴反應(yīng)30 min，測定593 nm波長處吸光度。

1.3.12 消化性測定

模擬消化參照Li Tanghao等[19]的方法并進(jìn)行修改，使用45 mmol/L NaCl溶液溶解樣品，使樣品質(zhì)量濃度為2 mg/mL。將樣品溶液與胃蛋白酶置于37 ℃恒溫水浴鍋中穩(wěn)定30 min，然后將胃蛋白酶加入樣品溶液中（m（胃蛋白酶）∶m（樣品）＝0.03∶1.00）。分別于胃蛋白酶反應(yīng)60 min和120 min時收集反應(yīng)產(chǎn)物，立即加入20 μL 2 mol/L NaHCO3溶液終止反應(yīng)。胃消化120 min時使用NaHCO3調(diào)節(jié)至pH 7，然后加入模擬腸液（V（模擬腸液）∶V（樣品溶液）＝0.025∶1.000；模擬腸液為2.5 g胰蛋白酶和10 mg膽汁提取物混合，使用NaHCO3溶液定容至25 mL）繼續(xù)進(jìn)行消化反應(yīng)。分別于胰蛋白酶消化30 min和60 min時收集消化產(chǎn)物，并立即100 ℃水浴滅酶。所收集的樣品使用BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)量濃度，按照公式（8）計算蛋白質(zhì)消化率。

式中：ρ0和ρ分別表示未消化和消化后的蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Image Lab軟件分析電泳圖像；使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的單因素方差分析，以P＜0.05表示差異顯著。使用Origin 2022軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲功率對GL-EGCG共價復(fù)合物分子亞基的影響

通過SDS-PAGE觀察蛋白質(zhì)分子的亞基遷移速率以及聚集程度。根據(jù)遷移速率差異，GL亞基主要包括α-/β-亞基、γ-亞基以及ω-亞基。如圖1所示，相較于GL，GE以及GE-US的亞基分布無明顯變化，說明共價反應(yīng)后無小分子亞基產(chǎn)生，也未出現(xiàn)大分子聚集；但共價復(fù)合物的亞基均出現(xiàn)明顯偏移，蛋白質(zhì)條帶在凝膠上的遷移速率變慢，這是由于GL與EGCG共價結(jié)合后相對分子質(zhì)量增加導(dǎo)致的[20]。超聲環(huán)境下形成的共價復(fù)合物在凝膠上的遷移速率進(jìn)一步變慢，其中GE360和GE480亞基明顯偏移；因此推測在360 W和480 W超聲環(huán)境中EGCG對蛋白質(zhì)的修飾效果較強(qiáng)。非還原SDS-PAGE中，GE和GE-US在35 kDa處出現(xiàn)新的條帶c，此外，大于180 kDa處的條帶顏色加深。由于非還原SDS-PAGE過程中保留了二硫鍵，推測共價反應(yīng)促進(jìn)了蛋白質(zhì)之間二硫鍵的交聯(lián)，從而使亞基發(fā)生聚合[21]。此外，GE600的條帶a以及條帶c顏色略有加深，且在還原SDS-PAGE中，GE600條帶偏移效果與GE無明顯差異，說明600 W處理時共價復(fù)合物的聚合效果明顯，這可能是由于高功率的US促進(jìn)了巰基的氧化以及鏈內(nèi)二硫鍵的形成，增加了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[22]，從而限制了空化剪切以及EGCG的進(jìn)一步修飾。

圖1 不同功率下共價復(fù)合物的還原SDS-PAGE（A）和非還原SDS-PAGE（B）圖Fig.1 SDS-PAGE (A) and non-reducing SDS-PAGE (B) diagrams covalent complexes at different power

2.2 超聲功率對GL-EGCG共價復(fù)合物分子質(zhì)量的影響

如圖2所示，GL的保留時間為24.15 min，而GE的保留時間縮短至24.06 min，由此可知GL與EGCG的共價反應(yīng)形成了相對分子質(zhì)量更大的復(fù)合物，這與Zhang Kangyi等[23]的報道一致。相比于GE，GE-US的保留時間均出現(xiàn)不同程度的縮短，其中GE480的保留時間縮短至23.91 min，說明GE-US共價復(fù)合物的相對分子質(zhì)量更大，這與SDS-PAGE分析結(jié)果相印證。

圖2 不同功率下共價復(fù)合物的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of covalent complexes at different power levels

2.3 超聲功率對GL-EGCG共價復(fù)合物多酚結(jié)合率的影響

如表1所示，GE反應(yīng)體系中多酚結(jié)合率為22.78%。隨著超聲功率的增加，多酚結(jié)合率先升高后降低，并在480 W時達(dá)到最高（33.75%），可見超聲環(huán)境更有利于共價反應(yīng)的進(jìn)行。US產(chǎn)生強(qiáng)烈的剪切力和空化效應(yīng)，能有效減弱蛋白質(zhì)分子之間的弱聚集效應(yīng)，這在牛血清白蛋白（500 W、0～30 min、20 kHz、0～4 ℃）和對蝦蛋白（300 W、0～35 min、20 kHz、20 ℃）中得到證實[24-25]；此外，空化效應(yīng)和剪切力能夠破壞分子內(nèi)的氫鍵相互作用，引起蛋白質(zhì)去卷曲化，這有利于蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的舒展[26]。在該過程中，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化可能暴露出新的反應(yīng)位點，更有利于被多酚識別。有研究表明，超聲環(huán)境促進(jìn)了水分子和H2O2的解離，增加了反應(yīng)體系中羥自由基的含量；這些自由基可氧化蛋白質(zhì)的部分側(cè)鏈基團(tuán)，從而促進(jìn)共價反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)功率增至600 W時多酚結(jié)合率下降，這與SDS-PAGE和HPLC的分析結(jié)果相印證，說明高強(qiáng)度的超聲環(huán)境對EGCG與GL共價反應(yīng)的增強(qiáng)效果有限；推測高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)加劇了蛋白質(zhì)的氧化，促進(jìn)了分子內(nèi)二硫鍵的形成以及蛋白質(zhì)分子的重新聚集[27]，從而限制了共價反應(yīng)。

表1 多酚結(jié)合率及蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量Table 1 Polyphenol-binding ratio and protein secondary structure contents

2.4 超聲功率對GL-EGCG共價復(fù)合物游離巰基和酪氨酸含量的影響

蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基酸容易被自由基氧化進(jìn)而與多酚發(fā)生親核加成反應(yīng)，因此通過檢測游離巰基和酪氨酸含量的變化可分析EGCG與GL的相互作用。如圖3所示，相較于GL，GE的游離巰基和酪氨酸含量顯著降低，這是由于這些氨基酸殘基被自由基氧化形成反應(yīng)位點，與EGCG通過共價鍵連接。相較于GE，GE-US的游離巰基和酪氨酸含量減少，這可能是由于在空化效應(yīng)和EGCG修飾的共同作用下，GL的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了更劇烈的改變，使部分基團(tuán)被重新包裹。Zhang Kangyi等[11]對小麥醇溶蛋白進(jìn)行超聲預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)內(nèi)游離巰基含量增加。推測超聲環(huán)境下的共價反應(yīng)消耗了更多的游離巰基。當(dāng)超聲功率為600 W時，共價復(fù)合物中酪氨酸含量增加，這可能是由于高強(qiáng)度的空化效應(yīng)導(dǎo)致部分巰基被氧化成二硫鍵，限制了共價反應(yīng)對酪氨酸的消耗。

2.5 超聲功率對GL-EGCG共價復(fù)合物二級結(jié)構(gòu)的影響

通過對CD進(jìn)行擬合計算分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化。如表1和圖4所示，GL的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量分別為20.98%、40.57%、19.78%、18.67%，其中β-折疊為GL的主要二級結(jié)構(gòu)。與GL相比，GE中的α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量降低，而β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量增加，可見共價相互作用改變了GL側(cè)鏈以及分子內(nèi)的氫鍵作用；此外，EGCG與GL共價結(jié)合的過程可能促進(jìn)了氨基酸側(cè)鏈對極性基團(tuán)的吸附，從而使β-轉(zhuǎn)角的相對含量增加[28]。而GE-US中α-螺旋相對含量進(jìn)一步降低，說明超聲環(huán)境下的共價反應(yīng)對蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)破壞更劇烈。這是因為US能夠抑制共價復(fù)合物之間的氫鍵相互作用，促進(jìn)α-螺旋無序化[29]，從而更有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開。這種松散結(jié)構(gòu)對共價反應(yīng)的進(jìn)行更有利。但超聲功率增強(qiáng)至360 W以上時，復(fù)合物的α-螺旋相對含量降低不明顯，這可能是由于蛋白質(zhì)分子間的二硫鍵交聯(lián)限制了空化效應(yīng)和共價作用對其有序結(jié)構(gòu)的破壞。

圖4 不同功率下共價復(fù)合物的CD圖譜Fig.4 CD spectra of covalent complexes at different power levels

2.6 超聲功率對GL-EGCG共價復(fù)合物三級結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸使蛋白質(zhì)在270～280 nm波長處存在特有的紫外吸收，通過對吸收峰強(qiáng)度的分析可判斷共價相互作用程度，而最大吸收/發(fā)射波長的分析可用于判斷蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)變化。如圖5所示，GL的吸收峰集中在260～290 nm波長處，這對應(yīng)于GL中酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基的π-π*越遷[30]。與EGCG共價結(jié)合后，GE的紫外吸收明顯增強(qiáng)，并且伴隨藍(lán)移；說明GL的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，芳香族氨基酸的空間位置轉(zhuǎn)移，暴露于周圍的溶劑中[31]。此外，相較于GE，GE-US的紫外吸收增強(qiáng)，并且隨著超聲功率的增大吸光度增加。這可能是由于超聲環(huán)境中EGCG的修飾作用更強(qiáng)烈，導(dǎo)致GL的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)一步改變。

圖5 不同功率下共價復(fù)合物的紫外光譜Fig.5 Ultraviolet spectra of covalent complexes at different power levels

2.7 超聲功率對GL-EGCG共價復(fù)合物水溶性的影響

蛋白質(zhì)的水溶性決定了其加工性能，較差的水溶性通常會限制蛋白質(zhì)在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。如圖6所示，天然的GL水溶性僅為33.23%，而GE的水溶性顯著提高，這是由于EGCG中的羥自由基更容易與水分子發(fā)生氫鍵相互作用，從而增強(qiáng)了共價復(fù)合物的水化作用。相較于GE，GE-US的水溶性得到進(jìn)一步改善，其中GE240的水溶性分別比GL和GE提高了27.89 個百分點和10.97 個百分點。GE-US共價復(fù)合物溶解度提升的原因主要是超聲空化效應(yīng)、剪切力和EGCG共價修飾的協(xié)同效應(yīng)；較高的酚羥基含量使這些復(fù)合物更容易與水分子發(fā)生相互作用。有研究表明EGCG的共價修飾能夠減小蛋白質(zhì)粒徑[32]，使蛋白質(zhì)的比表面積增大，從而有利于蛋白質(zhì)與水分子接觸[33]。然而，隨著超聲功率的進(jìn)一步增大，共價復(fù)合物的水溶性降低，這可能時由于高強(qiáng)度超聲促使蛋白質(zhì)形成不穩(wěn)定的聚合體，減小蛋白質(zhì)比表面積的同時掩蓋了部分親水基團(tuán)，不利于蛋白質(zhì)與水分子之間的相互作用。

圖6 不同功率對共價復(fù)合物水溶性的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on the water solubility of covalent complexes

2.8 超聲功率對GL-EGCG共價復(fù)合物表面疏水性的影響

表面疏水性可用于判斷GL結(jié)構(gòu)的舒展程度。如圖7所示，共價反應(yīng)后，GL的溴酚藍(lán)結(jié)合量由104.86 μg提高至110.71 μg，由此可知在EGCG的共價修飾下蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)展開，疏水區(qū)域暴露，從而使其溴酚藍(lán)結(jié)合量增加。在超聲環(huán)境中共價復(fù)合物的表面疏水性顯著降低，這可能是由于蛋白質(zhì)的部分疏水基團(tuán)作為反應(yīng)位點參與EGCG的共價反應(yīng)，使GL表面疏水基團(tuán)減少。此外，GE-US共價復(fù)合物中的酚含量較高；有研究認(rèn)為，多酚中的苯環(huán)和酚羥基能促進(jìn)蛋白質(zhì)與多酚之間的非共價相互作用，間接限制蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的擴(kuò)張[34]；同時，高強(qiáng)度的超聲還能促進(jìn)共價復(fù)合物之間二硫鍵的交聯(lián)，這也可能限制疏水基團(tuán)在反應(yīng)過程中的轉(zhuǎn)移。當(dāng)超聲功率增大時，共價復(fù)合物的表面疏水性呈現(xiàn)上升趨勢，但仍低于GL和GE，這可能是由于高強(qiáng)度的超聲所提供的剪切力能夠打破由EGCG帶來的空間位阻[35]，從而增加疏水基團(tuán)的暴露量。

圖7 不同功率對共價復(fù)合物表面疏水性的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on the surface hydrophobicity of covalent complexes

2.9 超聲功率對GL-EGCG共價復(fù)合物抗氧化性的影響

通過DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除實驗結(jié)合FRAP分析共價復(fù)合物的抗氧化性能差異。如圖8所示，天然的GL抗氧化性能較差，而共價復(fù)合物的抗氧化活性均明顯增強(qiáng)。有研究表明膳食多酚能有效改善食品的抗氧化性能，這主要與其化學(xué)結(jié)構(gòu)中所含酚羥基的數(shù)量有關(guān)[36]。每個EGCG分子含有8 個酚羥基；自由基誘導(dǎo)共價反應(yīng)通過羥自由基氧化蛋白質(zhì)產(chǎn)生大分子自由基，與酚羥基的鄰位和對位形成共價鍵，這一過程中EGCG的自由基清除能力最大程度地被保留。GE-US共價復(fù)合物的抗氧化性隨著超聲功率的增大先增加后降低，至360、480 W時，DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力及FRAP最強(qiáng)，這一結(jié)果與2.3節(jié)中多酚結(jié)合率的變化趨勢相似。Chen Yichun等[37]通過研究不同濃度膳食多酚對蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物抗氧化性的影響，發(fā)現(xiàn)復(fù)合物中多酚的濃度決定了其抗氧化性。根據(jù)對側(cè)鏈基團(tuán)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的分析，推測GE-US抗氧化性的改善與超聲-共價反應(yīng)產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)密切相關(guān)。相較于GE，超聲處理使GL表面出現(xiàn)更多的識別位點，更有利于蛋白質(zhì)與多酚之間形成共價連接；但超聲功率增大至600 W時GE600的抗氧化性大幅降低，這可能是因為600 W的超聲環(huán)境不利于GL與EGCG的共價反應(yīng)。

圖8 共價復(fù)合物抗氧化性能分析熱圖Fig.8 Heatmap analysis of antioxidant properties of covalent complexes

2.10 超聲功率對GL-EGCG共價復(fù)合物消化性的影響

如圖9所示，在胃消化60 min時共價復(fù)合物的消化率遠(yuǎn)高于GL，由此可知，與EGCG共價結(jié)合后GL的消化率顯著提高，這可能是因為GL的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其更容易被酶水解。然而有研究發(fā)現(xiàn)，與部分多酚類物質(zhì)（原花青素、縮合單寧）復(fù)合會降低蛋白質(zhì)的消化率[38]，本研究結(jié)果與之不同，可能的原因是蛋白質(zhì)的消化性能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。另外，反應(yīng)過程中部分酚類化合物與蛋白質(zhì)之間以非共價鍵相連接，由于消化過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，這些酚類物質(zhì)被釋放，消化酶與這些被釋放的多酚發(fā)生相互作用從而使酶活性被抑制。在同一階段，GE-US的消化率大多略高于GE。由紫外光譜分析可知，超聲處理促進(jìn)了共價復(fù)合物中芳香族氨基酸的暴露，而芳香族氨基酸含量與蛋白酶的酶切位點密切相關(guān)[39]，由此推測，超聲處理增加了蛋白分子表面的酶切位點。但胃消化60 min時GE360的消化率明顯低于GE，這可能是由于在該超聲環(huán)境中共價反應(yīng)消耗/掩蓋了大量胃蛋白酶的作用位點，如賴氨酸和精氨酸殘基，導(dǎo)致胃蛋白酶無法快速識別目標(biāo)蛋白。

圖9 共價復(fù)合物的消化性分析Fig.9 Digestibility analysis of covalent complexes

3 結(jié)論

本研究通過超聲協(xié)同H2O2/抗壞血酸氧化體系促進(jìn)EGCG與GL的共價反應(yīng)，并對共價復(fù)合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析及功能表征。研究發(fā)現(xiàn)，超聲環(huán)境下更有利于EGCG與GL共價反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)功率為480 W時，GL的多酚結(jié)合率最高，比GE提高了10.97 個百分點。在超聲環(huán)境中共價反應(yīng)消耗了更多的側(cè)鏈基團(tuán)；蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈的變化，其中有序的α-螺旋相對含量減少，芳香族氨基酸和疏水性氨基酸殘基發(fā)生轉(zhuǎn)移，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性進(jìn)一步降低。相比于傳統(tǒng)共價反應(yīng)，超聲輔助共價修飾在蛋白質(zhì)的功能性改良方面有更大優(yōu)勢；240 W超聲環(huán)境中形成的共價復(fù)合物水溶性最強(qiáng)，比GL提高了27.89 個百分點；在本研究的消化環(huán)境中，超聲輔助共價修飾蛋白質(zhì)消化率及水解度更高。由于US與自由基氧化的協(xié)同效應(yīng)增加了GL對活性分子的負(fù)載量，使其抗氧化性得到改善。本實驗通過調(diào)整不同超聲功率輔助GL與EGCG進(jìn)行共價反應(yīng)，為提高多酚的生物利用率、拓寬共價修飾在食品工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了更多的可能，但US對于共價反應(yīng)的強(qiáng)化機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。