宰后成熟過(guò)程中脂多糖誘導(dǎo)劑對(duì)灘羊肌細(xì)胞線粒體凋亡信號(hào)通路的影響

李 榮，羅瑞明，杜 瑞，羅玉龍,*，王金霞，張 倩，陳雪妍

（1.寧夏大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.銀川市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心，寧夏 銀川 750000）

線粒體作為細(xì)胞凋亡的中樞調(diào)控者，參與調(diào)控細(xì)胞氧化還原狀態(tài)變化過(guò)程和能量供應(yīng)，同時(shí)對(duì)肌細(xì)胞凋亡進(jìn)程起著極其重要的調(diào)控作用[1-2]。宰后肌肉組織與外界切斷聯(lián)系，缺氧缺血等變化導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)[3]，ATP耗竭使細(xì)胞從有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧糖酵解，活性氧（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的氧化應(yīng)激等使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致線粒體內(nèi)促凋亡因子線粒體細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt-c）、凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）等大量釋放，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[4]?？赏ㄟ^(guò)線粒體能量變化、氧化應(yīng)激水平、標(biāo)志酶以及凋亡因子釋放情況等指標(biāo)來(lái)表征凋亡對(duì)線粒體的影響。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，可以和TLR4基因編碼的跨膜蛋白Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）結(jié)合。LPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通過(guò)TLR4激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），激活后的NF-κB誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子從而介導(dǎo)炎癥基因和BCL-2家族的蛋白通過(guò)激活半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）活性來(lái)參與細(xì)胞凋亡過(guò)程[5]。張釗等[6]發(fā)現(xiàn)LPS刺激可以改變線粒體的形態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位下降，促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Gogvadze等[7]的研究表明從線粒體內(nèi)膜釋放的各種促凋亡蛋白在胞漿中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，即線粒體對(duì)調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生有著至關(guān)重要的作用。McIlwain等[8]發(fā)現(xiàn)給予一定劑量的LPS會(huì)引起Caspase-3的激活，LPS被認(rèn)為能夠參與細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者——Caspase3的活化；張永波[9]的研究表明LPS可以通過(guò)氧化應(yīng)激損傷的途徑使細(xì)胞發(fā)生凋亡，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。Ji Yinglei等[10]使用LPS處理大鼠細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其顯著上調(diào)了Caspases-12和Caspases-3蛋白的表達(dá)，表明LPS可能以劑量和時(shí)間依賴性的方式導(dǎo)致細(xì)胞活力降低和細(xì)胞凋亡率增加。以上研究結(jié)果均表明，LPS可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，但對(duì)于LPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)線粒體凋亡通路的影響鮮有研究。

本實(shí)驗(yàn)以灘羊背最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象，通過(guò)LPS誘導(dǎo)凋亡，測(cè)定其在4 ℃成熟0、6、12、24、72 h過(guò)程中灘羊肉細(xì)胞凋亡率、凋亡酶活力、線粒體ATP含量、琥珀酸脫氫酶（succinatedehydrogenase，SDH）和檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）活力，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒測(cè)定Bcl-2家族蛋白含量，采用Western blot法測(cè)定細(xì)胞凋亡因子Cyt-c和Caspase-3的表達(dá)量，以此闡釋灘羊肉成熟過(guò)程中LPS誘導(dǎo)凋亡與線粒體凋亡途徑的關(guān)系，以期為后續(xù)揭示LPS誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制提供思路，并為冷卻灘羊肉貯藏期間肉品質(zhì)量控制技術(shù)研發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9 只胴體質(zhì)量相近的6 月齡公灘羊購(gòu)自寧夏鹽池縣寧鑫肉業(yè)有限公司。

LPS、甘露醇、4-丙磺酸基嗎琳、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸 北京索萊寶生物科技有限公司；Arsenazo III 美國(guó)MCE公司；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒 江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司；總蛋白定量測(cè)定試劑盒、ATP含量測(cè)定試劑盒、SDH活力檢測(cè)試劑盒、CS活力檢測(cè)試劑盒、Caspase-3活力檢測(cè)試劑盒、Caspase-9活力檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；雙花扁豆凝集素（dolichos bifows agglutinin，DBA）試劑盒 上?？道缮锟萍加邢薰荆痪d羊Bax ELISA試劑盒、綿羊Bcl-2 ELISA試劑盒 武漢新啟迪生物科技有限公司；Anti-Cytochrome c抗體、Anti-Caspase-3抗體 美國(guó)Abcam公司。

1.2 儀器與設(shè)備

752N紫外分光光度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HZB-12/A家用制冰機(jī) 寧波惠康國(guó)際工業(yè)有限公司；TGL-16D冷凍高速離心機(jī) 常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；JX-CL冷凍研磨儀 上海凈信實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HHS-21-6電熱恒溫水浴鍋 上海四藍(lán)儀器設(shè)備有限公司；EL×800酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；WIXEP300垂直電泳儀 韋克斯科技（北京）有限公司；SH-100凝膠圖像分析儀 上海四星生物技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

宰前遵循動(dòng)物管理規(guī)定，屠宰后立即用滅菌刀取下右側(cè)背最長(zhǎng)肌，剔除可見(jiàn)脂肪與結(jié)締組織后，分割成100 g左右肉樣，快速存入液氮作0 h樣品。剩下的肉樣切成100 g左右大小一致的肉塊，隨機(jī)分為2 組，第1組不作處理，為空白對(duì)照組，第二組注射30 mg/L LPS溶液（肉樣和處理液的質(zhì)量體積比為1∶1），裝入密閉自封袋，在4 ℃條件下分別成熟0、6、12、24、72 h，并在對(duì)應(yīng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)測(cè)定pH值等指標(biāo)，對(duì)凋亡酶活性和凋亡因子表達(dá)量等不便立即測(cè)定的指標(biāo)，在相應(yīng)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)上取樣，用液氮快速凍結(jié)，放入-80 ℃冷凍待測(cè)。

1.3.2 pH值測(cè)定

剔除樣品可見(jiàn)脂肪與結(jié)締組織，使用便攜式pH計(jì)測(cè)定成熟期間肌肉pH值。

1.3.3 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定

細(xì)胞凋亡率采用TUNEL凋亡試劑盒進(jìn)行測(cè)定。將樣品處理為1 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉塊，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，石蠟包埋、切片（厚度約為5 μm）、脫蠟，用體積分?jǐn)?shù)3%過(guò)氧化氫溶液封閉。隨后將切片浸入1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗3 次，每次5 min。每個(gè)樣本上滴加100 μL蛋白酶K工作液，37 ℃反應(yīng)30 min；切片再次浸入1×PBS漂洗3 次，每次5 min；切片周圍用吸水紙吸干，每個(gè)切片上滴加50 μL末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)液，37 ℃避光反應(yīng)1 h，反應(yīng)后的切片浸入1×PBS漂洗3 次，每次5 min，注意避光；將切片放入Streptavidin-FITC標(biāo)記工作液中，37 ℃避光反應(yīng)30 min；然后將切片放入過(guò)氧化物酶-conjugated Anti-FITC工作液中，37 ℃避光反應(yīng)30 min，與二氨基聯(lián)苯中避光顯色10 min。顯色后的樣本切片浸入1×PBS漂洗3 次，每次5 min，注意避光，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。

1.3.4 細(xì)胞凋亡酶活力的測(cè)定

按照Caspase-3和Caspase-9活力檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定Caspase-3和Caspase-9活力。Caspase-3和Caspase-9活力以熒光強(qiáng)度來(lái)表示。

1.3.5 線粒體的提取

線粒體的提取參照趙亞亞[11]的方法并稍作修改。取灘羊背最長(zhǎng)肌2 g肉樣，剪碎后置于20 mL線粒體分離介質(zhì)中，用低溫研磨儀勻漿（10 000×g、2 min），勻漿液離心（4 ℃、1 000×g、10 min）而后取上清液進(jìn)一步離心（4 ℃、1 000×g、10 min），后取上清液再離心（4 ℃、8 000×g、20 min），棄上清液所得沉淀即為線粒體，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.6 Cyt-c氧化還原狀態(tài)的測(cè)定

Cyt-c氧化還原狀態(tài)的測(cè)定參照Borutaite等[12]的方法并稍作修改。取2 g灘羊肌肉加入8 mL預(yù)冷的提取緩沖液（300 mmol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸、0.5%牛血清白蛋白，pH 7.4）進(jìn)行勻漿。勻漿液于低溫研磨儀10 000×g勻漿2 min，取上清液于10 000×g離心2 min，上清液再次于8 000×g離心15 min。最終得到的上清液采用雙縮脲法測(cè)定胞漿Cyt-c質(zhì)量濃度。上清液分別于550 nm和535 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。Cyt-c還原狀態(tài)水平以550 nm波長(zhǎng)處吸光度與535 nm吸光度之差與Cyt-c質(zhì)量的比值表示。

1.3.7 ATP含量的測(cè)定

按照ATP含量檢測(cè)試劑盒的要求測(cè)定ATP含量。

1.3.8 線粒體標(biāo)志酶活力的測(cè)定

按照SDH、CS檢測(cè)試劑盒的要求測(cè)定SDH、CS活力。

1.3.9 Bcl-2家族蛋白表達(dá)量的測(cè)定

凋亡關(guān)鍵因子Bax、Bcl-2表達(dá)量按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

1.3.10 Western blot樣品的提取

參照Philchenkov[13]的方法提取Western blot樣品。取宰后肉樣各1 g，加入2 mL分離緩沖液（0.225 mol/L甘露醇、0.075 mol/L蔗糖、0.2%牛血清白蛋白、1 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 7.5），用玻璃勻裝器勻漿，1 000×g離心10 min取上清液，然后14 000×g離心10 min取上清液，最后10 000×g離心15 min，上清液即為全蛋白提取物，用于測(cè)定蛋白表達(dá)。

1.3.11 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blot分析

參考孫志昶[14]的方法進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠和濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12%和5%。將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜上，隨后用5%的脫脂奶粉TTBS溶液于25 ℃封閉1 h，用TTBS溶液漂洗，再與用含5%脫脂奶的TTBS溶液以500 倍稀釋的Cyt-c、Caspase-3和GAPDH抗體4 ℃反應(yīng)過(guò)夜。TTBS溶液洗去多余抗體后與相對(duì)應(yīng)的二抗在25 ℃條件下孵育1 h，TTBS浸洗后采用DBA試劑盒顯色。

使用掃描儀獲取圖像，然后用ImageJ分析軟件進(jìn)行定量分析，計(jì)算出目的條帶的光密度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，采用SPSS Statistics 26軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 宰后成熟過(guò)程中pH值變化

宰后肌肉pH值的下降會(huì)造成內(nèi)環(huán)境的酸化，從而影響肌肉保水性，是衡量宰后初期肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[15]。從圖1可以得出，宰后0～72 h內(nèi)，對(duì)照組的pH值顯著下降了5%（P＜0.05）；12～24 h內(nèi)對(duì)照組pH值顯著高于LPS處理組（P＜0.05）。LPS處理組在0～24 h內(nèi)呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），并在24 h達(dá)到極限pH值，隨后開(kāi)始上升。Tao Yingmei[16]及姬琛[17]等的研究表明宰后成熟期間灘羊pH值變化范圍為5.4～6.3，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果符合這一規(guī)律。

圖1 灘羊宰后成熟過(guò)程中pH值的變化Fig.1 Changes of pH during postmortem aging of Tan sheep meat

2.2 宰后成熟過(guò)程中細(xì)胞凋亡率的變化

由圖2可知，綠色熒光的細(xì)胞核為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核。隨著宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)量呈現(xiàn)增多的趨勢(shì)，且同一成熟時(shí)間LPS處理組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)量多于對(duì)照組。可見(jiàn)LPS會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如圖3所示，宰后成熟過(guò)程中，細(xì)胞凋亡率整體呈顯著上升的趨勢(shì)（P＜0.05）；0～72 h，對(duì)照組和LPS處理組細(xì)胞凋亡率分別上升至31.70%和42.47%；成熟期間對(duì)照組細(xì)胞凋亡率均顯著低于LPS處理組（P＜0.05），表明LPS處理灘羊促進(jìn)了細(xì)胞凋亡進(jìn)程，對(duì)細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用。

圖2 LPS處理對(duì)宰后灘羊肉成熟過(guò)程中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核染色免疫熒光圖Fig.2 Effect of LPS on immunofluorescence image of TUNEL-positive cell nuclei in Tan sheep meat during postmortem aging

圖3 宰后灘羊肉成熟過(guò)程中細(xì)胞凋亡率的變化Fig.3 Changes in cell apoptosis rate during postmortem aging of Tan sheep meat

2.3 宰后成熟過(guò)程中細(xì)胞凋亡酶活力的變化

線粒體凋亡通路中，Caspae-9和Caspae-3作為重要的效應(yīng)酶，與凋亡的發(fā)生密切相關(guān)。由圖4A可知，LPS處理組Caspase-9活力在0～12 h顯著上升并達(dá)到最大值1.413，隨后顯著下降（P＜0.05）；6～12 h內(nèi)對(duì)照組Caspase-9活力顯著上升并在12 h達(dá)到最大值1.306；0～72 h，LPS處理組Caspase-9活力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。如圖4B所示，對(duì)照組Caspase-3活力在宰后成熟過(guò)程中顯著上升（P＜0.05），并于24 h達(dá)到最大值，隨后呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05）；0～72 h內(nèi)，LPS處理組Caspase-3活力呈先升后降趨勢(shì)，并于24 h達(dá)到最大值；0～72 h內(nèi)，LPS處理組Caspase-3活力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖4 宰后灘羊肉成熟過(guò)程中Caspase-9（A）和Caspase-3（B）活力變化Fig.4 Changes in Caspase-9 (A) and Caspase-3 (B) activities during postmortem aging of Tan sheep meat

2.4 宰后成熟過(guò)程中Cyt-c的氧化還原狀態(tài)的變化

研究表明Cyt-c的氧化還原狀態(tài)對(duì)于細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)具有重要影響。只有氧化型Cyt-c能夠激活Caspase，還原型Cyt-c沒(méi)有啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的作用[18]。圖5反映了宰后灘羊肉成熟過(guò)程中Cyt-c氧化還原狀態(tài)變化，宰后0～72 h，對(duì)照組和LPS處理組中Cyt-c還原水平顯著降低（P＜0.05）。LPS處理組的下降速度較對(duì)照組更快。Cyt-c還原水平的下降表明Cyt-c氧化水平升高，由此介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。

圖5 宰后灘羊肉成熟過(guò)程中Cyt-c還原水平的變化Fig.5 Changes in cytochrome c reduction level during postmortem aging of Tan sheep meat

2.5 宰后成熟過(guò)程中線粒體ATP含量的變化

灘羊宰后細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變，阻斷了氧氣進(jìn)入，缺氧使線粒體的氧化還原電位降低，造成呼吸鏈功能紊亂，ATP不能正常合成，磷酸原體系中的肌酸磷酸也會(huì)在很短的時(shí)間內(nèi)被耗盡，無(wú)氧酵解途徑開(kāi)啟，最終產(chǎn)生大量的乳酸[19]。由圖6可知，線粒體ATP含量在宰后成熟過(guò)程中整體呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)（P＜0.05）；0～72 h內(nèi)，對(duì)照組ATP含量顯著降低了47.34%，LPS處理組的ATP含量顯著下降了56.02%，LPS處理組ATP含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），這可能是LPS加快了細(xì)胞從有氧呼吸向無(wú)氧糖酵解的進(jìn)程。

圖6 宰后灘羊肉成熟過(guò)程中ATP含量的變化Fig.6 Changes in mitochondrial ATP content during postmortem aging of Tan sheep meat

2.6 宰后成熟過(guò)程中線粒體標(biāo)志酶活力的變化

SDH和CS作為線粒體的標(biāo)志酶，均與能量代謝相關(guān)。SDH作為連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可為呼吸鏈提供電子，是參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，SDH活力可以有效反映線粒體的功能[20]。CS作為三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵調(diào)控酶，其活性及變構(gòu)效應(yīng)受到ATP的抑制[21]。由圖7A可知，成熟早期（0～6 h），LPS處理組SDH活力均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05）；隨后6～72 h呈顯著下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)長(zhǎng)PS處理加劇了線粒體能量的消耗，從而引起SDH活力短暫升高。如圖7B所示，LPS處理組CS活力在0～6、12～72 h內(nèi)呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），6～12 h內(nèi)呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05）；對(duì)照組CS活力在0～12、24～72 h內(nèi)呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），12～24 h顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05）。

圖7 宰后灘羊肉成熟過(guò)程中SDH活力（A）和CS活力（B）的變化Fig.7 Changes in SDH activity (A) and CS activity (B) during postmortem aging of Tan sheep meat

2.7 宰后成熟過(guò)程中Bcl-2家族蛋白水平的變化

Bax和Bcl-2都屬于Bcl-2蛋白家族，通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜通透性參與線粒體凋亡途徑并發(fā)揮關(guān)鍵作用[22]。成熟期間Bax水平的變化如圖8A所示，在宰后成熟過(guò)程中，Bax水平整體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，6 h為最高值。這與Ma Jibing等[23]在牛肉宰后成熟期間觀察到Bax的水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)結(jié)果一致。成熟期間Bcl-2水平的變化如圖8B所示，在宰后成熟期間Bcl-2水平整體呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)（P＜0.05）；其中LPS處理組水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），劉暢[24]的研究也表明蒙古羊宰后成熟過(guò)程中Bcl-2水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖8 宰后灘羊肉成熟過(guò)程中Bax（A）和Bcl-2（B）水平的變化Fig.8 Changes in Bax (A) and Bcl-2 (B) levels during postmortem aging of Tan sheep meat

Bcl-2家族蛋白是線粒體凋亡途徑的主要調(diào)控者，Bax和Bcl-2含量的比值（Bax/Bcl-2）可用來(lái)評(píng)估LPS其對(duì)誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的作用。目前普遍認(rèn)為，高Bax/Bcl-2表明促凋亡能力更強(qiáng)，低Bax/Bcl-2表明抗凋亡能力更強(qiáng)[23,25]。如圖9所示，在宰后成熟過(guò)程中，LPS處理組的Bax/Bcl-2顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。綜上說(shuō)明，LPS可以調(diào)控Bcl-2家族蛋白含量，誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。

圖9 宰后灘羊肉成熟過(guò)程中Bax/Bcl-2的變化Fig.9 Changes in Bax/Bcl-2 ratio during postmortem aging of Tan sheep meat

2.8 宰后成熟過(guò)程中線粒體信號(hào)通路關(guān)鍵因子釋放的情況

由圖10、11可知，在宰后成熟過(guò)程中，LPS處理組的胞漿Cyt-c表達(dá)量在宰后12 h顯著升高，24～72 h內(nèi)LPS處理組胞漿Cyt-c表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。這是由于宰后前期Cyt-c大量釋放，而隨著線粒體損傷的加重，Cyt-c的合成量不斷減少，且一部分Cyt-c與Apaf-1結(jié)合，最終導(dǎo)致Cyt-c含量在宰后24 h后逐漸減少[26]。

圖10 宰后灘羊肉成熟過(guò)程中Cyt-c的免疫印跡表達(dá)Fig.10 Changes in protein expression of Cyt-c during postmortem aging of Tan sheep meat

圖11 宰后灘羊肉成熟過(guò)程中Cyt-c的表達(dá)Fig.11 Changes in Cyt-c expression during postmortem aging of Tan sheep meat

Caspase-3可以切割細(xì)胞骨架蛋白，它的激活標(biāo)志著細(xì)胞凋亡的發(fā)生[27]。孫志昶[14]研究發(fā)現(xiàn)牦牛宰后成熟過(guò)程中確實(shí)存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9均發(fā)生活化。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了Caspase-3活化蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以分析LPS處理對(duì)宰后細(xì)胞凋亡的影響。Caspase-3酶原本身并沒(méi)有誘導(dǎo)凋亡的活性，只有裂解為17～20 kDa的活化片段才能參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖12為不同處理組分別成熟0、6、12、24、72 h后Caspase-3的免疫印跡圖譜，可以看出，經(jīng)過(guò)LPS處理后，灘羊肉骨骼肌中Caspase-3活化片段的灰度均高于對(duì)照組。這說(shuō)明在凋亡誘導(dǎo)劑LPS處理加快了Caspase-3酶原被激活并降解成活性片段的速度，故LPS是通過(guò)加速Caspase-3酶原的激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡。對(duì)活化片段進(jìn)行光密度值的定量分析，結(jié)果如圖13所示。LPS處理組的Caspase-3活化片段蛋白相對(duì)含量始終高于對(duì)照組，表明LPS處理組灘羊肉中Caspase-3裂解成活性片段的程度強(qiáng)于對(duì)照組，因此，LPS處理有利于加速宰后Caspase-3的激活。

3 討論

細(xì)胞凋亡過(guò)程中DNA會(huì)發(fā)生降解形成碎片化，從而產(chǎn)生大量的黏性3’-OH末端，可通過(guò)TUNEL熒光標(biāo)記，觀察綠色熒光變化，以此了解細(xì)胞凋亡情況[28]。本研究中，通過(guò)觀察TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)量以及計(jì)算細(xì)胞凋亡率得出，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在同一成熟時(shí)間內(nèi)LPS處理會(huì)加快細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。Cyt-c介導(dǎo)細(xì)胞凋亡通常伴隨著線粒體損傷[29]。研究發(fā)現(xiàn)Cyt-c氧化還原狀態(tài)與細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，宰后0～72 h，隨著宰后時(shí)間的延長(zhǎng)，Cyt-c還原水平逐漸降低，氧化水平逐漸升高，表明Cyt-c釋放介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生在宰后早期。Cyt-c在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮核心作用[30]。Caspase-9活力整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這可能是由于宰后前期LPS處理影響Cyt-c氧化還原的活性，氧化型Cyt-c含量增多，從而介導(dǎo)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)不斷放大，致使Caspase-9的活力上升。以上研究說(shuō)明，LPS通過(guò)促進(jìn)氧化型Cyt-c形成凋亡小體的作用，間接促進(jìn)Caspase-9和Caspase-3的激活。Caspase-9的活化早于Caspase-3發(fā)生。即Caspase-9作為線粒體凋亡通路中凋亡啟動(dòng)酶，能啟動(dòng)下游的效應(yīng)酶Caspase-3，進(jìn)而引起線粒體通路細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

本研究中LPS處理組肌肉pH值隨成熟時(shí)間延長(zhǎng)先下降后上升，并在24 h達(dá)到極限pH值，這可能是宰后內(nèi)環(huán)境改變切斷了與外界的聯(lián)系，有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒馍扇樗崴?。宰后ATP含量整體顯著下降，這是因?yàn)樵缀笱鯕獾淖钄鄬?dǎo)致線粒體中氧化還原電位下降，呼吸電子傳遞鏈發(fā)生功能障礙，不能正常地通過(guò)三羧酸循環(huán)合成ATP，細(xì)胞由有氧呼吸途徑進(jìn)入無(wú)氧酵解途徑，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP的生成量迅速降低[31-32]。這一能量變化的過(guò)程會(huì)影響線粒體標(biāo)志酶——SDH和CS的活性，本研究發(fā)現(xiàn)宰后成熟早期處理組SDH活力高于對(duì)照組，CS活力在0～12 h隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。宰后成熟過(guò)程中Bax含量整體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，Bcl-2含量整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。Bax和Bcl-2分別是促凋亡和抗凋亡蛋白，研究發(fā)現(xiàn)在凋亡條件下，Bax激活后在線粒體外膜積累，并發(fā)生寡聚化，從而導(dǎo)致促凋亡因子如Cyt-c的釋放[33]。Bax/Bcl-2可用來(lái)評(píng)估凋亡發(fā)生的程度，本研究結(jié)果表明，Bax/Bcl-2呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且LPS處理組顯著高于對(duì)照組。通過(guò)對(duì)Cyt-c和Caspase-3活化蛋白表達(dá)量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)LPS處理加快了Cyt-c的釋放和Caspase-3活化，對(duì)凋亡進(jìn)程起到促進(jìn)作用。

綜上，宰后成熟過(guò)程中LPS 誘導(dǎo)劑是通過(guò)激活Caspase-9和Caspase-3活性、降低細(xì)胞能量代謝水平進(jìn)而影響SDH和CS的活性，促使Cyt-c釋放，提高Bax/Bcl-2比值，從而誘導(dǎo)細(xì)胞通過(guò)線粒體信號(hào)通路發(fā)生凋亡。