基于無定形沸石-咪唑框架-8材料固定米根霉源脂肪酶研究

蘆瑜涵, 張成楠,*, 李秀婷,2, 徐友強(qiáng), 李微微

(1.北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院/北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心, 北京 100048;2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心, 北京 100048)

脂肪酶(triacylglycerol acyl hydrolases,EC 3.1.1.3)是一類絲氨酸水解酶,在微水和非水相中能夠催化酯化、轉(zhuǎn)酯、酯解等多種反應(yīng)[1-2],被認(rèn)為是目前生物領(lǐng)域中最為重要的工業(yè)酶之一[3],在食品和飼料等領(lǐng)域具有較大的商業(yè)價(jià)值[4]。米根霉源脂肪酶(Rhizopusoryzaelipase,ROL)作為常用的商業(yè)酶之一,能夠改變甘油骨架連接的脂肪酸類型,在油脂加工、風(fēng)味酯類物質(zhì)合成和天然等同酯香料制備方面具有重要的應(yīng)用[5-8]。然而,游離的ROL存在化學(xué)穩(wěn)定性差、回收困難和無法連續(xù)化操作等問題[9-10],限制了其在工業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用。尋找提升ROL穩(wěn)定性及可重復(fù)利用率,同時(shí)在最大程度上保持其催化活性的方法,一直是研究者面對(duì)的艱巨任務(wù)與挑戰(zhàn)[11]。

固定化酶技術(shù)是解決生物酶穩(wěn)定性差、回收困難等問題的有效方法之一[12-14]。目前,研究人員已成功將ROL固定在 NKA-9樹脂、HPMC-PVA膜、磁性納米顆粒、苯乙烯-二乙烯基苯等多種基質(zhì)上[10, 15-17]。盡管基于這些載體制備的固定化ROL展現(xiàn)了穩(wěn)定性提高及可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn),但由于其大多采用吸附法制備,載體對(duì)酶分子的束縛較弱,在一定條件下容易出現(xiàn)酶滲漏、浸出等問題[11]。沸石-咪唑框架-8(zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8)是以Zn2+和咪唑連接體通過配位鍵自組裝形成的一種金屬有機(jī)骨架材料[18-19]。ZIF-8材料具有較大的比表面積、可調(diào)控的孔道尺寸及較強(qiáng)的化學(xué)和熱穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn),在酶固定化領(lǐng)域備受關(guān)注[20-21]。以ZIF-8材料為載體制備固定化酶的方法主要包括吸附法、共價(jià)交聯(lián)法、孔隙封裝法和原位自封裝法[11,18]。原位自封裝法是將酶加入ZIF-8材料的前驅(qū)體溶液中,在自組裝形成ZIF-8材料的同時(shí),直接把酶固定在ZIF-8內(nèi)部[18]。與吸附法制備的固定化酶相比,原位自封裝法制備的固定化酶減少了酶滲漏、浸出等問題,其穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性提高。目前,基于ZIF-8材料利用原位自封裝法已實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)堿桿菌源脂肪酶、黑曲霉源脂肪酶和皺褶假絲酵母源脂肪酶的固定化[22-24]。

盡管基于ZIF-8材料采用原位自封裝法制備的固定化脂肪酶已展現(xiàn)了較好的應(yīng)用前景,但是由于ZIF-8材料較小的孔徑,酶的底物或產(chǎn)物在進(jìn)出ZIF-8材料孔隙時(shí)會(huì)產(chǎn)生較大的傳質(zhì)阻力,降低固定化酶的催化效率[22-25]。為了解決該問題,研究人員開發(fā)了多種具有更大孔徑的ZIF-8材料。Feng 等[26]在無水甲醇體系下合成了具有微孔(孔徑<2 nm)和介孔(孔徑為2～50 nm)的多級(jí)孔ZIF-8材料,并基于此材料利用原位自封裝法制備了包含細(xì)胞色素C和葡萄糖氧化酶的多酶催化納米反應(yīng)器。然而,由于ROL的甲醇耐受性較差,在固定化過程中ROL可能發(fā)生變性失活[27]。Cui等[28]研究發(fā)現(xiàn),在一定的前驅(qū)體初始物質(zhì)的量比例條件下可以制備出具有介孔的十字花形狀 ZIF-8材料,利用此材料原位封裝過氧化氫酶制備的固定化酶活性,比采用傳統(tǒng)ZIF-8材料制備的固定化酶活性提高了4倍。Wu等[29]通過缺陷法制備出具有微孔及介孔的多級(jí)孔ZIF-8材料,應(yīng)用該材料通過原位自封裝法制備了固定化葡萄糖氧化酶,其顯示出比基于僅具有微孔的ZIF-8材料制備的固定化酶高5～20倍的表觀活性。采用多級(jí)孔ZIF-8材料固定化酶不僅提高了酶的穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性,而且保持甚至提高了酶的催化活性。

在原位自封裝過程中,酶分子表面的電荷分布、酶分子與ZIF-8材料間形成的氫鍵、疏水相互作用等顯著影響ZIF-8材料的成核、生長及組裝,進(jìn)而影響固定化酶的形貌及催化活性[11, 28, 30]。Liang等[19]基于ZIF-8材料采用原位自封裝法固定脂肪酶、尿素酶、葡萄糖脫氫酶等不同酶時(shí)發(fā)現(xiàn),固定化酶因酶的結(jié)構(gòu)差異呈現(xiàn)不同的形貌特征。Chen等[31]比較了利用ZIF-8材料原位自封裝葡萄糖氧化酶、細(xì)胞色素C、辣根過氧化物酶、過氧化氫酶、尿酸氧化酶和乙醇脫氫酶制備的固定化酶的催化性能,發(fā)現(xiàn)酶的表面凈電荷對(duì)固定化酶的固載率和酶活力具有較大影響。目前,利用多級(jí)孔ZIF-8材料采用原位自封裝法固定ROL的效果仍不清楚。本研究擬通過調(diào)節(jié)前驅(qū)體初始物質(zhì)的量的比例,制備無定形ZIF-8(aZIF-8)材料,希望獲得一種具有更大孔徑的aZIF-8材料。采用原位自封裝法固定米根霉源脂肪酶,制備固定化脂肪酶ROL@aZIF-8, 研究ZIF-8、aZIF-8、ROL@aZIF-8及采用ZIF-8材料固定化ROL(ROL@ZIF-8)的形貌及結(jié)構(gòu)差異,比較游離ROL與ROL@aZIF-8的熱穩(wěn)定性、酸堿耐受性、貯存穩(wěn)定性及對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)和鄰苯二甲酸二異丁酯(diisobutyl phthalate,DIBP)的水解能力,以期為基于多級(jí)孔ZIF-8材料制備固定化脂肪酶提供更多的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ROL、2-甲基咪唑、醋酸鋅、異丙醇和對(duì)硝基苯酚丁酸酯(p-nitrophenyl butyrate,p-NPB),美國Sigma-Aldrich公司;乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic Acid,EDTA),西隴科學(xué)股份有限公司;DBP和DIBP,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CR 22N型多用途冷凍離心機(jī)、jsm7610f型掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy,SEM)、Jem2100p型透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)、掃描透射電鏡-能量色散X射線光譜儀(scanning transmission electron microscopy-energy dispersive X-ray spectrometry,STEM-EDX),日本日立公司;Free zone 4.5 plus型真空冷凍干燥機(jī),美國Labconco公司;Nicolet IS50型傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR),賽默飛世爾科技有限公司;D8advance 型X-射線衍射儀(X-ray diffraction,XRD),布魯克公司;N2吸附解吸儀,美國康塔公司;Theta Flex型水接觸角儀,瑞典百歐林公司;電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(inductively coupled plasma optical emission spectrometer,ICP-OES)、7890B型氣相色譜儀,美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1aZIF-8、ROL@aZIF-8、ZIF-8及ROL@ZIF-8的制備

1.3.1.1 aZIF-8及ROL@aZIF-8的制備

參考Wu等[29]的方法并適當(dāng)修改。將1 mL 20 mmol/L的醋酸鋅溶液逐滴加至1 mL 33.8 mmol/L的2-甲基咪唑溶液中,立刻加入80 μL、 5 mg/mL的ROL溶液,在300 r/min下反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后用去離子水洗滌沉淀物3次,收集沉淀,冷凍干燥12 h,得到ROL@aZIF-8。在相同條件下不添加ROL溶液制備aZIF-8材料。

1.3.1.2 ZIF-8及ROL@ZIF-8的制備

參考梁鑫等[24]的方法并適當(dāng)修改。將20 mL 1 mol/L的2-甲基咪唑溶液與80 mg的ROL混合均勻,加入2 mL 0.5 mol/L的醋酸鋅溶液,在300 r/min下反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后用去離子水洗滌沉淀物3次,收集沉淀,冷凍干燥12 h,得到ROL@ZIF-8。在相同條件下不添加ROL溶液制備ZIF-8材料。

1.3.2aZIF-8、ROL@aZIF-8、ZIF-8及ROL@ZIF-8的形貌及結(jié)構(gòu)觀察

取一定量的aZIF-8、ROL@aZIF-8、ZIF-8以及ROL@ZIF-8樣品,研磨至均勻粉末。采用XRD、SEM和TEM觀察樣品形貌和晶體結(jié)構(gòu);采用FT-IR、STEM-EDX及ICP-OES分析樣品中元素組成、分布及比例;采用N2吸附解吸儀測(cè)定溫度為77 K時(shí)樣品的N2吸附解吸等溫線,計(jì)算Brunauer-Emmett-Teller (BET)面積、孔徑分布和孔隙體積;采用水接觸角儀分析樣品的親疏水性。

1.3.3ROL和ROL@aZIF-8酶活力的測(cè)定

ROL和ROL@aZIF-8酶活力的測(cè)定方法參考Qi等[32]的方法并稍加修改。將一定量的ROL和ROL@aZIF-8加入pH值為7.5的1 mL 0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液中,與1 mL 2 mg/mL溶于異丙醇中的p-NPB溶液混勻后,在室溫條件下反應(yīng)5 min。反應(yīng)結(jié)束后,加入1 mL終止液(40 g NaOH和93.5 g EDTA溶于1 L去離子水中)終止反應(yīng),在4 ℃條件下離心收集上清液,在405 nm波長處測(cè)定吸光值。酶活力單位定義為:每分鐘釋放1 μmol對(duì)硝基苯酚(p-nitrophenol,p-NP)所需的ROL和ROL@aZIF-8的質(zhì)量,以U/mg表示。

1.3.4不同質(zhì)量濃度的ROL與ROL@aZIF-8酶活力的測(cè)定

采用不同質(zhì)量濃度(3、4、5、6、7 mg/mL)的ROL溶液分別制備ROL@aZIF-8,分析ROL@aZIF-8與相同質(zhì)量濃度ROL的酶活力。

1.3.5不同條件下ROL與ROL@aZIF-8酶活力的測(cè)定

1.3.5.1 不同pH值條件下ROL與ROL@aZIF-8酶活力的測(cè)定

將ROL以及ROL@aZIF-8置于不同pH 值(7.5、8、9、10)的 0.01 mol/L PBS 緩沖液中,在室溫下保溫60 min,測(cè)定其酶活力。

1.3.5.2 不同溫度條件下ROL與ROL@aZIF-8酶活力的測(cè)定

將ROL以及ROL@aZIF-8置于pH值為7.5的0.01 mol/L PBS緩沖液中,在不同溫度(30、40、50、60、70 ℃)下保溫60 min,測(cè)定其酶活力。

1.3.5.3 不同儲(chǔ)藏時(shí)間條件下ROL與ROL@aZIF-8酶活力的測(cè)定

將ROL以及ROL@aZIF-8置于pH值為7.5的0.01 mol/L PBS緩沖液中,在4 ℃下儲(chǔ)藏不同時(shí)間 (0、2、4、6、8、10、15、20、25 d),測(cè)定其酶活力。

1.3.6ROL 及ROL@aZIF-8水解DBP和DIBP能力的測(cè)定

以pH值為7.4的0.05 mol/L Tris-HCl 溶液為緩沖體系,將0.78 mL Tris-HCl 緩沖液、200 μL 50 mg/mL的ROL溶液或50 mg ROL@aZIF-8,以及20 μL 10 g/L的DBP和DIBP混合溶液充分混合,在150 r/min、37 ℃條件下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后,使用正己烷(含內(nèi)標(biāo)油酸乙酯)萃取,進(jìn)行氣相色譜分析。分析條件:安捷倫HP-INNO WAX色譜柱,80 ℃保持 3 min,以 20 ℃/min 的速率升至 250 ℃,保持22.5 min。以未加入ROL溶液或ROL@aZIF-8的催化反應(yīng)體系中的 DBP和DIBP殘余量為100%,計(jì)算ROL以及ROL@aZIF-8對(duì)DBP和DIBP的分解率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS 25統(tǒng)計(jì)軟件經(jīng)單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)比較,P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZIF-8、aZIF-8、ROL@ZIF-8和ROL@aZIF-8的形貌比較

在原位自封裝過程中,前驅(qū)體的初始物質(zhì)的量比例不同,會(huì)形成具有不同形貌及結(jié)構(gòu)的ZIF-8材料[28-29]。在本研究中,ZIF-8材料是在2-甲基咪唑和醋酸鋅(前驅(qū)體)初始物質(zhì)的量比例為20∶1的條件下制備獲得,而aZIF-8材料是在2-甲基咪唑和醋酸鋅初始物質(zhì)的量比例為1.69∶1.00的條件下制備獲得。ROL@ZIF-8和ROL@aZIF-8分別是在ZIF-8和aZIF-8材料組裝過程中加入ROL制備獲得。對(duì)ZIF-8、ROL@ZIF-8、aZIF-8和ROL@aZIF-8進(jìn)行了晶體結(jié)構(gòu)和形貌分析,分析結(jié)果見圖1至圖3。由圖1可見,ZIF-8材料和ROL@ZIF-8在2θ為7.40°、10.41°、12.78°、14.74°、16.50°和18.07°處出現(xiàn)強(qiáng)峰,其衍射峰分布規(guī)律與基于理論數(shù)據(jù)模擬的ZIF-8材料一致,且相對(duì)強(qiáng)度相似[33-34];而aZIF-8材料和ROL@aZIF-8在2θ為11.05°、12.14°、17.25°和18.43°處出現(xiàn)強(qiáng)峰,這與ZIF-8材料和ROL@ZIF-8衍射峰分布規(guī)律具有明顯差異,表明相較于ZIF-8材料和ROL@ZIF-8,aZIF-8材料和ROL@aZIF-8的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變[35]。由圖2(a)和(c)可見,ZIF-8材料呈現(xiàn)出規(guī)則的多面體形貌,而aZIF-8材料呈現(xiàn)出包含十字花形、正方形、球形等多種形態(tài)的無定形形貌。微觀結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與形貌分析結(jié)果一致[圖3(a)和(c)]。研究發(fā)現(xiàn),在2-甲基咪唑和醋酸鋅的初始物質(zhì)的量比例為4∶1以及更高的條件下,ZIF-8材料呈現(xiàn)出規(guī)則的菱形十二面體結(jié)構(gòu),這與我們的研究結(jié)果相似[23, 29]。Cui等[28]研究發(fā)現(xiàn),在2-甲基咪唑和硝酸鋅的初始物質(zhì)的量比例為1.6∶1.0 的條件下,catalase@ZIF-8呈現(xiàn)十字花形的聚合物形貌,而在2-甲基咪唑和硝酸鋅的初始物質(zhì)的量比例為1.8∶1.0的條件下,catalase@ZIF-8呈現(xiàn)多面體形貌。這表明, aZIF-8材料的無定形形貌是因?yàn)樵谙鄬?duì)低的前驅(qū)體初始物質(zhì)的量比例條件下制備獲得的。

θ表示X射線的入射角度。圖1 ROL@aZIF-8、aZIF-8、ZIF-8、ROL@ZIF-8和模擬ZIF-8的XRD分析Fig.1 XRD analysis of ROL@aZIF-8, aZIF-8, ZIF-8,ROL@ZIF-8 and simulated ZIF-8

盡管ROL@ZIF-8也呈現(xiàn)出多面體形貌,但相較于ZIF-8材料,ROL@ZIF-8的邊界變得凹凸不平,并且面積有輕微的減小[圖2(b)、圖3(b)]。ROL@aZIF-8呈現(xiàn)出與aZIF-8材料相似的無定形形貌,但其形態(tài)更加多樣[圖2(d)、圖3(d)]。為了確證ROL@ZIF-8和ROL@aZIF-8中是否含有ROL,對(duì)ROL、ZIF-8、ROL@ZIF-8、aZIF-8和ROL@aZIF-8進(jìn)行了紅外光譜分析(圖4)。由圖4可見,ZIF-8、ROL@ZIF-8、aZIF-8和ROL@aZIF-8均在波數(shù)為560 cm-1和1 308 cm-1處出現(xiàn)特異吸收峰。位于560 cm-1處的吸收峰是Zn-N拉伸振動(dòng)產(chǎn)生的,而位于1 350～1 500 cm-1處的吸收峰是2-甲基咪唑振動(dòng)產(chǎn)生的。這些結(jié)果說明,ZIF-8、ROL@ZIF-8、aZIF-8和ROL@aZIF-8結(jié)構(gòu)中存在Zn2+與2-甲基咪唑[36-37]。ROL@ZIF-8和ROL@aZIF-8均在1 600～1 700 cm-1處出現(xiàn)蛋白質(zhì)酰胺鍵的特異吸收峰,而ZIF-8以及aZIF-8未觀察到相應(yīng)的吸收峰,表明ROL已成功固定在ZIF-8和aZIF-8材料上[35, 38-39]。這些結(jié)果表明,在固定化ROL后,與ZIF-8和aZIF-8材料相比,ROL@ZIF-8和ROL@aZIF-8的形貌發(fā)生了改變[19, 40-41]。

圖4 ROL、ROL@aZIF-8、aZIF-8、ZIF-8和ROL@ZIF-8的紅外光譜分析Fig.4 Infrared spectral analysis of ROL, ROL@aZIF-8, aZIF-8,ZIF-8 and ROL@ZIF-8

2.2 ZIF-8、aZIF-8、ROL@ZIF-8和ROL@aZIF-8的結(jié)構(gòu)比較

ZIF-8材料形貌的改變往往伴隨著其結(jié)構(gòu)的變化[28-29]。利用STEM-EDX及ICP-OES對(duì)ZIF-8、ROL@ZIF-8、aZIF-8和ROL@aZIF-8 中Zn和N元素分布及比例進(jìn)行了研究,分析結(jié)果見圖5和表1。由圖5可見,ZIF-8、ROL@ZIF-8、aZIF-8和ROL@aZIF-8中Zn和N元素分布均勻[40]。由表1可見,ZIF-8材料和ROL@ZIF-8中N與Zn的物質(zhì)的量比為4.58和4.35,而aZIF-8材料和ROL@aZIF-8中N與Zn的物質(zhì)的量比則降至1.53和1.94。這表明在ZIF-8材料和ROL@ZIF-8中,平均一個(gè)鋅離子與4.3～4.5個(gè)氮原子配位,而在aZIF-8材料和ROL@aZIF-8中,平均一個(gè)鋅離子與1.5～1.9個(gè)氮原子配位。Wu等[29]研究發(fā)現(xiàn),與僅具有微孔的ZIF-8材料相比,具有微孔及介孔的多級(jí)孔ZIF-8材料的N與Zn的物質(zhì)的量比例降低,這與本研究結(jié)果相似。當(dāng)鋅離子與相對(duì)較少的氮原子配位時(shí),ZIF-8材料會(huì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)缺陷,導(dǎo)致其孔徑變大甚至出現(xiàn)介孔[29]。為了探究ZIF-8、ROL@ZIF-8、aZIF-8和ROL@aZIF-8的孔徑大小,利用N2吸附法測(cè)定了其N2吸附-解吸等溫線、孔徑分布及比表面積,分析結(jié)果見圖6、圖7和表2。由圖6可見,隨相對(duì)壓力的增加,不同材料及固定化ROL的N2吸附量呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。通過與6種類型N2吸附-解吸等溫線的標(biāo)準(zhǔn)形狀比較發(fā)現(xiàn),ZIF-8材料和ROL@ZIF-8的N2吸附-解吸等溫線呈現(xiàn)出Ⅰ型吸附等溫線特征,表明ZIF-8材料和ROL@ZIF-8的微孔性質(zhì);而aZIF-8和ROL@aZIF-8的N2吸附-解吸等溫線呈現(xiàn)出Ⅱ型吸附等溫線特征,表明aZIF-8材料和ROL@aZIF-8存在微孔和介孔[42-43]。由圖7可見,ZIF-8材料和ROL@ZIF-8的孔徑分布在1～2 nm,表明ZIF-8材料和ROL@ZIF-8形成了微孔;而aZIF-8材料和ROL@aZIF-8的孔徑分布在1～20 nm,表明aZIF-8材料和ROL@aZIF-8中既存在微孔又存在介孔。由表2可見,相較于ZIF-8材料和ROL@ZIF-8,aZIF-8材料和ROL@aZIF-8的BET比表面積和孔隙體積均出現(xiàn)顯著減小,這可能是因?yàn)?在相對(duì)低的前驅(qū)體初始物質(zhì)的量比例條件下,aZIF-8材料出現(xiàn)結(jié)構(gòu)缺陷,造成BET比表面積減小和孔容下降[29]。本研究結(jié)果表明,通過調(diào)節(jié)前驅(qū)體的物質(zhì)的量比例制備得到的aZIF-8材料是一種具有微孔和介孔的多級(jí)孔材料。

表1 ZIF-8、aZIF-8、ROL@ZIF-8和ROL@aZIF-8中的N和Zn元素比例

表2 ZIF-8、aZIF-8、ROL@ZIF-8和ROL@aZIF-8的BET表面積和孔隙體積

黃色表示Zn元素的分布,紅色表示N元素的分布。圖5 ZIF-8、ROL@ZIF-8、aZIF-8和ROL@aZIF-8的STEM-EDX分析Fig.5 STEM-EDX analysis of ZIF-8,ROL@ZIF-8,aZIF-8 and ROL@aZIF-8

圖6 ROL@ZIF-8、ZIF-8、aZIF-8和ROL@aZIF-8的N2吸附-解吸等溫線Fig.6 N2 adsorption-desorption isotherm of ROL@ZIF-8,ZIF-8,aZIF-8 and ROL@aZIF-8

V表示孔容,D表示孔徑。圖7 ZIF-8、ROL@ZIF-8、aZIF-8和ROL@aZIF-8的孔徑分布Fig.7 Pore size distribution of ZIF-8,ROL@ZIF-8,aZIF-8 and ROL@aZIF-8

2.3 酶質(zhì)量濃度對(duì)ROL@aZIF-8酶活力的影響

為探究利用aZIF-8材料采用原位自封裝法固定ROL的效果,本研究比較了在不同ROL質(zhì)量濃度條件下制備的ROL@aZIF-8與相同質(zhì)量濃度的ROL的酶活力差異,分析結(jié)果見圖8。由圖8可見,當(dāng)ROL的質(zhì)量濃度從3 mg/mL增加到4 mg/mL時(shí),ROL@aZIF-8催化p-NPB水解的能力逐漸增強(qiáng);當(dāng)ROL的質(zhì)量濃度從4 mg/mL增加到7 mg/mL時(shí),ROL@aZIF-8的酶活力逐漸減弱。在ROL的質(zhì)量濃度為4 mg/mL的條件下制備的ROL@aZIF-8呈現(xiàn)最大酶活力,為5.69 U/mg。通過與文獻(xiàn)報(bào)道的固定化ROL的酶活力相比較,本研究中制備的ROL@aZIF-8的酶活力處于最高水平[10, 13, 15-17, 44-48]。在相同質(zhì)量濃度條件下,ROL@aZIF-8的酶活力比ROL高,表明利用aZIF-8材料采用原位自封裝法固定ROL可以增強(qiáng)酶的催化活性。

圖8 酶質(zhì)量濃度對(duì)ROL和ROL@aZIF-8酶活力的影響Fig.8 Effects of enzyme mass concentrations on enzymatic activities of ROL and ROL@aZIF-8

ROL@aZIF-8催化活性增強(qiáng)的效果可能與ROL“蓋子”結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化有關(guān)[49-51]。ROL具有由兩親性氨基酸組成的“蓋子”結(jié)構(gòu)[52]。“蓋子”結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特的打開-閉合構(gòu)象變化現(xiàn)象[52]。當(dāng)“蓋子”結(jié)構(gòu)處于閉合構(gòu)象時(shí),ROL的催化中心會(huì)被“蓋子”蓋住,阻止了底物進(jìn)入催化中心,表現(xiàn)為酶的催化活性較低;當(dāng)“蓋子”結(jié)構(gòu)處于打開構(gòu)象時(shí),底物和產(chǎn)物可以較容易地進(jìn)出催化中心,表現(xiàn)為酶的催化活性大幅提高[53-54]。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)使用疏水性的載體固定化脂肪酶時(shí),脂肪酶的“蓋子”結(jié)構(gòu)可以處于穩(wěn)定的打開構(gòu)象,固定化脂肪酶表現(xiàn)出較高的催化活性[53-56]。為探究ROL@aZIF-8催化活性增強(qiáng)效果的可能原因,本研究比較了ZIF-8、ROL@ZIF-8、aZIF-8和ROL@aZIF-8的親疏水性差異,分析結(jié)果見圖9。由圖9可見,ZIF-8材料和aZIF-8材料均具有較強(qiáng)的疏水性,aZIF-8材料的疏水性相較于ZIF-8材料減弱。這表明利用aZIF-8材料固定化ROL可能誘導(dǎo)ROL的“蓋子”結(jié)構(gòu)處于打開構(gòu)象,從而使ROL@aZIF-8的催化活性提高[49-50]。疏水性的載體可能在固定化過程中誘導(dǎo)酶的聚集,導(dǎo)致固定化酶催化活性的下降[57]。aZIF-8材料的疏水性相較于ZIF-8材料減弱可能有助于減少在固定化過程中ROL的聚集,促使固定化酶的催化活性保持甚至提高[57]。由圖9可知,ROL@ZIF-8和ROL@aZIF-8均呈現(xiàn)出親水性,這可能是由于在固定化ROL后,ROL增強(qiáng)了材料的親水性[29]。ROL@aZIF-8中因結(jié)構(gòu)缺陷形成的多級(jí)孔結(jié)構(gòu)可能造成部分的ROL暴露于固定化酶表面,導(dǎo)致ROL@aZIF-8的親水性相較于ROL@ZIF-8增強(qiáng),這也同時(shí)促使了底物更容易與ROL的催化活性中心結(jié)合[29]。本研究結(jié)果表明,aZIF-8材料的疏水性及多級(jí)孔特性對(duì)ROL@aZIF-8催化活性的增強(qiáng)有重要的促進(jìn)作用。

圖9 ZIF-8、ROL@ZIF-8、aZIF-8和ROL@aZIF-8的接觸角分析Fig.9 Contact angle analysis of ZIF-8,ROL@ZIF-8,aZIF-8 and ROL@aZIF-8

2.4 不同條件下ROL和ROL@aZIF-8酶活力的比較

2.4.1pH值對(duì)ROL和ROL@aZIF-8酶活力的影響

pH值對(duì)ROL和ROL@aZIF-8酶活力的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖10。由圖10可見,在pH值為7.5 ～ 10.0時(shí),固定化酶ROL@aZIF-8的酶活力均高于游離脂肪酶ROL,表明固定化酶比游離酶具有更好的堿耐受性。這可能是由于aZIF-8材料和ROL間通過疏水相互作用、范德華相互作用和氫鍵等創(chuàng)造了一個(gè)保護(hù)酶分子的微環(huán)境從而改善了酶的堿穩(wěn)定性[30, 39]。

圖10 pH值對(duì)ROL和ROL@aZIF-8酶活力的影響Fig.10 Effect of pH on enzymatic activities of ROL and ROL@aZIF-8

2.4.2溫度對(duì)ROL和ROL@aZIF-8酶活力的影響

溫度對(duì)ROL和ROL@aZIF-8酶活力的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11。由圖11可見,在30～70 ℃下保溫1 h后, ROL@aZIF-8比ROL具有更高的酶活力,這表明固定化酶比游離酶具有更好的溫度耐受性,這可能是因?yàn)閍ZIF-8材料對(duì)ROL產(chǎn)生的保護(hù)作用[28-29]。

圖11 溫度對(duì)ROL和ROL@aZIF-8酶活力的影響Fig.11 Effect of temperature on enzymatic activities of ROL and ROL@aZIF-8

2.4.3儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)ROL和ROL@aZIF-8酶活力的影響

儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)ROL和ROL@aZIF-8酶活力的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖12。由圖12可見,隨儲(chǔ)藏時(shí)間的延長, ROL@aZIF-8和ROL的酶活力均下降,但ROL@aZIF-8的酶活力降低幅度相較于ROL較小。在經(jīng)過25 d儲(chǔ)藏后,ROL@aZIF-8的酶活力降至其初始酶活力的30.5%,而ROL的酶活力降至其初始酶活力的20.4%,表明ROL@aZIF-8比ROL具有更好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的提高可能是因?yàn)閍ZIF-8材料包裹在ROL周圍,防止ROL水解和聚合以及環(huán)境對(duì)酶活性位點(diǎn)的破壞,從而使酶活力降低減緩[2, 51]。Cheng等[58]研究發(fā)現(xiàn),利用Cu-BTC金屬有機(jī)骨架材料采用原位自封裝法制備的固定化脂肪酶在經(jīng)過20d的儲(chǔ)藏后仍保持了97.1%的酶活力。Nadar等[23]研究發(fā)現(xiàn),利用ZIF-8材料采用原位自封裝法制備的固定化脂肪酶在經(jīng)過25 d的儲(chǔ)藏后酶活力降低了10%。與這些固定化脂肪酶相比,ROL@aZIF-8的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性較弱,原因可能是由于aZIF-8材料的結(jié)構(gòu)缺陷降低了ROL@aZIF-8在苛刻條件下的穩(wěn)定性[10]。

圖12 儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)ROL和ROL@aZIF-8酶活力的影響Fig.12 Effect of storage time on enzymatic activities of ROL and ROL@aZIF-8

2.5 ROL和ROL@aZIF-8對(duì)DBP和DIBP水解能力的比較

DBP和DIBP是塑化劑的典型代表,具有較強(qiáng)的生殖毒性,即使微量攝入也會(huì)造成脂質(zhì)代謝異常,誘發(fā)肥胖病,干擾免疫和過敏反應(yīng)等[59-60]。利用生物酶法水解DBP和DIBP具有條件溫和、效率高和不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)勢(shì)[59-60]。為了進(jìn)一步探究ROL@aZIF-8催化活性增強(qiáng)的效果,本研究比較了ROL和ROL@aZIF-8對(duì)DBP和DIBP的水解能力,分析結(jié)果見圖13。由圖13可見,ROL@aZIF-8催化DBP和DIBP水解2h后,DBP和DIBP的殘留量分別為83.7%和83.1%,而ROL催化水解2 h后,DBP和DIBP的殘留量分別90.8%和91.2%。這表明與ROL相比,ROL@aZIF-8對(duì)DBP和DIBP的水解能力有一定程度提高。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖13 ROL和ROL@aZIF-8對(duì)DBP和DIBP的水解能力分析Fig.13 Hydrolytic capacities analysis of ROL and ROL@aZIF-8 on DBP and DIBP

3 結(jié) 論

本研究通過調(diào)節(jié)2-甲基咪唑和醋酸鋅的初始物質(zhì)的量比例,制備了一種aZIF-8材料,采用原位自封裝法將ROL固定在aZIF-8材料中,制備出ROL@aZIF-8。研究結(jié)果表明,aZIF-8材料是一種具有微孔和介孔的多級(jí)孔材料。aZIF-8材料和ROL@aZIF-8均呈現(xiàn)出包含十字花形、正方形、球形等多種形態(tài)的無定形形貌。在ROL的質(zhì)量濃度為4 mg/mL的條件下制備的ROL@aZIF-8具有最大酶活力,為5.69 U/mg。在相同的ROL質(zhì)量濃度條件下,ROL@aZIF-8的酶活力比ROL高,其原因與aZIF-8材料的疏水性及多級(jí)孔特性密切相關(guān)。與ROL相比,ROL@aZIF-8具有更好的堿穩(wěn)定性、溫度耐受性、儲(chǔ)藏穩(wěn)定性以及對(duì)DBP和DIBP更高的水解能力。本研究旨在為基于多級(jí)孔ZIF-8材料制備固定化脂肪酶提供理論依據(jù)。